苏达贝·戈德西（Soudabeh Ghodsi）、萨哈尔·戈利普尔（Sahar Gholipour）、米娜·谢赫（Mina Sheikh）、穆罕默德梅赫迪·梅赫迪普尔（Mohammadmehdi Mehdipour）、马纳兹·尼卡恩（Mahnaz Nikaeen）
伊朗伊斯法罕医科大学健康学院环境健康工程系
**摘要**
背景
抗微生物药物耐药性微生物（AMRMs）的存在，尤其是同时对消毒剂和抗菌药物具有耐药性的微生物，在新生儿重症监护病房（NICUs）中构成了重大挑战。这些耐药微生物会降低治疗效果，阻碍感染预防策略的实施，并影响新生儿的健康结果。本研究旨在探讨NICU环境中具有共选择机制的AMRMs的流行情况及其特征，并在“同一健康”（One Health）框架下评估其对婴儿安全的潜在影响。
**方法**
从伊朗伊斯法罕两家主要医院的NICUs收集了32份空气、表面和饮用水分配系统（DWDS）生物膜样本，检测其中细菌和真菌的存在及其对抗微生物药物和消毒剂的耐药性。随后使用Sanger测序技术对AMRMs进行了鉴定。
**结果**
44%的样本中检测到了耐抗生素细菌（ARB），其中DWDS生物膜中的耐药率最高。从含有选择性抗生素的培养基中分离出的ARB中，对β-内酰胺类抗生素的耐药率最高。所有来自空气和表面样本的ARB至少对四种消毒剂具有耐药性，50%的DWDS分离株在0.5 ppm浓度的氯气中暴露30分钟后仍能存活。最常检测到的耐药细菌包括芽孢杆菌属（Bacillus spp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）和短小单胞菌属（Brevundimonas spp.）。机会性真菌在空气样本中未检出，但在排风口表面（100%）和DWDS生物膜中频繁出现，尽管其对抗真菌药物的耐药性较低，但仍表现出高度的消毒剂耐药性。
**结论**
研究结果强调了AMRMs在NICUs中的严重风险，突显了在这些高风险环境中全面监测抗菌药物耐药性的紧迫性。此外，结果表明需要基于证据选择和使用消毒剂，以有效消除临床环境中的耐药病原体。
**引言**
尽管医疗治疗和传染病预防方面取得了显著进展，但医疗相关感染（HAIs）仍是一个严重的全球健康问题[1]。这一问题在新生儿重症监护病房（NICUs）尤为突出，由于新生儿的脆弱性，HAIs的发生率仍然很高[2]。新生儿尤其是早产儿或低出生体重的婴儿免疫系统不成熟，使他们极易感染。此外，频繁进行导管插入、机械通气和肠外营养等侵入性操作进一步增加了感染风险[1][3]。NICUs中的HAIs显著增加了新生儿的发病率和死亡率，延长了住院时间，增加了医疗成本，并导致不良的长期发育后果[1][4]。这些感染导致了约33%的新生儿死亡和近50%的5岁以下儿童死亡[2]。根据世界卫生组织（WHO）的数据，HAIs每年导致超过55万例新生儿死亡，低收入和中等收入国家的发病率是高收入国家的3到20倍[5][6]。多种微生物与新生儿HAIs有关，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。这些微生物的多样性和耐药性特征进一步复杂化了NICU环境中的感染控制和治疗策略[1][2]。换句话说，抗微生物药物耐药性病原体的出现和传播加剧了新生儿感染的风险，对有效治疗和感染控制构成了严重威胁[2]。2019年，耐药性疾病导致全球约127万人直接死亡，如果当前趋势持续下去，预计到2050年这一数字将上升至每年1000万[7]。鉴于HAIs带来的巨大临床和经济负担，特别是在NICUs中减少其发生率必须成为全球医疗保健的优先事项[8]。
国际上为控制这些感染而采取的措施主要集中在实施针对性的预防和控制方案上。在这方面，医院环境（包括空气、水和表面）作为医院内感染病原体的储存库和传播媒介起着关键作用[9][10]。因此，减少医院环境中的微生物负荷并有效灭活病原体或机会性微生物对于降低新生儿中的HAIs发生率至关重要。空气可能是NICUs中病原体传播的重要来源。生物气溶胶（包含细菌、真菌和病毒）可通过通风系统、人类活动和医疗程序进入NICU环境[11][12]。这些空气中的颗粒可能被婴儿吸入或沉积在表面上，从而通过间接传播途径导致感染[13][14]。同样，医院供水系统也是微生物污染的另一个关键来源。这些系统可能形成生物膜，生物膜是附着在管道内表面的复杂微生物群落，为细菌和真菌的生存和繁殖提供了有利条件。证据表明，医院供水系统与约21.6%的机会性病原体感染有关[15][16]。例如，从NICU水阀中分离出的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株与从感染患者中分离出的菌株在基因上完全相同，这突显了环境储存库在新生儿感染传播中的直接作用[17]。
