玛丽安娜·米科利斯 | 科琳娜·玛丽亚·苏泰亚 | 朱塞佩·纳特雷拉 | 米凯拉·皮亚·托塔罗 | 弗朗切斯科·卡波尼奥 | 特奥多拉·埃米利亚·科尔迪亚 | 安东内拉·帕斯夸洛内 | 卡米内·苏莫
巴里阿尔多·莫罗大学土壤、植物与食品科学系，阿门多拉街165/A号，70126，巴里，意大利
**摘要**
生物胺（BAs）是发酵过程中自然形成的含氮化合物，越来越多地被认为是发酵饮料中的新兴化学危害物质。精酿啤酒通常未经过滤和巴氏杀菌，为生物胺的形成提供了有利条件。本研究对市场上113种不同风格的精酿啤酒中的七种生物胺进行了全面评估，这些啤酒根据发酵方式分为底部发酵、顶部发酵、自然发酵和混合风格。此外，还研究了非常规原材料和酿造技术对生物胺含量的影响。结果显示，生物胺的总含量差异很大，范围从1.64毫克/升到280.08毫克/升不等。检测到的主要生物胺是酪胺，其次是色胺、腐胺和尸胺。底部发酵的啤酒中未检测到有害水平的酪胺，而在其他风格的啤酒中则检测到了较高浓度的酪胺。桶陈酿、瓶内二次发酵以及添加非常规成分会导致色胺、亚精胺尤其是酪胺的积累增加。值得注意的是，在98个样本中检测到的组胺含量超过了定量限，这引起了对组胺不耐受消费者的担忧。总体而言，10%的受调查啤酒对健康消费者可能产生负面影响，其总生物胺含量超过了50毫克/升。然而，35%的精酿啤酒总生物胺含量超过了20毫克/升，对生物胺解毒能力较低的消费者构成潜在健康风险。这些发现强调了优化卫生操作、谨慎选择原材料以及使用降解生物胺的发酵剂的必要性，以确保消费者安全的同时不损害产品品质。
**1. 引言**
啤酒是一种全球广泛消费的发酵酒精饮料[1]。近年来，由于消费者对使用当地原料和传统酿造技术制成的手工、非工业化产品的兴趣日益增加[2]，精酿啤酒的需求呈上升趋势[3]。预计到2029年，精酿啤酒市场将达到100.3亿升，复合年增长率（CAGR）为9%[4]。虽然全球对精酿啤酒的定义并不统一，但各国法律（如美国、意大利、加拿大）以及行业协会（美国和德国啤酒协会及英国独立啤酒协会）提供了相关定义[5]，这些定义包括以下特点：i) 微啤酒厂的生产条件可能与工业啤酒厂不同[6]，因为精酿啤酒厂经常添加非传统成分（如水果、香料、咖啡、巧克力等）[7]；ii) 微啤酒厂不采用标准化生产流程，导致啤酒风格多样[5]。此外，精酿啤酒生产过程中不进行巴氏杀菌和微滤[6][8]。因此，在精酿啤酒中，发酵剂和污染微生物可能导致感官缺陷及不良化合物（如生物胺）的出现[7][9]。生物胺是低分子量含氮化合物，由氨基酸的酶促脱羧作用以及植物、微生物和动物中的醛类和酮类的转氨作用或氨基作用生成[6]。它们通过正常代谢途径内源性产生，也可通过食品加工和储存过程中的微生物活动外源性产生[10]。内源性生物胺在人体内具有重要的生理作用，如调节血压、促进神经突触传递、影响过敏反应和支持细胞生长[10]。然而，高生物胺含量的食品可能导致消费者中毒[12][13]。通常情况下，肠道酶（如单胺氧化酶（MAO）、二胺氧化酶（DAO）和组氨酸甲基转移酶）可以解毒少量生物胺[6][11]，但在高摄入量下，解毒系统可能失效[6]，导致心血管疾病、头痛、呼吸不适、神经系统问题、类似过敏的反应、眩晕和腹痛等症状[7][12][13]。对于消费者而言，生物胺浓度在100毫克/千克或100毫克/升以下被认为是安全的[6]；但对于酒精饮料，推荐限值要低得多[14]，某些生物胺的限值甚至以毫克/升为单位，因为乙醇会降低氨基氧化酶的活性[14]。生物胺氧化效率低的原因还包括遗传因素、胃肠道疾病或某些药物（MAO抑制剂和DAO抑制剂）的抑制作用[15][16]。从监管角度来看，欧盟规定了鱼类的组胺限值（EC No. 2073/2005），但大多数地区尚未明确食品中其他特定生物胺的限值，导致监测标准存在差异[17]。Nalazek-Rudnicka等人[18]和Tang等人[19]报告称，啤酒中主要检测到的生物胺包括组胺、酪胺、腐胺、尸胺和苯乙胺。啤酒中生物胺的主要来源可能是传统使用的原材料（尤其是麦芽）和微生物群[9][20]。最近有研究探讨了不同小麦麦芽对这些化合物的影响[21]。此外，多位作者[6][22][23]发现酵母菌株、乳酸菌（LAB）数量和肠杆菌科细菌与生物胺积累之间存在正相关关系[24]。因此，食品中生物胺的形成和积累是一个复杂过程[17]，涉及三个因素：i) 原材料（pH值、化学成分等）；ii) 加工和储存条件（发酵、卫生和包装条件、储存温度和时间等）；iii) 微生物群（具有脱羧酶活性的菌株的存在[24]。由于短时间内大量饮用啤酒可能对健康产生不良影响[9][20][20]，因此收集精酿啤酒中这些化合物的含量数据非常重要，尽管其毒性阈值难以确定，因为它取决于个体差异、饮食组成和其他因素[25][26]。尽管已有大量关于食品（如鱼类和肉类）中生物胺的研究[27][28]，但针对精酿啤酒的研究仍有限，因此消费者的整体暴露风险尚不清楚。早期研究主要关注某些特定风格的精酿啤酒[23][29]，而本研究涵盖了更广泛的风格多样性，以反映当前的酿造实践，因为精酿啤酒通常在小型微啤酒厂生产，创新推动了新啤酒风格的发展[7][30]。在此背景下，以往关于生物胺的研究大多忽略了精酿啤酒生产中非常规成分的日益使用。为了个性化产品、改善感官特性并区别于工业啤酒的创新性和真实性[5][31]，微啤酒厂经常使用新型谷物混合物或重新发现古代谷物、新的啤酒花品种、替代酵母菌株，并加入水果、蔬菜和其他调味成分[3][5][30][31]，这些因素可能影响最终产品中的生物胺积累[3][32][33]。然而，关于这些非传统成分对最终产品中生物胺积累影响的认识仍存在显著空白。
因此，本研究的目的是评估精酿啤酒中的生物胺含量，以便：i) 为消费者和国际组织提供信息，为未来制定酒精饮料中这些化合物的法定限值提供依据；ii) 识别主要生物胺及其在不同风格精酿啤酒中的差异；iii) 评估非常规成分和加工过程对生物胺积累的影响，并提出可能的缓解策略。
**2. 材料与方法**
2.1. 材料、化学品和标准溶液
生物胺的分析标准品（纯度98%或更高）：色胺二盐酸盐-TRY、2-苯乙胺二盐酸盐-PHE、腐胺二盐酸盐-PUT、尸胺盐酸盐-CAD、组胺二盐酸盐-HIS、酪胺二盐酸盐-TYM、亚精胺-SPD购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）。内标1,7-二氨基庚烷（HEP，纯度98%）、丹磺酰氯（用作衍生化试剂）、氢氧化钠和碳酸氢钠由Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）提供。乙腈（ACN）HPLC级试剂购自Carlo Erba Reagents（意大利米兰）。丙酮和乙酸钠由VWR International S.r.l.（意大利米兰）提供。三氯乙酸（TCA）和氢氧化铵（33%）来自Honeywell（美国夏洛特）。Milli-Q®纯水由Merck（德国达姆施塔特）提供。尼龙过滤器（孔径0.45 μm）和塑料注射器购自Chemic ALS s.r.l.（意大利巴里）。PUT、CAD、HIS、TYM、SPD的标准溶液用5%（w/v）TCA溶液配制。TRY和PHE的标准溶液用5%（w/v）TCA/ACN（1:1, v/v）溶液配制。1,7-二氨基庚烷（IS）储备溶液（浓度1 mg/L）也用5%（w/v）TCA溶液配制。向两种标准溶液和啤酒样品中分别加入25 μL和1 mL的IS，以尽量减少分析过程中的随机误差和系统误差。
2.2. 精酿啤酒样品
共购买了113种精酿啤酒（包装在玻璃瓶或铝罐中），来自意大利和罗马尼亚的市场（超市、专卖店和微啤酒厂），并根据其发酵方式分为底部发酵、顶部发酵、自然发酵和混合风格三类。每种风格的样品包括不同品牌和批次，每个样品均为单瓶装。这些精酿啤酒来自意大利和罗马尼亚各地的61家不同微啤酒厂。有关添加成分的详细信息来自产品标签上的说明。样品被带回实验室并置于4°C的冰箱中保存，直至分析，始终在生产商规定的保质期内。
2.3. 精酿啤酒分析
2.3.1. 物理化学分析
分析前，根据EBC方法9.46[34]，使用CP 104 Digit型超声波浴（CEIA S.p.A., 阿雷佐, 意大利）对啤酒样品进行脱气处理，然后通过CordenonS滤纸（77 Gsm, 米兰, 意大利）过滤。啤酒的酒精含量用自动Fermento Flash分析仪（Funke-Gerber, 德国）测定，pH值根据EBC方法9.35[34]测定。啤酒的颜色使用Cary 60分光光度计（Cernusco, 米兰, 意大利）测定，测量波长为430 nm处的吸光度（Abs），方法依据EBC方法9.9.1[34]。吸光度结果根据Masiello等人的方法[35]转换为EBC单位。所有测量均重复三次进行。
2.3.2. 生物胺分析
在脱气后的精酿啤酒样品中，通过液相色谱法测定7种生物胺（HIS、TYM、PHE、TRY、PUT、CAD、SPD）的含量，先进行丹磺酰氯衍生化处理。衍生化程序参照Shen等人的方法[36]，并根据Trani等人的建议进行了优化[37]。具体步骤如下：向19 mL脱气啤酒样品中加入1 mL IS（HEP，浓度1 mg/L in 5% (w/v) TCA），混合均匀后振荡1小时（Thermoscientific, 韦尔瑟姆, 马萨诸塞州, 美国），然后在4°C下离心10分钟（4000 × g）。上清液用尼龙滤器（0.45 μm）过滤。接着向125 μL样品（或每种生物胺标准溶液100 μL）中加入20 μL NaOH溶液（2 mol/L）和30 μL饱和碳酸氢钠（NaHCO3）溶液使其呈碱性。随后加入125 μL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL）在丙酮中衍生化，然后在40°C的水浴中孵育45分钟。最后加入10 μL氨溶液（33%）终止反应。向总体积500 μL的溶液中加入乙酸钠（0.10M）和乙腈（40:60, v/v），再进行离心。上清液使用0.45 μm尼龙注射器过滤器过滤后，注入UHPLC Ultimate 3000RS Dionex系统，并连接DAD检测器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。分析在C18柱（Gemini 5U，110 Å Phenomenex，美国加利福尼亚州托伦斯）上进行，柱温设定为38°C，流动相为乙酸钠（0.10 M）/乙腈（40:60，v/v）（溶剂A）和HPLC级乙腈（溶剂B）。流速为0.50 mL/min，流动相梯度如下：0-4分钟100% A，4-18分钟17.5% A，18-28分钟17.5% A，28.1-43分钟100% A。进样量为5 μL，检测波长为254 nm。每个啤酒样本分析三次，浓度通过外部标准品确定，并以mg/L表示。
2.4 统计分析
首先对生物胺（BAs）含量和理化分析数据进行描述性分析。然后，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估不同酿造风格之间的差异，并进行Tukey’s HSD事后检验（p < 0.05）。BAs数据还使用MetaboAnalyst 5.0软件通过PLS-DA进行分析。计算皮尔逊相关系数以推断啤酒的理化特性与其BA谱之间的关系，以及各种胺类之间的关系。统计分析使用XLSTAT软件（Addinsoft，法国巴黎）进行。所有图形使用GraphPad Prism软件（GraphPad Software Inc.；美国加利福尼亚州圣地亚哥）生成。
3. 结果与讨论
3.1 113种精酿啤酒样本中生物胺含量的分析
图1显示了在113种精酿啤酒样本中检测到的单个和总生物胺（计算为各生物胺浓度之和）的平均值、最小值和最大值。与Perpetuini等人的研究结果一致[23]，总生物胺含量差异很大，范围在1.64 – 280.08 mg/L之间，平均值为27.39 mg/L。这些数值超过了Li等人[29]对中国精酿啤酒的研究结果。检测到的主要生物胺包括酪胺（0 – 264.34 mg/L，平均10.24 mg/L）、色胺（0 – 48.60 mg/L，平均6.49 mg/L）、腐胺（0.26 – 43.20 mg/L，平均4.05 mg/L）和尸胺（0 – 55.70 mg/L，平均2.96 mg/L）。这些结果与Lorencová等人的研究结果一致[6]，证实了这些分子在精酿啤酒中的普遍存在。此外，Poveda[9]分析了26种西班牙啤酒，发现总生物胺含量在5.8至19.6 mg/L之间，其中腐胺和酪胺的含量最高。然而，西班牙精酿啤酒中的酪胺（0.80 – 6.50 mg/L）和腐胺（3.60 – 8.90 mg/L）含量远低于我们的研究结果。相反，Choi等人[25]报告韩国精酿啤酒中的腐胺（13.20 mg/L）和尸胺（5 mg/L）含量较高。在本研究中，组胺含量较低（0 – 28.22 mg/L，平均1.54 mg/L），其次是亚精胺（0 – 6.73 mg/L）和苯乙胺（0 – 14.77 mg/L，平均0.73 mg/L）。同样，大多数捷克精酿啤酒中的组胺和苯乙胺含量低于10 mg/L，这与我们的结果一致[6]。观察到的变异性是由于样本和成分的多样性所致。因此，后续分析集中在每种酿造风格类别内的生物胺积累情况，以及使用的非传统成分或生产过程，以更好地理解影响其浓度的因素。
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图1. 调查的精酿啤酒中检测到的生物胺的平均值、最小值和最大值（mg/L）。缩写：TOTAL BAs，总生物胺；TRY，色胺；PHE，苯乙胺；PUT，腐胺；CAD，尸胺；HIS，组胺；TYR，酪胺；SPD，亚精胺。条形图内的线条代表平均值。
3.2 不同精酿啤酒风格中的生物胺含量
精酿啤酒风格是新的酿造技术结合不同传统和非传统成分的结果[38]。通常，它们的分类取决于所使用的酵母类型：上层发酵（艾尔啤酒）、下层发酵（拉格啤酒）或自然发酵（野生啤酒）[39]。此外，啤酒协会已将啤酒风格分为混合/复合型、拉格型和艾尔型[40]。因此，在本研究中，精酿啤酒被分为上层发酵、下层发酵、自然发酵啤酒和混合风格，每种风格包含特定的子风格。为了更好地理解结果和酿造过程的影响，分别讨论了每种风格的生物胺含量，然后提供了各种风格之间的最终比较，以概述与不同酿造过程相关的生物胺水平。
3.2.1 下层发酵或拉格啤酒
拉格啤酒使用下层发酵酵母生产，传统上称为Saccharomyces pastorianus（同义词：carlsbergensis），在6 – 15°C下发酵7 – 12天[41]。在这个啤酒组中，包括皮尔森啤酒、维也纳拉格啤酒和博克啤酒等不同风格，如啤酒协会啤酒风格指南所述[40]。这些啤酒通常具有麦芽风味和平衡的啤酒花香气，最终产品的颜色范围为4至40 EBC[41]，如所研究的精酿啤酒样本所示（表S1）。如表S1所示，下层发酵啤酒的特点是酒精含量低，为4.6 – 7%（v/v），平均pH值为4.69，这与Silva等人的数据一致[42]。拉格啤酒的总生物胺含量范围为2.87至23.96 mg/L，平均值为12.43 mg/L（图2a），与智利、中国和意大利拉格啤酒的研究结果一致[12]、[23]、[29]。有趣的是，只有一种啤酒（Pils Lager_2，表1）可能对敏感消费者构成健康风险，其总生物胺含量略高于20 mg/L（表1）。平均而言，苯乙胺和腐胺是拉格精酿啤酒中最主要的生物胺（分别为0 –14.77 mg/L；0 – 4.18 mg/L）。由于这些分子主要与麦芽和啤酒花有关[20]、[43]，可以假设其较高含量可能与酿造过程中使用受污染的原材料有关。