鉴于医院环境在HAIs传播中的关键作用，建立和执行全面的环境卫生政策至关重要，包括常规使用有效的清洁剂和消毒剂。然而，一个日益严重的挑战是微生物同时对抗菌药物和常用消毒剂具有耐药性。这种双重耐药性降低了标准消毒程序的效果，导致耐药病原体在医院环境中持续存在[18][19][20]。这些微生物在医院环境中的持续存在对患者安全构成严重威胁，削弱了感染预防策略，并导致不良的临床结果[19]。这凸显了需要制定协调一致的行动计划来应对NICUs中的抗菌药物耐药性（AMR），该计划应遵循“同一健康”框架的原则。在“同一健康”框架下，环境监测成为抗菌药物耐药性监测的重要组成部分。环境监测有助于识别潜在的病原体储存库和传播途径，从而及时采取有针对性的感染控制措施[20][21]。
鉴于NICU环境中AMR日益引起公共卫生关注以及全球对新生儿护理的重视，本研究旨在调查NICU环境中AMRMs的存在和耐药性特征。此外，还对耐药分离株进行了进一步表征，以评估其潜在的健康风险，从而更清楚地了解AMR对NICUs中微生物的威胁。
**材料与方法**
**样本收集与准备**
本研究调查了伊朗伊斯法罕医科大学所属两家大型医院四个NICU环境中的微生物污染情况。在六个月内，共收集了8份空气样本、12份表面样本（5份来自床铺和托盘桌，7份来自供暖、通风和空调（HVAC）系统排风口）以及12份来自饮用水分配系统（DWDS）的生物膜样本。采样在早晨清洁和消毒程序后进行。表面和空气样本在两次不同的采样时间点采集，而HVAC和DWDS生物膜样本仅采集一次。空气和DWDS生物膜样本被分析其收集到的细菌和真菌的抗菌药物和消毒剂耐药性特征。然而，来自床铺和托盘桌的表面样本仅检测细菌的耐药性，而来自HVAC系统排风口的样本仅检测真菌的耐药性。由于患者和工作人员与床铺和托盘桌表面的频繁接触，这些表面很可能携带抗微生物药物耐药细菌。由于这些表面较干燥，因此无法在这些表面上培养真菌，因此从HVAC表面采集了真菌样本。HVAC系统可能是机会性真菌（如曲霉菌）生长的有利环境，高湿度以及灰尘和有机物的存在为真菌生长提供了有利条件[22][23]。空气样本使用全玻璃撞击器（AGI）采集，每个撞击器含有10–12毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）[24]。采样在距离地面1.5米的高度进行，共收集了约2400升空气。DWDS生物膜的采集遵循美国疾病控制与预防中心（CDC）的指南[25]，使用达克龙棉签擦拭水龙头内表面。同样，使用预湿润的达克龙棉签从患者床铺、托盘桌和HVAC系统排风口采集表面样本[24]。每个棉签放入含有PBS的试管中（4毫升）。所有样本均保存在冷藏箱中，并迅速运输到实验室进行后续微生物分析。从生物膜和表面样本中分离微生物细胞到含有PBS的试管中是通过超声振动和涡流实现的。对于空气样本，将AGI中的PBS转移到灭菌试管中用于微生物分析。
**耐药细菌的检测**
为了检测耐抗生素细菌，将样本涂布在添加了四种常规抗生素的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上，这些抗生素由临床和实验室标准协会（CLSI）归类为A组：β-内酰胺类的氨苄西林（32 μg/mL）和头孢他啶（32 μg/mL）、氨基糖苷类的庆大霉素（16 μg/mL）以及四环素类的四环素（16 μg/mL）。平板在35°C下培养48–72小时。在含抗生素培养基上生长的形态相同的菌落重新培养在含有相同抗生素的TSA上以确认耐药性。随后，对ARB分离株进行消毒剂耐药性测试。使用煮沸法从细菌分离株中提取DNA，然后通过PCR检测选定的抗生素耐药基因（ARGs）的存在。本研究使用的引物组见补充材料（表S1）。
**ARB的消毒剂耐药性**
使用Kirby-Bauer纸片扩散法研究了从空气和表面样本中分离出的ARB对不同活性成分（如季铵化合物（QACs）、酒精、双胍类、氯和过氧化氢）的消毒剂耐药性。测试的消毒剂包括次氯酸钠（1%和2%）、过氧化氢以及伊朗医院常用的六种其他商业产品。本研究中使用的消毒剂特性见表S2。将浓度相当于0.5 McFarland的ARB分离株涂布在Mueller-Hinton琼脂上，并将浸有消毒剂的纸片放置在琼脂表面。培养后测量生长抑制区的直径，结果分为敏感（≥20毫米）、中间（15–19毫米）和耐药（≤14毫米）[26]。所有消毒剂分析均重复进行，蒸馏水和苯酚分别作为阴性和阳性对照。
**评估DWDS生物膜中ARB的氯耐药性**
从DWDS生物膜中分离出的ARB制备了0.5 McFarland浓度的悬浮液。细菌悬浮液暴露于不同浓度的游离氯（0、0.5、1.5和4 ppm）中5分钟和30分钟。暴露后，使用硫代硫酸钠中和残留的氯。将暴露后的样本重复接种在TSA上并在37°C下培养24至48小时。计数菌落以评估耐氯细菌的存活情况。所有步骤均包括阴性对照（蒸馏水）和阳性对照（未暴露于氯）。