这一假设得到了相关性分析的支持，因为这些胺类之间存在显著的正相关（r = 0.679）。四种拉格啤酒（Lager_4、Pils Lager_1、Pils Lager_2、Pils Lager_3，表1）的苯乙胺含量超过了建议的毒性限值（表1）。其他作者[9]检测到苯乙胺的浓度低于3 mg/L。尸胺的含量（0 – 11.33 mg/L，平均1.97 mg/L）是Poveda[9]结果的三倍。由于这种脂肪族胺通常被认为是啤酒生产过程中污染和卫生标准的指标[14]，其较高含量可能归因于肠杆菌科和假单胞菌属微生物的污染[45]。实际上，从啤酒厂表面分离出的肠杆菌科和假单胞菌科微生物能够将赖氨酸脱羧生成尸胺[46]。这些微生物属于能够将赖氨酸脱羧为尸胺的肠杆菌科和假单胞菌科，可能由于微啤酒厂的卫生条件不佳而引起污染[46]。事实上，肠杆菌科和假单胞菌科微生物携带赖氨酸脱羧酶（ldc），该酶催化赖氨酸的羧基（-COOH）去除，生成尸胺[47]。这种脱羧酶编码基因与其他参与生物胺生成过程的基因（如运输和酶成熟）成簇存在。值得注意的是，这些生物胺生成途径的表达具有菌株特异性，并受pH值、温度和前体活力等多种因素的调节[47]。在Lager_1样本之后，维也纳拉格_1样本的尸胺含量最高，同时还检测到其他微生物来源的生物胺，如组胺和酪胺（表1）。组胺和酪胺之间存在强正相关（r = 0.834），表明它们具有共同的微生物来源，这与Perpetuini等人的研究结果一致[23]，他们报告了这些含氮化合物与乳酸菌（LAB）之间的正相关。关键的乳酸菌属，包括乳杆菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、肠球菌（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）和魏斯菌（Weissella），携带组氨酸（hdc）和酪氨酸（tdc）脱羧酶基因簇，分别催化组氨酸和酪氨酸的转化[47]。特别是导致啤酒变质的乳酸菌，如Lactobacillus brevis、L. buchneri [8]、L. lindneri [48]和Pediococcuss spp.，与组胺和酪胺的产生有关[20]。来自乳制品基质的证据表明，L. buchneri菌株曾导致1985年的中毒事件[10]，这也突显了它们对啤酒行业的潜在危害。此外，L. brevis和L. lindneri被认为是最常见的啤酒变质细菌，因为它们经常在微啤酒厂环境中被检测到[48]、[49]。在这种情况下，组胺被提出作为酿造卫生的良好指标[1]。Zamfir等人[50]从啤酒样本中分离出Enterobacter ludwigii，支持了我们的发现，因为这种细菌已知参与组胺和尸胺的产生。上述生物胺（尸胺、组胺和酪胺）的形成基于它们相应芳香族或脂肪族氨基酸的一步脱羧反应，需要氨基酸主动运输系统（如反转运蛋白）来交换产生的生物胺[51]。这些脱羧途径由微生物激活，出于多种生理原因。实际上，氨基酸的脱羧与产电反转运系统耦合，可以抵消细胞内的酸化；已经证明许多脱羧酶基因的转录受到低pH值的诱导，因此生物胺的积累可能是细胞应对酸应激的防御机制[52]。正如Perpetuini等人[23]所报告的，pH值与酪胺（r = -0.660）和组胺（r = -0.508）浓度呈负相关，表明由于乳酸菌的代谢活动，较低的pH值可能促进生物胺的形成。与这些结果一致，维也纳拉格_1样本的pH值最低（4.43），在所有拉格啤酒中最低。对于组胺不耐受的人来说，应特别注意饮用这些拉格精酿啤酒，因为只有一个样本（Lager_5，表1）未检测到组胺。色胺与颜色呈强正相关（r = 0.768）；这种分子的最高含量出现在深色且味道浓郁的博克_1样本中（39.48 EBC）。这种现象可能与麦芽烘焙过程中的美拉德反应有关[29]。拉格啤酒中的色胺水平（图2a）与Li等人的研究结果一致[29]。由于亚精胺在发酵酵母的核酸代谢中的作用，预期其在酒精饮料中存在[6]。然而，在波兰生产的拉格啤酒中检测到的亚精胺平均值几乎是本研究的三倍[53]。
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图2. 不同精酿啤酒风格中的生物胺含量（mg/L）；2a，下层发酵啤酒中的生物胺含量；2b，上层发酵啤酒中的生物胺含量；2c，自然发酵啤酒中的生物胺含量；2d，混合风格啤酒中的生物胺含量。缩写：TRY，色胺；PHE，苯乙胺；PUT，腐胺；CAD，尸胺；HIS，组胺；TYR，酪胺；SPD，亚精胺；TOTAL BAs，总生物胺。条形图内的线条代表平均值。
表1.市场上手工啤酒中的生物胺（毫克/升）。
| 车型 | 细胞ID | 样品 | 成分/工艺 | TYPHEP | PUT | CAD | HIS | TYR | SPD | 总生物胺 |
|------|-------|------|-------|------|------|------|------|---------|
| LAGER_1 | | 0.72 | 0.27 | 0.38 | 11.21 | 0.09 | ● | 0.31 | 0.90 | 13.88 |
| LAGER_2 | | 0.48 | 1.44 | 0.30 | 1.48 | 0.08 | ● | 0.23 | 1.19 | 5.19 |
| LAGER_3 | | 1.13 | 0.82 | 0.38 | 0.60 | 0.13 | ● | 0.17 | 1.20 | 4.43 |
| LAGER_4 | | 1.93 | 9.24 | ◊ | 3.56 | ● | 1.99 | 17.27 |
| LAGER_5 | | | | | | | | | | 0.88 | 0.94 | 0.61 | 0.59 |
| PILS LAGER_1 | | 2.15 | 5.20 | ◊ | 2.17 | 0.26 | 0.50 | ● | 1.29 | 11.89 |
| PILS LAGER_2 | | | 13.02 | ◊ | 4.13 | 0.56 | 1.12 | ● | 1.73 | 1.58 | 22.14 |
| PILS LAGER_3 | | 0.86 | 3.93 | ◊ | 2.78 | ● | 1.57 | 1.52 | 11.60 |
| VIENNA LAGER_1 | | 1.74 | | 2.90 | 4.14 | 3.81 | ● | 2.86 | 18.48 |
| BOCK_1 | | | 7.40 | | | | | | 0.88 | 0.94 | 0.61 | 0.59 |
| TOP-FERMENTED | | | | | | | | | | 0.88 | 0.94 | 0.61 | 0.59 |
| PALE ALE_1 | | 1.18 | 0.95 | 1.95 | 1.28 | | | | 2.26 | 1.03 | 8.65 |
| PALE ALE_2 | | | 0.14 | 2.65 | 0.67 | 0.43 | ● | 3.57 | 7.46 |
| PALE ALE_3 | | 0.06 | 0.19 | 1.45 | 0.98 | 0.12 | ● | 1.42 | 4.22 |
| PALE ALE_4 | | 0.51 | 0.72 | 2.25 | 0.97 | 0.55 | ● | 2.48 | 2.29 | 9.77 |
| PALE ALE_5 | | 0.87 | 3.67 | ◊ | 1.55 | 1.45 | 0.98 | ● | 1.83 | 11.4 |
| PALE ALE_6 | | 2.16 | 0.65 | 1.53 | 0.87 | 0.39 | ● | 2.38 | 8.41 |
| PALE ALE_7 | | 6.60 | 0.16 | 0.71 | 0.77 | 0.04 | ● | 1.83 | 10.8 |
| PALE ALE_8 | | | 0.24 | 1.06 | 0.84 | 0.15 | ● | 1.84 | 4.91 |
| PALE ALE_9 | | | | | | | | | 1.16 | 0.56 | 0.38 | 0.60 |
| PALE ALE_11 | | | | | | | | | 33.09 | 36.13 | |
| PALE ALE_12 | | | | | | | | 42.94 | 53.10 | ▲ |
| PALE ALE_13 | | | | | | | | 62.29 | |
| PALE ALE_14 | | | | | | | | 42.94 | 53.10 | ▲ |
| PALE ALE_15 | | | | | | | | 62.29 | |
| PALE ALE_16 | | | | | | | | 69.22 | |
| PALE ALE_17 | | | | | | | | 158.33 | |
| PALE ALE_18 | | | | | | | | |
| PORTER_1 | | 2.15 | 5.20 | ◊ | 2.17 | 0.26 | 0.50 | ● | 1.29 | 11.89 |
| PORTER_2 | | | 13.02 | ◊ | 4.13 | 0.56 | 1.12 | ● | 1.73 | 1.58 | 22.14 |
| PORTER_3 | | 0.86 | 3.93 | ◊ | 2.78 | ● | 1.57 | 1.52 | 11.60 |
| PORTER_4 | | 1.93 | 9.24 | ◊ | 3.56 | ● | 1.99 | 17.27 |
| PORTER_5 | | | | | | | | | | 0.88 | 0.94 | 0.61 | 0.59 |
| PILS LAGER_3 | | 2.15 | 5.20 | ◊ | 2.17 | 0.26 | 0.50 | ● | 1.29 | 11.89 |
| PORTER_2 | | | 13.02 | ◊ | 4.13 | 0.56 | 1.12 | ● | 1.73 | 1.58 | 22.14 |
| PORTER_3 | | 0.86 | 3.93 | ◊ | 2.78 | ● | 1.57 | 1.52 | 11.60 |
| VIENNA LAGER_1 | | 1.74 | | 2.90 | 4.14 | 3.81 | ● | 2.86 | 18.48 |
| BOCK_1 | | | 7.40 | | | | | | 0.88 | 0.94 | 0.61 | 0.59 |
**注：**
- 表中的数据为三次测量的平均值。
- 缩写说明：
- TOTAL BAs：总生物胺
- TYPHEP：色胺
- PHE：苯乙胺
- PUT：腐胺
- CAD：尸胺
- HIS：组胺
- TYR：酪胺
- SPD：亚精胺
- nd：未检测到
- *：总生物胺 > 20 mg/L，对敏感人群有风险
- **：总生物胺 > 50 mg/L，即使对健康人群也有风险
- †：酪胺 > 10 mg/L，对敏感人群有风险
- ‡：酪胺 > 25 mg/L，即使对健康人群也有风险
- ●：组胺 > 8 mg/L，对组胺不耐受的人群有风险
- ○：苯乙胺 > 3 mg/L，即使对健康人群也有风险
- ▲：腐胺或尸胺 > 50 mg/L，即使对健康人群也有风险
**3.2.2. 高温发酵啤酒**
高温发酵啤酒传统上使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在18–22°C的温度下发酵3–5周，产生大量的酯类和其他赋予风味的分子。这类啤酒通常具有较“果香”特征，与低温发酵啤酒相比[56]。Villacreces等人[38]指出，几种啤酒风格属于这一类别，如淡色艾尔（Pale Ale）、红艾尔（Red Ale）、波特啤酒（Porter）和黑啤酒（Stout）。本研究还扩展了对意大利葡萄艾尔（IGA）、戈斯啤酒（Gose）和大麦酒（Barleywine）的生物胺检测。戈斯啤酒是德国风格的啤酒，具有中等的果香和核果类水果的香气[57]。这类手工啤酒通常会加入盐和香菜，带来类似柠檬的香气[58]。大麦酒是一种传统的啤酒风格，其主要特点是长时间在桶中陈酿。鉴于其特殊特性，下面对IGA进行了简要讨论。表S1中的物理化学结果与其他作者的研究结果一致[9][54]。生物胺含量差异较大，范围从1.64 mg/L到280.08 mg/L（图2b），这些数值高于其他国家手工啤酒的报道[6][9][25][29]。值得注意的是，常见的开胃酒和奶酪富含生物胺，且常与啤酒一起饮用[60]，因此评估食物与啤酒的搭配非常重要，尤其是考虑到这种特定风格啤酒中这些有毒化合物的总体浓度。分析显示，酪胺、色胺、腐胺和尸胺的浓度最高（图2b）。其中，两种大麦酒（Barleywine_1和Barleywine_3）以及一种黑啤酒（Stout_8）的酪胺含量特别高；这些内容将在第3.4节详细讨论。值得注意的是，这些样本中的酪胺浓度达到了259 mg/L；根据欧洲食品安全局（EFSA）的建议安全限值（每餐600 mg），一杯这样的啤酒就几乎达到了引发不良反应所需的剂量的一半。因此，需要加强对消费者的教育，让他们了解如何合理搭配食物和饮料，以防止生物胺的累积摄入。总体而言，来自中国和波兰的淡色艾尔和波特啤酒的酪胺含量低于我们的研究结果[29][53]。苯乙胺的检测浓度低于建议的毒性剂量（表1），除了两种样本（Barleywine_3和Pale Ale_5）。前者是一种深色大麦酒（酒精度455.33 EBC），这可能解释了其较高的苯乙胺含量。事实上，波特啤酒也是高温发酵啤酒，其酪胺含量最高（表1）。这些发现与Poveda[9]和Li等人[26]的研究结果一致，他们将苯乙胺和酪胺的形成归因于高温麦芽处理过程中氨基酸的热脱羧作用。实际上，酪胺含量与啤酒颜色呈正相关（r = 0.758）。深色啤酒的乙醇含量也较高（r = 0.624）。这一发现值得关注，因为深色啤酒通常更受消费者欢迎，但他们往往愿意支付更高的价格[61]。然而，这种较高的乙醇含量可能会影响生物胺的代谢，从而加剧苯乙胺和酪胺的毒性作用，这两种胺在深色啤酒中较为常见，已知会引发偏头痛和升高血压[24]。与以往的研究相比，西班牙的手工啤酒中的酪胺和苯乙胺含量较低[9]，而中国啤酒中的含量较高[29]。组胺含量与西班牙的红艾尔和深色艾尔相当[9]，但低于韩国手工啤酒[25]。只有一个样本（Stout_17）的组胺含量超过了建议的安全阈值（表1）。然而，80%的艾尔啤酒可能对组胺不耐受的人群造成不良反应。