**耐药细菌的分子鉴定**
疑似为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）的耐药菌落使用特定的引物组通过PCR进行检测[27][28]。其他同时对多种抗生素和至少三种浓度高于0.5 ppm的消毒剂具有耐药性的细菌分离株通过16S rRNA基因的Sanger测序进行鉴定[29]。所得序列使用NCBI Nucleotide BLAST工具进行分析。基于≥99%的序列一致性在属和种水平上进行鉴定，提交到GenBank的序列及其登录号列在表S3中。
**真菌的检测与鉴定**
真菌污染的检测方法如2.1节所述，然后将样本培养在Sabouraud葡萄糖琼脂上并在25±1°C下培养。所有平板培养7天，并从第三天开始每天检查。为了获得纯培养物，我们从新鲜培养基上形态相同的菌落中制备了亚培养物。为了鉴定，根据形态特征将真菌分离株分类到属水平，并使用分子方法将其分类到种水平。使用酚-氯仿方法从真菌分离株中提取DNA。通过PCR扩增了从真菌中提取的DNA的内部转录间隔区（ITS）片段。此外，还扩增了β-微管蛋白基因片段以鉴定曲霉菌属物种。用于检测真菌的引物对列在表S1中。PCR后，对扩增片段进行了DNA测序，并使用BLAST分析所得序列，如细菌鉴定所述，并将结果存入GenBank，登录号为：PP923762、PP923765-66、PP923772。
分离出的真菌对药物和消毒剂的抗性
根据CLSI M38-A2指南对真菌分离株进行了抗真菌敏感性测试（AFST）。曲霉菌分离株针对四种药物进行了测试，包括伊曲康唑（ITC）、两性霉素B（AmB）、伏立康唑（VRC）和卡泊芬净（CAS），而毛霉菌分离株则针对ITC、AmB、伊索康唑（ISC）和泊沙康唑（PSC）进行了测试。除CAS外，所有药物的最小抑制浓度（MIC）均在0.0156–8 μg/mL范围内确定。对于CAS，最小有效浓度（MEC）在0.0312–16 μg/mL范围内确定。作为质量控制，本研究中使用了克鲁塞念珠菌（Candida krusei，ATCC 6258）和副丝孢酵母（Candida parapsilosis，ATCC 22019）作为参考菌株。由于大多数霉菌（曲霉菌属除外）没有临床折点，因此使用了流行病学临界值（ECVs）来区分野生型和耐药菌株。然后按照第2.2.2节中描述的方法，检查了曲霉菌属和毛霉菌属对消毒剂的抗性。
统计分析
在本研究中，不同样本中AMRMs的存在/缺失结果以百分比计算。所有计算和图表制作均使用Microsoft Excel 2019（美国华盛顿州雷德蒙德）完成。
结果与讨论
新生儿重症监护病房（NICU）中耐药细菌的发生
抗生素耐药性
抗生素耐药性是有效治疗新生儿感染的主要风险因素。据报道，每增加一种抗生素耐药性，婴儿死亡的风险就会增加27% [30]。在本研究中，从NICU环境中收集的样本显示44%的样本存在ARB，其中对氨苄西林（36%）和头孢他啶（36%）的耐药性最高。庆大霉素和四环素的耐药率较低，分别为24%和20%（表1）。结果表明，超过50%的样本对多种抗生素具有耐药性，20%的空气和生物膜样本对所有测试的抗生素都具有耐药性（图1）。我们从NICU的各种环境样本中分离出了45株ARB，其中生物膜样本中的检出频率最高（26株），表面样本中的检出频率最低（5株）。存在于排水系统（DWDS）生物膜中的ARB可以释放到水流中。患者可能通过直接接触受污染的水（如吸入气溶胶化的飞沫或瓶装牛奶制备过程）而感染。此外，间接传播也可能通过最终阶段器械消毒过程中不当处理的医疗设备发生 [31]。NICU中空气和表面样本中ARB的较低流行率可能与有效的通风和频繁的表面消毒有关。
表1. 不同NICU环境中检测到ARB阳性样本的频率。
样本类型（样本数量）
氨苄西林耐药性
头孢他啶耐药性
庆大霉素耐药性
四环素耐药性
总抗生素耐药性
空气（8）
37.5% (3)
37.5% (3)
12.5% (1)
25% (2)
50% (4)
表面（5）
40% (2)
40% (2)
20% (1)
0% (0)
40% (2)
DWDS生物膜（12）
33% (4)
33% (4)
33% (4)
25% (3)
42% (5)
总计（25）
36% (9)
36% (9)
24% (6)
20% (5)
44% (11)
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图1. 不同NICU环境样本中对多种抗生素的耐药频率。
在含有选择性抗生素的培养基上生长的分离出的ARB中，对β-内酰胺类抗生素（特别是氨苄西林和头孢他啶）的耐药性最高。相反，对四环素的耐药性最低，且表面样本中没有发现四环素耐药的分离株。ARB的流行受到医院环境中使用抗菌剂的选择压力的显著影响。β-内酰胺类抗生素占许多地区抗生素处方的50%–70%，对细菌群体施加了巨大的选择压力 [32]。正如本研究中所指出的，对头孢他啶和氨苄西林等β-内酰胺类抗生素的耐药性在细菌分离株中普遍存在。β-内酰胺类抗生素对于治疗严重感染（如血流感染、尿路感染和肺炎）至关重要，因此耐药性对患者预后构成重大威胁 [33]。此外，我们的研究还发现24%的分离株对庆大霉素具有耐药性。尽管像庆大霉素这样的氨基糖苷类在社区环境中使用较少，但它们仍被应用于医院和兽医实践。此外，环境储库中存在氨基糖苷类耐药基因可能有助于在医院环境中检测到庆大霉素耐药的ARB [15]，[34]。