**3.2.3. 自发发酵啤酒**
自发发酵啤酒的特点是使用原材料、设备或环境中的微生物进行自然发酵，这些微生物会影响最终产品的微生物群[67]。研究中的野生样本酒精含量低，颜色较淡（表S1），与Hinojosa-Avila等人的研究结果一致[68]。总生物胺浓度范围为15.77–202.73 mg/L，平均值为104.91 mg/L（图2c）。这些含氮化合物的总量表明，75%的野生啤酒可能对健康人群构成潜在健康风险（表1）。酪胺似乎是最主要的健康风险因素，因为75%的样本超过了安全阈值（25–40 mg/L）。实际上，酪胺是这些手工啤酒中积累最多的胺类。此外，酪胺与总生物胺含量呈强正相关（r = 0.992），与腐胺（r = 0.984）和尸胺（r = 0.923）也呈正相关。这些结果表明，这些手工啤酒中的微生物具有强烈的脱羧活性。Loret等人[11]在啤酒的自发发酵过程中分离出了脱羧微生物；特别是肠杆菌科细菌在发酵初期占主导地位，而乳酸菌则出现在发酵后期。Garofalo等人[72]在啤酒厂管道中检测到了这类细菌。这些细菌与腐胺和尸胺的积累有关[14]。腐胺的代谢途径已在第3.2.1节中描述。另一方面，腐胺可以通过多种途径形成，涉及不同的酶和基因簇。鸟氨酸和精胺是腐胺的主要直接前体。关于酪胺的生成，它主要与乳酸菌（LAB）有关，而不是其前体酪氨酸的初始浓度[73]；这与Perpetuini等人的研究结果一致[23]，他们报告了在这种特定啤酒风格中乳酸菌密度与酪胺水平之间存在直接相关性。这些结果还得到了其他几位作者[46]、[72]的支持，他们不仅在啤酒样本中检测到了乳酸菌，还在微型啤酒厂的研磨表面以及用于发酵的干酵母中发现了乳酸菌，证实了这些微生物在整个酿造环境中的广泛存在。因此，由于这些乳酸菌在适宜的环境条件下（如pH值、温度等）能够将酪氨酸脱羧，它们在酿造过程中具有很高的酪胺生成潜力[47]。Maifreni等人[46]报告称，从微型啤酒厂环境中分离出的菌株具有形成生物膜的能力，在这种生物膜中乳酸菌可以更活跃地表达酪氨酸脱羧酶，从而增加了有毒胺类物质积累的可能性[47]。这些细菌生物膜可能藏匿并保护导致啤酒变质的微生物，因此必须认为它们对产品的卫生安全构成威胁。这突显了当前卫生措施中的一个关键缺陷，因为过氧乙酸处理往往无法完全灭活生物膜，因此需要探索替代的消毒策略[46]。此外，值得注意的是Bongaerts等人[74]专注于兰比克啤酒的生产，并指出在这种特定啤酒风格中，乳酸菌也与多种胺类物质（如腐胺和尸胺）呈正相关。后者也与酿造温度有关，因为胺类物质的形成依赖于温度；较高的温度会加速微生物脱羧酶的活性，从而促进胺类物质的合成[47]、[75]。啤酒的pH值对胺类物质的积累很重要，因为它影响胺类物质的形成，进而影响负责胺类物质合成的脱羧酶的活性，因为酸性pH值会增强脱羧酶基因的转录[47]、[51]。与此一致的是，这些啤酒的pH值较低（平均为3.65），与其他啤酒风格相比（表S1），并且与组胺（r = -0.858）和腐胺（r = -0.600）的含量呈负相关。这一发现与Loret等人[11]和Perpetuini等人的研究结果一致，因为自发发酵啤酒中较低的pH值直接与其酸味特征相关，这是由于野生酵母和细菌产生的有机酸所致。总体而言，自发发酵的手工啤酒中的酪胺、腐胺和尸胺浓度高于文献中的报道[18]、[69]。然而，在比利时和意大利的自发发酵啤酒中观察到的组胺平均值超过了10 mg/L，远远超过了我们的结果[11]。只有一个样本（Wild_1，表1）超过了健康消费者的安全组胺限值。然而，所有野生啤酒都可能对组胺不耐受的人构成风险，这证实了Perpetuini等人的结论[23]。鉴于样本量较小且这种啤酒风格的流行度日益增加[67]，需要进一步的研究来验证这些发现。
3.2.4 混合啤酒风格
根据啤酒协会的啤酒风格指南[40]以及科学文献[38]、[76]、[77]，我们在“混合”风格中包括了小麦基、酸果味和烟熏啤酒（表1）。虽然之前已经对小麦基啤酒进行了研究，但关于果味和烟熏啤酒中胺类物质的存在信息有限。总体而言，表S1中报告的酒精含量、颜色（EBC）和pH值与其他研究者的结果一致[9]、[42]、[66]。总胺类物质含量在2.47–90.56 mg/L之间，平均为17.62 mg/L（图2d）。就总胺类物质而言，近25%的样本对敏感人群可能具有潜在危险，另外2个样本也可能对健康人群构成安全风险（表1）。分析胺类物质谱系时，色胺、酪胺和腐胺是最具代表性的（图2d）。这些结果进一步得到了总胺类物质与酪胺（r = 0.908）以及总胺类物质与腐胺（r = 0.634）之间强正相关性的支持。特别是，一种酸果味啤酒（Sour&Fruit_11，表1）中的酪胺含量是导致敏感个体高血压的毒性剂量的七倍（表1）。这一结果是预期之中的，因为属于Pediococcus属的微生物与酪胺的生成有关[11]、[20]，它们是酸果味啤酒中分离出的主要乳酸菌[66]。此外，研究人员指出，L. brevis菌株是手工啤酒厂中主要的酪胺生产者。因此，由于一些L. brevis菌株被用作酸果味啤酒的商业发酵剂，啤酒酿造者应仔细选择用于酿造过程的乳酸菌[70]。在这种情况下，评估编码酪氨酸脱羧酶的tyrDC基因的存在和表达对于确保所选发酵剂的安全性至关重要。另外值得注意的是，某些微生物的脱羧酶活性并不高度特异于单一氨基酸；它们能够转化结构相似的氨基酸。例如，酪氨酸脱羧酶也能将苯丙氨酸转化为苯乙胺[51]，这引发了在使用发酵剂之前需要调查其脱羧活性的严重关切。Li等人[29]对中国酸果味啤酒的研究也得出了类似的结果，他们检测到酪胺的最大浓度为80 mg/L。在混合风格的啤酒中，酸果味啤酒显示出最高的组胺水平。这些发现与Kalak和Krízek[20]的研究结果一致，他们指出上述细菌与组胺的生成有关。最近，Aponte等人[66]报告称，酸果味和果味啤酒中的平均组胺水平显著较低（0.10 mg/L），低于我们样本中的水平。尽管如此，在分析的混合风格啤酒中，只有一个样本（Sour&Fruit_9，表1）可能对健康消费者产生不良生理影响。与韩国手工啤酒的研究结果一致[25]，这些混合啤酒可能对组胺不耐受的人构成潜在风险[15]（表1）。中国酸果味啤酒中的苯乙胺水平略高于5 mg/L[29]，与Sour&Fruit_12样本的结果一致（表1）；后者确实超过了苯乙胺的安全阈值（表1）。与之前的研究[29]不同，本研究显示所研究的小麦啤酒主要以酪胺和腐胺为特征（表1）。Poveda[9]也得到了类似的结果。Saad和Tofalo[69]指出，在小麦啤酒中可能发生乳酸发酵，从而导致胺类物质的形成。根据这些结果，以及Sour&Fruit_11样本，两种小麦啤酒（Wheat_7和Wheat_8，表1）也可能因酪胺含量而对健康人群造成中毒。在这项研究中，酪胺水平明显高于Perpetuini[21]和Li[26]的报告。相反，后者的作者观察到的腐胺浓度高于我们的发现。
色胺是烟熏啤酒中最常见的胺类物质之一（表1）。这一结果可能与麦芽烘焙过程中的美拉德反应有关[29]，因为这些啤酒是用烟熏麦芽生产的[78]。一致的是，颜色强度与色胺水平之间存在显著正相关（r = 0.624）。
3.3 啤酒风格的比较
最后，比较了不同啤酒风格，以确定哪种啤酒通常含有最高的胺类物质含量并可能带来潜在的健康风险（表2）。正如预期的那样，自发发酵啤酒的总胺类物质含量（p < 0.05）以及细菌来源的个别胺类物质（组胺、酪胺、腐胺、尸胺）含量高于其他啤酒风格。这些结果表明微型啤酒厂受到脱羧酶阳性微生物的严重污染[11]，如3.2.3节所述。同样，来自比利时的自发发酵啤酒的总胺类物质含量最高[11]。与Li[29]的研究结果一致，顶部发酵啤酒的特点是色胺含量显著较高，因为这种风格包括Stout和Porter啤酒（3.2.2节）。苯乙胺在底部发酵的手工啤酒中的含量最高（p < 0.05）。有趣的是，我们的发现与Poveda[9]的数据不一致，后者指出深色啤酒的苯乙胺含量最高。混合风格的手工啤酒显示出最高的亚精胺浓度，与野生产品的差异不大。这可能与酿造过程中使用了受污染的原材料有关，如3.4节所述。
表2. 不同手工啤酒风格中的生物胺类物质含量（mg/L）
| 风格 | TYPHE | PUT | CAD | HIS | TYR | SPD | TOTAL BAs |
|-------------|--------|------|------|------|------|---------|
| 底部发酵 | 1.64 ± 2.09 | b | 3.39 ± 4.42 | a | 2.04 ± 1.41 | b | 1.97 ± 3.34 | b |
| | 2.04 ± 1.41 | b | 1.97 ± 3.34 | b | 0.85 ± 1.1 | b | 1.27 ± 0.88 | b |
| | 1.27 ± 0.88 | b | 1.27 ± 0.9 | b | 12.43 ± 6.32 | b |