NICU环境中对氨苄西林和庆大霉素耐药的细菌的发生是一个严重问题。这些抗生素被推荐用于治疗0-59天大的新生儿和婴儿的败血症感染 [35]。由于氨苄西林和庆大霉素具有广谱覆盖范围和对常见医院获得性感染病原体的协同作用，它们是NICU中的关键一线疗法 [35]。氨苄西林能有效针对革兰氏阳性细菌（如B组链球菌和肠球菌）以及某些革兰氏阴性菌，而庆大霉素对大肠杆菌、克雷伯菌和铜绿假单胞菌等革兰氏阴性病原体非常有效，这些病原体在医院获得性感染中很常见。它们的组合可以快速杀死细菌，对于管理免疫系统不成熟的新生儿的危及生命的败血症至关重要 [36]。NICU中氨苄西林和庆大霉素耐药性的增加引发了人们对这些一线治疗药物耐药性传播的担忧，需要寻找替代治疗方案。一项涉及七个低收入和中等收入国家36,000多名婴儿的研究发现，60%的细菌分离株对氨苄西林和庆大霉素都具有耐药性 [35]，[37]。新生儿由于免疫系统不发达且经常接受侵入性操作，因此面临更高的医院获得性感染风险，尤其是由ARB引起的感染 [35]，[36]。
消毒剂耐药性
医院环境中细菌同时对抗生素和消毒剂的耐药性是感染控制的一个关键问题。抗菌剂的滥用或过度使用，以及环境细菌（特别是在表面和水中形成生物膜的细菌）暴露于亚致死浓度的氯和其他消毒剂，促进了具有多重耐药机制的菌株的选择，从而在这些环境中促进了AMR的发展 [38]，[39]。图2显示了显示对表面消毒剂和氯耐药的ARB的频率。在本研究中，从NICU的空气和表面样本中分离出的所有ARB至少对四种和六种消毒剂具有耐药性（图2.A）。存在于NICU空气中的细菌可以通过空气传播AMR感染，也可以通过沉积在表面上传播 [40]。空气样本中ARB的最高耐药性是对SI（100%），其次是ST、SHP、SHI和次氯酸钠（SH）（分别为1%和2%（93%）（图2.B）。尽管从表面样本中分离出的ARB数量远低于空气样本，但这些ARB对消毒剂具有高耐药性，其中17%的ARB对所有测试的消毒剂都具有耐药性。此外，所有表面ARB都对三种商用季铵化合物（ST、VS、SHI）以及SH1%和SH2%具有耐药性。值得注意的是，虽然所有空气ARB都对过氧化氢（HP）敏感，但83%的表面ARB对其具有耐药性。表面ARB对消毒剂的高耐药性可能是由于消毒剂的过度使用或亚致死浓度，或者由于生物膜的形成，其中细胞被细胞外聚合物物质（EPS）保护 [38]。另一方面，空气和表面ARB对次氯酸钠的高耐药性可能是由于COVID-19大流行期间其在医疗保健环境中的使用量大幅增加 [38]。此外，消毒剂配方中活性成分的不同浓度可能导致对含季铵化合物的不同耐药模式。
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图2. ARB对消毒剂的耐药性 (A) ARB表现出多重消毒剂耐药性的频率分布，(B) ARB对表面消毒剂的耐药频率，(C) DWDS生物膜ARB对不同浓度氯的耐药频率。
在DWDS生物膜ARB中，一半的分离株对氯具有耐药性，能够耐受0.5 ppm的浓度30分钟（图2.C）。尽管较高浓度的氯减少了ARB的数量，但我们的结果显示即使在4 ppm的浓度下，仍有8%的生物膜耐药细菌存活。DWDS中的生物膜为AMRMs的持续存在创造了有利环境，成为ARGs传播的关键场所 [15]。在DWDS中长时间氯化会促进耐氯细菌的生长。氯暴露可能触发外排泵和耐药基因操纵子的激活，并导致基因突变，从而增加抗生素耐药性 [16]。我们的结果证明了抗生素和消毒剂之间的同时耐药性，这对公共卫生尤其令人担忧，特别是在NICU环境中。这种耐药性不仅降低了感染预防策略的有效性，还增加了将多重耐药病原体传播给新生儿的风险。这些细菌在生物膜中的积累可以促进水平基因转移（HGT）和耐药菌株在医院环境中的进一步传播 [15]，[41]。
耐药细菌的表征
表2展示了同时对抗生素和消毒剂具有耐药性的细菌属的表征。在NICU环境中鉴定出的细菌属于芽孢杆菌门（Bacillus spp.、Staphylococcus spp.、Priestia spp.）、变形菌门（Brevundimonas spp.、Sphingomonas sp.、Enterobacter spp.、Stenotrophomonas sp.、Pseudomonas spp.）和放线菌门（Brevibacterium sp.）。芽孢杆菌是从空气、生物膜和表面样本中最常分离出的属，对这两种抗生素和消毒剂都具有高耐药性。Brevundimonas和Pseudomonas在空气和生物膜样本中被检测到，而Staphylococcus在空气和表面样本中被检测到。这些细菌在不同环境中的存在表明它们无处不在，可能通过NICU中的多种环境途径对新生儿构成风险。Brevundimonas在DWDS生物膜样本中非常普遍。其他变形菌门细菌，包括Sphingomonas、Stenotrophomonas和Pseudomonas也被检测到，这与先前的研究一致，这些细菌被认为是医院氯化DWDS中的主要细菌 [42]，[43]。