| 顶部发酵 | 9.26 ± 11.21 | a | 0.44 ± 0.98 | b | 4 ± 7.39 | b | 3.16 ± 8.42 | b |
| | 1.32 ± 1.81 | b | 10.65 ± 36.31 | b | 1.03 ± 1.25 | b | 29.85 ± 42.72 | b |
| 自发发酵 | 2.76 ± 2.96 | b | nd | 20.29 ± 13.37 | a | 20.03 ± 20.37 | a | 6.29 ± 4.97 | a |
| | 53.69 ± 44.41 | a | 1.86 ± 2.04 | ab | 104.91 ± 71.82 | a |
| 混合风格 | 2.87 ± 4.69 | b | 0.6 | 0.91 | 2.81 ± 1.29 | b | 0.78 ± 0.76 | b | 1.62 ± 4.31 | b |
| | 6.87 ± 16.43 | b | 2.07 ± 1.7 | a | 17.62 ± 18.66 | b |
| | | | | | | |
表2显示的平均值±标准差a,b 列中不同的上标字母表示根据Tukey's HSD检验（p < 0.05）存在显著差异。
缩写：TOTAL BAs，总生物胺类物质；TRY，色胺；PHE，苯乙胺；PUT，腐胺；HIS，组胺；TYR，酪胺；SPD，亚精胺；nd，未检测到。
3.4 非传统成分和加工步骤对胺类物质谱的影响：关键点的识别和缓解策略
对胺类物质谱进行了偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以评估传统生产的啤酒（称为“Plane”）和使用非传统成分（如水果、香料或咖啡）或特定加工步骤（称为“Added”）生产的啤酒之间的差异。所得到的二维生物图（图3a）显示，第一组分和第二组分分别解释了总方差的22.7%和22.2%，占总数据变异性的44.9%，表明模型具有稳健性和高度可解释性。模型可靠性还得到了交叉验证指标（R2和Q2）的支持（图3c）。PLS-DA生物图显示，添加成分的啤酒组与传统生产的啤酒组之间存在部分差异（图3a），前者的胺类物质谱变异更大。根据VIP得分，四种胺类物质显著促进了两组之间的区分（图3b）。值得注意的是，添加成分的样本显示出更高的色胺、亚精胺和酪胺浓度，而传统生产的样本则显示出更高的苯乙胺含量。实际上，在使用传统方法酿造且未添加非传统成分的拉格啤酒（Pils Lager_2、Lager_4和Pils Lager_1，表1）中检测到了最高水平的苯乙胺。Li等人[29]报告了中国酸果味啤酒的类似发现，其中酪胺的最大浓度为80 mg/L。在混合风格的啤酒中，酸果味啤酒显示出最高的组胺水平。这些发现与Kalak和Krízek[20]的研究结果一致，他们指出上述细菌与组胺的生成有关。最近，Aponte等人[66]报告称，酸果味和果味啤酒中的平均组胺水平显著较低（0.10 mg/L）。然而，在分析的混合风格啤酒中，只有一个样本（Sour&Fruit_9，表1）可能对健康消费者产生不良生理影响。与韩国手工啤酒的研究结果一致[25]，这些混合啤酒可能对组胺不耐受的人构成潜在风险[15]（表1）。中国酸果味啤酒中的苯乙胺水平略高于5 mg/L[29]，与Sour&Fruit_12样本的结果一致（表1）；后者确实超过了苯乙胺的安全阈值（表1）。与之前的研究[29]不同，本研究表明所研究的小麦啤酒主要以酪胺和腐胺为特征（表1）。Poveda[9]也得到了类似的结果。Saad和Tofalo[69]指出，在小麦啤酒中可能发生乳酸发酵，从而导致胺类物质的形成。与这些结果一致，以及Sour&Fruit_11样本，两种小麦啤酒（Wheat_7和Wheat_8，表1）也可能因酪胺含量而对健康人群造成中毒。在这项研究中，酪胺水平明显高于Perpetuini[21]和Li[26]的报告。相反，后者作者观察到的腐胺浓度高于我们的发现。
色胺是烟熏啤酒中最常见的胺类物质之一（表1）。这一结果可能与麦芽烘焙过程中的美拉德反应有关[29]，因为这些啤酒是用烟熏麦芽生产的[78]。一致的是，颜色强度与色胺水平之间存在显著正相关（r = 0.624）。
3.3 啤酒风格的比较
最后，比较了不同啤酒风格，以确定哪种啤酒通常含有最高的胺类物质含量并可能带来潜在的健康风险（表2）。正如预期的那样，自发发酵啤酒的总胺类物质含量（p < 0.05）以及细菌来源的个别胺类物质（组胺、酪胺、腐胺、尸胺）含量高于其他啤酒风格。这些结果表明微型啤酒厂受到脱羧酶阳性微生物的严重污染[11]，如3.2.3节所述。同样，来自比利时的自发发酵啤酒的总胺类物质含量最高[11]。与Li[29]的研究结果一致，顶部发酵啤酒的特点是色胺含量显著较高，因为这种风格包括Stout和Porter啤酒（3.2.2节）。苯乙胺在底部发酵的手工啤酒中的含量最高（p < 0.05）。有趣的是，我们的发现与Poveda[9]的数据不一致，后者指出深色啤酒的苯乙胺含量最高。混合风格的手工啤酒显示出最高的亚精胺浓度，与野生产品的差异不大。这可能与酿造过程中使用了受污染的原材料有关，如3.4节所述。
表2. 不同手工啤酒风格中的生物胺类物质含量（mg/L）
| 风格 | TYPHE | PUT | CAD | HIS | TYR | SPD | TOTAL BAs |
|-------------|--------|------|------|------|------|---------|
| 底部发酵 | 1.64 ± 2.09 | b | 3.39 ± 4.42 | a | 2.04 ± 1.41 | b | 1.97 ± 3.34 | b |
| | 2.04 ± 1.41 | b | 1.97 ± 3.34 | b | 0.85 ± 1.1 | b | 1.27 ± 0.88 | b |
| | 1.27 ± 0.88 | b | 1.27 ± 0.9 | b | 12.43 ± 6.32 | b |
| 顶部发酵 | 9.26 ± 11.21 | a | 0.44 ± 0.98 | b | 4 ± 7.39 | b | 3.16 ± 8.42 | b |
| | 1.32 ± 1.81 | b | 10.65 ± 36.31 | b | 1.03 ± 1.25 | b | 29.85 ± 42.72 | b |
| 自发发酵 | 2.76 ± 2.96 | b | nd | 20.29 ± 13.37 | a | 20.03 ± 20.37 | a | 6.29 ± 4.97 | a |
| | 53.69 ± 44.41 | a | 1.86 ± 2.04 | ab | 104.91 ± 71.82 | a |
| 混合风格 | 2.87 ± 4.69 | b | 0.6 | 0.91 | 2.81 ± 1.29 | b | 0.78 ± 0.76 | b | 1.62 ± 4.31 | b |
| | 6.87 ± 16.43 | b | 2.07 ± 1.7 | a | 17.62 ± 18.66 | b |
值表示平均值±标准差a,b 列中不同的上标字母表示根据Tukey's HSD检验（p < 0.05）存在显著差异。
缩写：TOTAL BAs，总生物胺类物质；TRY，色胺；PHE，苯乙胺；PUT，腐胺；HIS，组胺；TYR，酪胺；SPD，亚精胺；nd，未检测到。
3.4 非传统成分和加工步骤对胺类物质谱的影响：关键点的识别和缓解策略
对胺类物质谱进行了偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以评估传统生产的啤酒（称为“Plane”）和使用非传统成分（如水果、香料或咖啡）或特定加工步骤（称为“Added”）生产的啤酒之间的差异。所得到的二维生物图（图3a）显示，第一组分和第二组分分别解释了总方差的22.7%和22.2%，占总数据变异性的44.9%，表明模型具有稳健性和高度可解释性。模型可靠性还得到了交叉验证指标（R2和Q2）的支持（图3c）。PLS-DA生物图显示，添加成分的啤酒组与传统生产的啤酒组之间存在部分差异，前者的胺类物质谱变异更大（图3a）。根据VIP得分，四种胺类物质显著促进了两组之间的区分（图3b）。值得注意的是，添加成分的样本显示出更高的色胺、亚精胺和酪胺浓度，而传统生产的样本显示出更高的苯乙胺含量。实际上，在使用传统方法酿造且未添加非传统成分的拉格啤酒（Pils Lager_2、Lager_4和Pils Lager_1，表1）中检测到了最高水平的苯乙胺。此外，Wild_3和Wild_4样品也在瓶中进行了二次发酵，这可能促进了这些化合物的进一步积累。我们的结果与Loret等人的研究[11]一致，他们观察到经过瓶内二次发酵的啤酒中尸胺、组胺和酪胺的含量更高。可以假设这种较高的生物胺积累可能是微生物在第一次发酵后营养耗尽时获取额外能量的策略。事实上，已经证明脱羧酶途径可以在环境恶劣条件下支持初级代谢；反转运蛋白和脱羧酶通过释放能量来促进质子消耗反应，从而产生质子动力，这对没有呼吸链的细菌非常有用[51]。在这项研究中，“种子”一词指的是咖啡和可可样品，它们被用来提升最终啤酒的感官特性和功能性[82]、[83]、[84]。然而，这些原材料也可能是生物胺的重要来源；在酿造过程中，这些含氮化合物可能会释放并积累在麦汁中，持续存在于最终产品中。因此，它们的存在可能对消费者构成潜在的健康风险。在这项研究中，四种斯图特啤酒样品（Stout_8、Stout_16、Stout_19和Stout_21，表1）的酪胺含量超过了10毫克/升（表1）。这些特定啤酒的特点是添加了非传统的辅料，如咖啡、可可和巧克力，这些成分已知含有较高的酪胺含量[85]、[86]。据报道，研磨咖啡样品中的总生物胺含量可高达325毫克/千克，其中酪胺是最丰富的，其浓度可达到100毫克/千克。同样，可可样品中也检测到酪胺是主要的生物胺，含量高达71毫克/千克。总体而言，这些研究支持了我们的假设，即使用特定的种子辅料可能是我们样品中检测到高酪胺水平的主要原因。同样，本研究中香料啤酒也表现出酪胺、腐胺和尸胺的积累增加，进一步证明了非传统成分与生物胺含量之间的关联。特别是Pale Ale_11（表1），这是一种大麻酿造的啤酒，其酪胺和尸胺的含量超过了安全限值（表1），这与Maciel等人的研究结果一致[87]。后者报告称，大麻籽中的酪胺和酪氨酸含量分别高达58毫克/千克和43毫克/千克。此外，这种产品还可能富含赖氨酸（70毫克/千克），赖氨酸可以脱羧生成尸胺。虽然水果主要因其抗氧化特性而被添加到啤酒中，但它们也可能引入有毒化合物。在这项研究中，水果啤酒与酪胺、腐胺和亚精胺的相关性较高。实际上，在IGA样品IGA_4（表1）中，腐胺的含量最高。这可能是由于在酿造过程中添加了芒果和菠萝（表1），因为腐胺是这些热带水果中的主要生物胺[88]。这一发现支持了Sour&Fruit_11样品的结果，这是一种用芒果酿造的酸啤酒，其腐胺含量最高[88]、[89]、[90]。Sour&Fruit_6样品（表1）是用百香果酿造的，其亚精胺含量最高。根据Santiago-Silva等人的研究[88]，百香果中的亚精胺含量显著高于其他热带水果，平均为30.5毫克/千克，这与我们的结果一致。
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图4. 根据所使用的非传统原料或特定加工步骤，手工啤酒中生物胺的热图。颜色图表示标准化后的生物胺数据。
这些结果强调了准确选择原材料的重要性。事实上，非传统原料也可能是这些化合物的来源，它们可以在麦汁中积累，导致最终产品中的生物胺含量升高。此外，与有机原材料和非传统原料相关的微生物群落，为了获得独特的啤酒香气和风味而添加，可能会增加腐败风险和生物胺的形成[70]。与此相关的是，在西班牙手工啤酒厂的填充机外部表面分离出了乳酸菌（L. brevis、L. paracasei、L. plantarum、P. acidilactici），因为这些物种存在于蔬菜和水果产品、大麦粒、小麦和麦芽的微生物群落中。这些细菌在各种作物上的存在解释了使用非传统谷物酿造的啤酒（Wild_2、Wheat_3和Wheat_7，表1）中发现的较高酪胺水平。因此，酿酒师应考虑到乳酸菌的污染风险不仅源于它们的腐败活性，还源于它们作为生物胺生产者的潜力。在这个框架下，我们引入了“混合物”一词来描述各种辅料的混合物。如图4所示，这些特定样品显示出色胺的积累较高，可能是因为其中许多是深色啤酒，以及酪胺。
总体而言，这些结果表明特定的酿造工艺（例如桶陈酿、瓶内再发酵、自然发酵）和非传统原料的添加会导致手工啤酒中这些含氮化合物的积累。因此，整个生产过程中需要严格监控，特别是对传统和非传统原材料的选择。此外，起始菌株的选择至关重要，因为许多酵母和细菌菌株具有脱羧酶活性，这会在发酵过程中促进生物胺的形成。在酿造过程中还发现了其他关键点：特别是麦芽烘焙阶段，这与较高的色胺产量有关，以及不受控制的发酵，这会显著促进微生物来源的生物胺（如组胺和酪胺）的积累，这两种生物胺被认为是毒性最强的[24]。为了降低这种风险，一个有前景的解决方案可能是使用具有胺氧化活性的微生物；最近，有研究评估了酵母菌株在降解生物胺方面的有效性[91]。后者观察到生物胺的降解率为48%，其中色胺和腐胺的降解率最高。值得注意的是，所使用的酵母菌株没有对啤酒的挥发性香气成分产生负面影响，反而增强了玫瑰和热带水果等特征香气。其他作者也在多种食品基质中成功应用了降解生物胺的微生物，包括葡萄酒[92]、奶酪[93]和发酵香肠[94]。这些菌株在食品基质中的成功应用表明，将它们整合到工业过程中是一个可行的解决方案。食品行业应考虑采用这些经过表征的降解生物胺的菌株作为专门的起始菌株，以确保产品的安全性和质量。此外，从植物、动物和微生物中提取的DAO（脱胺酶）的应用代表了一种减少食品和/或饮料产品中生物胺浓度的新生物技术方法[95]。最近，Costa-Catala等人[95]报告称，猪DAO对尸胺和腐胺的解毒有轻微偏好。另一方面，Yarrowia lipolytica中的微生物DAO对酪胺的活性最高，其次是组胺、腐胺和尸胺。就植物来源而言，鹰嘴豆芽表现出最高的DAO活性，突显了它们作为功能性食品成分在管理组胺不耐受方面的作用[96]。在手工啤酒行业中应用DAO可能是一个有前景的研究领域；特别是考虑到Kettner等人[97]报告称，Glutamicibacter halophytocola（DAO-GH）即使在具有挑战性的条件下（包括略微酸性的pH值和低温，这些条件是啤酒发酵过程中的典型特征）也能显著降解组胺。有趣的是，DAO-GH在冷藏储存条件下和12°C的奶酪成熟过程中有效降低了奶中的组胺含量，显示出其操作上的多功能性。此外，该酶在三个月内的稳定性证明了其在实际食品系统中的工业可行性[97]。这种方法可能在食品安全方面取得突破，使手工啤酒能够被更广泛的消费者接受，包括敏感人群或饮食受限的人。除此之外，结果表明，行业采用的标准卫生措施可能不足以控制脱羧微生物。因此，作者在手工啤酒厂的多个地点检测到了具有脱羧能力的乳酸菌菌株，包括用于发酵和成熟过程的圆柱锥形容器的外表面、填充机和灌装线的表面[70]，这是由于清洁和消毒程序不当所致。在危害分析与关键控制点（HACCP）系统的框架下，原材料的选择、煮沸和发酵是酿造过程的主要关键控制点[98]；例如，基于微生物计数或脱羧酶基因的存在建立“关键限值”，以及培训酿酒师了解卫生和消毒预防措施的重要性，可以显著提高手工啤酒的安全性和质量[99]。与此相关的是，作者表明有效实施HACCP系统可以降低啤酒中的血管活性胺浓度[100]。因此，提高酿酒师对这些含氮化合物的认识对于在手工啤酒酿造过程中实施更严格的卫生协议至关重要。