表2. 从不同环境中分离出的细菌属的抗生素和消毒剂耐药模式。
细菌（分离株数量）
检测位置
检测环境
抗生素耐药性*
消毒剂耐药性
医院1
医院2
空气
表面
生物膜
氨苄西林
头孢他啶
庆大霉素
四环素
表面消毒剂（数量）
**氯（最高浓度）
Bacillus spp. (5)
✓✓✓✓✓✓✓✓✓
-8（空气），9（表面）
4 ppm
Staphylococcus spp. (7)
✓✓✓✓✓
-✓✓✓
-8（空气），6（表面）
-Brevibacterium sp. (1)
-✓--
✓✓
----
0.5 ppm
Brevundimonas spp. (9)
✓✓✓
-✓-
✓✓
-8（空气）
1.5 ppm
Sphingomonas sp. (1)
-✓--
✓✓
----
0.5 ppm
Enterobacter spp. (2)
-✓--
✓✓
-✓--
1.5 ppm
Stenotrophomonas sp. (1)
-✓--
✓-
✓---
1.5 ppm
Pseudomonas spp. (3)
***✓✓✓
-✓✓✓
-✓
7（空气）
1.5 ppm
Priestia spp. (3)
✓✓✓
--✓--
✓
8（空气）
-⁎
从含有选择性抗生素的培养基中回收。
⁎⁎
细菌显示耐药性的消毒剂数量
⁎⁎⁎
对氨苄西林和四环素具有固有耐药性的Pseudomonas spp.是从含有这些抗生素的平板中分离出来的，并进一步测试了它们的消毒剂耐药性和ARGs的存在。
来自芽孢杆菌门（Bacillus spp.、Staphylococcus spp. 和 Priestia spp.）的细菌具有过氧化氢酶活性，这种酶可以将H₂O₂分解为水和氧气，防止细胞损伤，从而在消毒剂耐药性测试中增强它们的耐药性 [44]。此外，Bacillus和Staphylococcus可以在表面形成生物膜，保护细胞免受损害。此外，像Bacillus spp.这样的产孢细菌复杂的细胞壁结构赋予了它们对消毒剂和防腐剂的固有耐药性 [45]。与我们的发现一致，Mirhoseini等人（2016）在伊朗伊斯法罕的医院空气中鉴定出Staphylococcus spp.和Bacillus spp.是主要的耐药菌种 [46]。有报道称环境暴露与Bacillus spp.引起的医院获得性感染有关 [47]，[48]。在荷兰，三名新生儿（其中一名死亡）的Bacillus cereus爆发与受污染的通风设备有关，该菌株在手动通风气球和工作人员的手上被检测到。该研究报道，对气球进行消毒结束了这次爆发 [48]。
在鉴定出的细菌中，Staphylococcus、Pseudomonas和Enterobacter被归类为ESKAPE病原体，被认为是多重耐药医院获得性感染中的高优先级病原体 [34]。多项关于NICU爆发的报告强调了环境因素在传播中的作用 [31]，[49]，[50]，[51]。在本研究中，Staphylococcus spp.在空气和表面样本中对三种测试的抗生素和超过六种测试的消毒剂具有耐药性。Staphylococcus spp.，特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA），显著增加了NICU新生儿的发病率和死亡率 [52]。尽管在本研究中未在环境样本中检测到MRSA，但观察到葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）对抗生素和消毒剂的高度耐药性，这引发了与其他葡萄球菌属相关的健康问题。从排水管道系统（DWDS）生物膜中分离出的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对1.5 ppm的氯具有抗性，表明其可能通过DWDS在新生儿重症监护室（NICUs）中传播。已有多起NICUs中的铜绿假单胞菌爆发事件与水龙头和洗手池中的生物膜形成、使用受污染的水制备奶粉和清洁奶瓶以及母婴洗手有关[31]。从DWDS生物膜中分离出的肠杆菌（Enterobacter）对两种抗生素具有抗性，并能耐受高达1.5 ppm的氯暴露。有报告记录了由肠杆菌属引起的医院内感染（HAIs）[53] [54]。在某NICU的一次爆发中，20名早产儿因新生儿保温箱表面受到污染而发生血流感染[53]。在另一次爆发中，23名新生儿出现了肠杆菌科细菌血症，最初是由于用于肝素制备的盐水受到污染，并通过医护人员的手部和环境表面进一步传播。目前的研究结果与以往基于医院的研究存在差异。例如，虽然我们在各种NICU环境中检测到了细菌，但最近在埃塞俄比亚NICUs进行的一项研究在血液样本中诊断出了耐抗生素的葡萄球菌、克雷伯菌（Klebsiella）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter），但在从NICUs收集的表面拭子中未检测到任何细菌[55]。