3.5. 食品-啤酒搭配和生物胺积累：风险评估
根据多项研究，组胺和酪胺是最危险的胺类，前者影响突触反应，而两者都在血压控制中起作用[18]、[101]。事实上，酪胺和组胺经常与食物中毒相关，分别导致“奶酪反应”和“鲱鱼毒素食物中毒”[13]。然而，对于这些分子没有法定限制，除了渔业产品中的组胺（新鲜产品的阈值为200毫克/千克，腌制产品的阈值为400毫克/千克）[102]。尽管缺乏针对生物胺的具体法规，但普遍认为需要降低食品中的生物胺浓度。因此，国际机构和文献提出了食品和酒精饮料的限值建议。关于后者，建议的限值见表1。值得注意的是，这些建议的浓度远低于其他食品（如奶酪或肉类产品）的建议限值，后者以其富含这些化合物而闻名。文献建议不同的食品中生物胺的限值，例如食品中的组胺为100毫克/千克，奶酪中的酪胺、组胺、腐胺和尸胺总和为900毫克/千克[17]。Rauscher-Gabernig等人[103]建议奶酪中尸胺的最大耐受水平为540毫克/千克，腐胺为180毫克/千克。最近，Dankar等人[17]和Natrella等人[104]研究了传统奶酪中生物胺的发生和分布；不同奶酪类别之间的生物胺含量差异很大，反映了牛奶来源、成熟程度和奶酪制作条件的差异。特别是，牛硬质奶酪和非牛奶酪的总生物胺浓度分别高达5700毫克/千克和6700毫克/千克，其中酪胺最为丰富，通常超过1000毫克/千克。同样，肉类产品也表现出高度异质性。正如预期的那样，原始样品中的微生物来源生物胺含量较低，而加工肉类产品则较高。在后者中，据报道发酵香肠和巴西商业萨拉米香肠中的酪胺和组胺含量高达500毫克/千克[105]。此外，还提出了一种基于腐胺、尸胺、酪胺和组胺总和计算的生物胺指数（BAI），用于区分优质、可接受和变质的产品[105]。然而，总体而言，欧洲食品安全局（EFSA）建议健康个体的组胺摄入量< 50毫克/餐，酪胺的摄入量< 600毫克/餐。对于服用第三代和经典MAOI药物的患者，EFSA建议的酪胺摄入量分别更低，分别为50毫克/餐和6毫克/餐[15]。因此，评估单餐中的饮食模式和食品-啤酒组合对于估计生物胺的累积摄入量及其在现实饮食场景中的协同效应至关重要[105]。为此，通过考虑两种常与啤酒一起消费的标准化食品类型及其生物胺水平，开发了暴露情景。选择奶酪和肉类产品是因为它们经常与啤酒一起消费[106]、[107]。啤酒、奶酪和肉类的搭配非常成功，因为像马苏里拉奶酪和戈尔贡佐拉奶酪这样的奶酪可以减少啤酒的收敛性，而帕尔马干酪则被认为可以降低啤酒产品的苦味和麦芽味。在肉类方面，淡色啤酒通常与白肉、红肉和家禽搭配[107]。份量大小是根据意大利国家营养指南制定的，而胺类物质的浓度则是根据文献数据得出的，从而能够真实反映消费者的饮食习惯和潜在的毒理学风险。特别讨论了两种不同的饮食场景：i) “高风险场景”，将非传统啤酒与硬质奶酪和加工肉类搭配，这些食品通常含有较高的血管活性胺类物质，评估了一餐中组胺和酪胺的含量；ii) “低风险场景”，将拉格啤酒与菲拉塔奶酪和生肉搭配，这种饮食方式摄入的血管活性胺类物质较少。在第一种场景中，一份330毫升的大麦酒（Barleywine_3，酪胺含量为259.75毫克/升）与一份50克的硬质奶酪（Castelmagno，酪胺含量为2618.10毫克/千克）[104]以及一份50克的发酵香肠（酪胺含量为510毫克/千克）[105]搭配后，导致每餐酪胺摄入量为242毫克，超过了欧洲食品安全局（EFSA）为敏感消费者建议的限值。同样，一份酸啤酒（Sour&Fruit_9，组胺含量为25.15毫克/升）与一份发酵奶酪（帕尔马干酪，组胺含量为1662毫克/千克）[104]和一份肉（发酵香肠，组胺含量为515毫克/千克）[105]搭配后，每餐组胺摄入量为117毫克，也超过了EFSA为健康消费者建议的安全限值。另一方面，在“低风险场景”中，将拉格啤酒（Lager_3和Lager_4）与新鲜牛肉或鸡肉（100克，组胺和酪胺含量低于1毫克/千克）[105]以及菲拉塔奶酪（Caciocavallo，100克，组胺和酪胺含量低于20毫克/千克）[104]搭配，除非是对组胺不耐受的人，否则不会引起毒性反应，每餐组胺和酪胺的摄入量将低于3毫克。这些结果强调了提高消费者意识对于促进明智饮食选择的重要性。未来的研究不应仅限于啤酒与食物的搭配，还应探讨不同烹饪体系中胺类物质的协同效应。扩大研究范围，包括其他常见的食物组合，将提供更全面的胺类物质摄入情况，并增强消费者对潜在健康风险的认识。
4. 结论
在市场上采集的113种精酿啤酒样本中检测到了7种单独的胺类物质（及其总浓度）。研究目的有两个：一是确定不同酿造风格下的胺类物质谱型，二是评估使用非传统原料对其最终浓度的影响。结果显示，胺类物质的总含量差异很大，其中酪胺、色胺、腐胺和尸胺是主要检测到的成分。尽管组胺的含量较低，但对组胺不耐受的人仍需注意精酿啤酒的摄入，因为86%的样本中的组胺含量超过了可检测水平。此外，35%的样本对组胺代谢能力较弱的人可能存在健康风险，其总胺类物质含量超过20毫克/升。还有10%的啤酒总胺类物质含量超过50毫克/升，即使对健康人也可能引起毒性反应。原材料在这些化合物的积累中起着关键作用，尤其是在斯托特啤酒和酸啤酒中，因为在酿造过程中添加了非传统原料（如水果制品、巧克力、咖啡、可可等）。因此，小型啤酒厂应注意原材料的选择，特别是其质量以及与非传统原料相关的微生物群。此外，由于野生啤酒、大麦酒、瓶装再发酵啤酒和酸啤酒显示出最高的胺类物质含量，这与微生物污染有关，因此需要更加关注发酵菌种的选择和啤酒厂的卫生条件。需要建立有效的食品安全管理体系，加强外部检测，并实施良好的生产规范（GMP），以减少细菌污染的可能性，确保产品不会对消费者构成任何安全风险，并符合所需的质量标准。另一方面，研究人员应致力于从啤酒中分离出能够降解胺类物质的微生物，以降低胺类物质含量，同时不影响其感官特性。或者，使用从多种来源提取的酶——二胺氧化酶（DAO）是一种有前景的生物技术手段来减轻胺类物质的影响。然而，这些酶处理的工业可行性仍有待进一步研究，因为精酿条件的高度变异性可能会影响DAO的稳定性。最后，评估储存过程中的胺类物质稳定性是确保产品在整个保质期内安全的关键。
作者贡献声明：
Mariana Miccolis：撰写——原始草稿、方法学、调查、数据分析、概念化。
Michela Pia Totaro：撰写——审阅与编辑。
Francesco Caponio：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。
Corina Maria Șutea：撰写——审阅与编辑、数据分析。
Giuseppe Natrella：撰写——审阅与编辑、验证、监督、方法学、数据分析、概念化。
Carmine Summo：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、资金获取、数据分析。
Teodora Emilia Coldea：撰写——审阅与编辑、监督。
Antonella Pasqualone：撰写——审阅与编辑、可视化、验证。
未引用参考文献[59]。
数据可用性：
本研究期间生成和/或分析的数据集可向相应作者索取。
利益冲突声明：
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
资助：
本研究得到了2022年4月9日部长令第352号的支持，该法令基于PNRR计划——由欧盟资助——NextGenerationEU——任务4“教育与研究”，组成部分2“从研究到企业”——投资3.3“引入满足企业创新需求的创新博士学位并促进企业招聘研究人员”，项目编号H9l122000480007。
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