相比之下，一项意大利研究发现NICU环境与新生儿感染之间存在直接关联，尤其是MRSA[56]。该研究指出，医院表面微生物群可能转移到呼吸道黏膜或其他深层组织[56]。此外，尽管我们在空气或表面样本中未检测到肠杆菌科细菌，但摩洛哥的一项研究报告称医院表面样本中以肠杆菌属和克雷伯菌属为主[57]。这种差异可能是由于我们采样医院采用了更好的个人卫生措施和更严格的表面清洁与消毒程序。在我们的研究中，我们观察到空气和表面检测到的细菌属之间存在相似性。表面上的细菌存在取决于空气质量，因为空气中的颗粒物最终会沉积在表面上，因此它们的存在与医疗环境中的空气通风效率密切相关。伊朗的一项先前研究也报告了ICUs和手术室中的鲍曼不动杆菌对某些抗生素类别具有抗性[58]。
抗生素耐药基因（ARGs），即使那些非致病性的、尤其是形成生物膜的菌株，也可以通过水平基因转移（HGT）将耐药基因传递给病原体，从而加剧抗生素耐药性的传播[15] [34]。在本研究中，我们在13个分离株中检测到了intI1基因，其中5个来自空气样本，8个来自DWDS生物膜样本，这些分离株主要属于变形菌门（Proteobacteria）。在87.5%的DWDS生物膜细菌（包括短小单胞菌（Brevundimonas）和肠杆菌）中，intI1与aac(6′)-Ib-cr和sul1共存；在铜绿假单胞菌分离株中，intI1与sul1共存。intI1基因促进了多种耐药机制的积累，导致多重耐药菌株的出现[59]。在铜绿假单胞菌和肠杆菌属分离株中检测到intI1基因，突显了通过水传播导致多重耐药医院内感染的风险。尽管耐β-内酰胺类抗生素的ARB（耐抗生素细菌）普遍存在，但这些分离株中未检测到β-内酰胺酶基因blaCTX-M和blaTEM。同样，也没有在任何耐四环素的分离株中检测到tetW基因。由于多个基因可能赋予对特定抗生素类别的耐药性，因此未检测到的ARGs可能是由于存在其他未检测的ARGs。此外，从DWDS生物膜中分离出的短小单胞菌中频繁检测到intI1基因，这表明其可能作为ARGs向致病菌株水平转移的储存库[59]。虽然短小单胞菌通常被认为临床意义不大，但已有报道指出它们与ESKAPE细菌（包括耐碳青霉烯类抗生素的细菌）的共感染，这引发了进一步的担忧[60]。因此，在医院感染预防策略中不应忽视短小单胞菌。
新生儿重症监护室（NICU）环境中真菌的出现新生儿免疫系统较弱，任何环境污染都可能导致严重感染。空气和通风系统、医疗设备、病房的不同表面以及水系统都可能成为真菌存在的来源，从而导致真菌孢子在NICU环境中的传播。本研究评估了空气、排风口表面和DWDS生物膜样本中的真菌污染情况。图3显示了样本中真菌检测的频率以及分离出的真菌种类频率。由于该地区的气候条件，空气样本中未观察到真菌生长，这可能是由于医院空气中真菌气溶胶浓度较低。伊斯法罕作为半干旱地区，空气湿度通常较低，不利于真菌作为气溶胶存活[61]。与其他研究结果一致，其他研究也报告在干旱和半干旱地区未检测到或仅检测到少量真菌气溶胶[61] [62] [63]。Ghazanfari等人（2022年）报告称，在伊朗23家医院的NICUs收集的样本中，只有2.9%的样本中含有真菌气溶胶[63]。相比之下，所有排风口表面样本均检测到真菌（见图3.B）。从排风口表面分离出的主要真菌种类包括青霉菌属（Penicillium spp.）（42%）、黄曲霉（Aspergillus flavus）（25%）、根霉菌（Rhizopus arrhizus）（8%）和枝孢菌属（Cladosporidium spp.）（8%）。Souza等人（2019年）报告称，在巴西一家NICU的暖通空调（HVAC）系统中，枝孢菌、青霉菌、黑曲霉和酵母是主要分离出的真菌[64]。HVAC系统可为机会性真菌（如青霉菌）的生长提供有利环境。高湿度以及灰尘和有机物的存在为真菌生长提供了条件[22] [23]。任何机械振动、气压变化或菌落干燥都可能导致孢子从表面脱落并进入气流，这对新生儿构成威胁[13]。黄曲霉和黑曲霉能够穿透宿主组织并引发严重的、广泛性的感染，包括侵袭性曲霉病。这些真菌的孢子可通过空气传播，婴儿吸入这些孢子会增加肺部和其他器官的真菌感染风险[65] [66]。尽管在较少样本中检测到根霉菌（R. arrhizus），但由于毛霉菌病病例的增加，其临床重要性日益凸显[64] [67]。
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图3. NICU环境中的真菌存在情况。(A) 阳性样本的频率。(B) 从排风口表面分离出的真菌种类频率。(C) 从DWDS生物膜中分离出的真菌种类频率。
在本研究中，从DWDS生物膜中收集的样本中有42%（5/12）显示存在真菌（见图3.C）。从生物膜中分离出的主要真菌种类为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）（60%）和枝孢菌属（Cladosporidium spp.）（40%）。2022年，世界卫生组织（WHO）将尖孢镰刀菌列为“高优先级组”真菌病原体清单（FPPL）的一部分，因为这些真菌对公共卫生构成重大威胁[68]。先前的研究已报告DWDS生物膜中存在青霉菌、尖孢镰刀菌、青霉菌和枝孢菌[17] [56] [69]。这些真菌能够在水系统中长期存活，甚至在医院环境中也是如此，并且有证据表明它们与某些医院内感染有关[69]。丝状真菌（如尖孢镰刀菌）的孢子可作为气溶胶释放到空气中，增加了空气传播的风险，并在免疫功能低下的患者（尤其是NICU婴儿）中引发严重的机会性感染[5]。此外，某些真菌种类（如尖孢镰刀菌和青霉菌）能产生霉菌毒素，对人类健康构成严重威胁[70] [71]。
真菌分离株对抗真菌药物和消毒剂的耐药性不断增加，降低了治疗效果并增加了其在医院环境中持续存在和传播的风险；因此，持续的环境监测对于识别污染源和评估感染控制措施的有效性至关重要[23]。在表面和DWDS生物膜样本中共鉴定出7株机会性真菌，包括青霉菌、根霉菌和尖孢镰刀菌，并对其抗真菌药物耐药性进行了研究。此外，还评估了表面分离株对消毒剂的耐药性。基于获得的最低抑菌浓度（MIC）和推荐的有效浓度（ECV）（见补充文件中的表S4），表3显示了NICU环境中真菌分离株的抗真菌敏感性谱。黄曲霉分离株对两性霉素B（AmB）表现出相对较高的耐药性（MIC = 4 µg/mL），高于推荐的ECV，但对伊曲康唑（ITC）和卡泊芬净（CAS）高度敏感。黑曲霉分离株也对两性霉素B（MIC 1-2 µg/mL）敏感，并且与黄曲霉一样，对ITC、VRC和CAS敏感。然而，有一株分离株对VRC的MIC较高（MIC = 1 µg/mL）。一项综述发现，环境中的黄曲霉和黑曲霉对两性霉素B的耐药率分别为15%和5%[72]。Kaur等人（2024年）报告称，从医院环境中分离出的黄曲霉和黑曲霉对唑类、CAS和两性霉素B敏感[73]。黄曲霉对两性霉素B的耐药性可能是环境真菌开始或存在耐药性的迹象，随着时间的推移会导致医院感染的增加。此外，测试的抗真菌药物的MIC值低于推荐的ECV，这幸运地表明其对测试药物的敏感性。
表3. 从医院环境中分离出的真菌对抗真菌药物和消毒剂的敏感性谱。
真菌种类 | 基于MIC/MEC的抗真菌耐药性（µg/mL） | 消毒剂耐药性（编号）
|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|
| 黄曲霉（A. flavus） | 4** | 0.015 | 60.5 | 0.00 | 39-- | 4** | 0.015 | 60.5 | 0.00 | 39-- | 4** | 0.015 | 60.5 | 0.00 | 39-- |
| 黑曲霉（A. niger） | 20.12 | 50.5 | 0.00 | 39-- | 4** | 10.12 | 50.5 | 0.00 | 39-- | 4** | 10.12 | 5 | 0.00 | 39-- |
| 根霉菌（R. arrhizus） | 20.12 | 5 | 0.12 | 5 | 0.5 | 9 | 0.06 | 25 | 2-1 | 未分析 | *** |
| 尖孢镰刀菌（F. oxysporum） | 40.12 | 5 | 2-1 | 未分析 | *** | ** | 4 | 0.12 | 5 | 2-1 | 未分析 | *** |
**注：**
- *表示真菌对某些消毒剂表现出耐药性。
- **表示MIC超过推荐的有效浓度（ECV）。
仅对表面样本进行了消毒剂敏感性评估。
两株尖孢镰刀菌的分离株对两性霉素B的MIC值在2至4 µg/mL之间，低于推荐的ECV。这些分离株也对ITC、VRC和PSC敏感。Mirhasani等人（2025年）对ICU和移植部门的水系统进行的研究表明，所有尖孢镰刀菌分离株都对两性霉素B、VRC和PSC敏感[69]。研究表明，不同株系的尖孢镰刀菌在基因上存在差异，一些株系天生更敏感，MIC较低，而另一些则天生对抗真菌药物（特别是唑类）具有抗性[74] [75]。高MIC（≥16 µg/mL，针对唑类）更可能与耐药临床分离株相关，而低MIC（≤2 µg/mL，针对两性霉素B）则常见于更敏感的、通常来自环境的株系，因此遗传因素和分离来源是影响抗真菌耐药性的两个因素[74] [76]。
消毒测试结果显示，两株黄曲霉分离株中有一株对四种消毒剂耐药，另一株对六种消毒剂耐药。两株黑曲霉分离株都对四种消毒剂耐药，根霉菌分离株对所有消毒剂耐药。在使用的9种消毒剂中，最高的耐药性与SH1%相关，最低的与SHI（季铵化合物，QACs）相关。与我们的结果类似，Mattei等人发现青霉菌属分离株对含有QAC结构的消毒剂敏感，而这些分离株对次氯酸钠（ITC）具有抗性[77]。
尽管除黄曲霉外的大多数分离株对两性霉素B表现出显著耐药性，但对所有表面真菌来说，对抗真菌药物的总体耐药性仍然较高。这可能增加丝状真菌在新生儿护理环境中的生长和孢子传播风险，这是一个严重的问题。
根据我们的研究结果，耐抗生素细菌（AMR细菌）和真菌在NICU环境中普遍存在，且存在程度不一。同时对抗生素和消毒剂具有耐药性的细菌非常普遍，而真菌的出现和耐药性较低。因此，作为有效感染预防和控制（IPC）策略的一部分，需要进行环境监测和管理，以防止AMR细菌在NICU及其脆弱患者中的传播。
- 在分离出的细菌菌株中，对β-内酰胺类抗生素的耐药性非常普遍。值得注意的是，同时检测到对氨苄西林（ampicillin）和庆大霉素（gentamicin）的耐药性，这引发了关于可能影响新生儿的耐药性病原体出现的严重担忧。这种模式表明存在环境传播的风险，并强调了制定针对性预防策略的紧迫性。观察到对次氯酸钠和大多数含有季铵化合物的商业消毒剂具有高度抗性。建议减少常规浓度下次氯酸钠的使用，并考虑重新配制商业消毒剂。由于芽孢杆菌和葡萄球菌对所有测试的消毒剂都表现出显著的抗性，建议将它们用作消毒剂生产中的质量控制菌株。在不同类型的样本中发现了对抗菌剂具有高度抗性的相似细菌属，这突显了环境各部分在传播这些细菌方面的相互作用。这也强调了环境作为通过多种途径将耐药细菌传播给新生儿的热点的重要性。因此，医院中的优化感染预防和控制（IPC）策略应涵盖环境的所有方面以降低这些风险。由于在饮用水分配系统（DWDS）的生物膜细菌中观察到了高度的氯抗性，同时DWDS中的真菌也确认具有氯抗性[45]，因此在医院DWDS中应用更高浓度的氯（例如超氯化处理）、使用热水、选择生物膜形成潜力最低的水管以及降低水中的可吸收有机碳水平可以帮助减少生物膜的形成。尽管在新生儿重症监护室（NICU）的空气中未检测到真菌，但它们存在于排风口中的存在令人担忧，因为其孢子可以轻易扩散到环境中并对新生儿造成严重感染。因此，定期清洁和消毒排风口表面是必要的。
结论
调查NICU中潜在的抗菌素耐药性（AMRMs）来源至关重要，因为患者在这里非常脆弱。在这项研究中，我们检测了细菌和真菌对各种NICU环境中的药物和消毒剂的抗性，包括空气、表面和DWDS。结果显示，同时对抗生素和消毒剂具有抗性的细菌非常普遍，其中DWDS生物膜中的分离株数量最多。最大的抗生素抗性出现在β-内酰胺类抗生素上，而最强的消毒剂抗性则出现在次氯酸钠上。某些具有高度AMR的细菌属（如葡萄球菌、假单胞菌和肠杆菌）的存在令人担忧。这些属已被记录为NICU感染暴发的重要病原体，它们的存在表明住院新生儿存在耐药性感染的潜在风险。在表面和DWDS生物膜样本中较少检测到真菌，而在空气中未检测到真菌。虽然真菌分离株对抗真菌药物没有表现出显著的抗性，但它们对测试的消毒剂表现出高度抗性。这些发现为NICU中环境AMR的流行病学提供了宝贵的见解，强调了制定强有力的、有针对性的感染控制协议的紧迫性。结果还支持开发基于证据的干预措施，以降低院内感染的风险并提高新生儿患者的安全性。
缩写
AFST：抗真菌敏感性测试；AGI：全玻璃撞击器；AmB：两性霉素B；AMR：抗菌素耐药性；AMRMs：抗菌素耐药微生物；ARB：抗生素耐药细菌；ARGs：抗生素耐药基因；CAS：卡泊芬净；CDC：疾病控制与预防中心；CLSI：临床和实验室标准协会；DWDS：饮用水分配系统；HAIs：医疗相关感染；HP：过氧化氢；HVAC：供暖、通风和空调；IPC：感染预防和控制；IS：Isept；ISC：伊索康唑；ITC：伊曲康唑；ITS：内部转录间隔区；MIC：最小抑制浓度；MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；NICUs：新生儿重症监护室；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PSC：泊沙康唑；QACs：季铵化合物；SH1% & SH2%：1%和2%次氯酸钠；SHI：CyaSept HI；SHP：CyaSept HP；SS：Septi Surface；ST：Septi Turbo；VRC：伏立康唑；VS：Venti Sept；WHO：世界卫生组织
伦理批准
该研究获得了国家医学研究发展研究所（IR.NIMAD.REC.1402.080）的伦理批准。
作者贡献
Soudabeh Ghodsi：调查、写作——初稿；Sahar Gholipour：调查、写作——初稿、可视化；Mina Sheikh：调查；Mohammadmehdi Mehdipour：调查；Mahnaz Nikaeen：监督、写作——审阅和编辑。
资金支持
这项工作得到了国家医学研究发展研究所（项目编号4010241）和伊斯法罕医科大学（项目编号3401246和1400436）的支持。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者使用ChatGPT来检查和改进手稿的英文语言。他们声明已根据需要审阅和编辑了内容，并对最终版本的手稿负全责。
