摘要
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评估化妆品成分透过人体皮肤的渗透性是开发外用制剂安全性和有效性的关键方面。然而，传统方法受到体外人体皮肤样本的有限可用性、供体间差异以及伦理限制的制约。在这种情况下，3D体外皮肤模型作为一种有前景的替代方案应运而生，尽管其预测能力仍需进一步验证。
**目的**
本研究旨在使用3D全层皮肤模型和体外人体皮肤样本，评估并比较儿茶素、表儿茶素、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）及其混合物的渗透情况。
**方法**
3D全层模型是通过在气液界面条件下培养真皮（HDF）和表皮（HaCaT）细胞系独立制备的。同时，将体外人体皮肤样本固定在Franz扩散细胞上。通过跨上皮电阻（TEER）监测3D全层模型的屏障形成情况，而渗透性则通过液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用技术（LC-DAD-MS）在两种模型中进行量化。细胞相容性通过MTT实验进行评估。
**结果**
3D共培养模型显示出TEER逐渐增加，最终稳定在200Ω·cm²以上，表明形成了功能性皮肤屏障。体外渗透研究能够检测到所有测试化合物，并揭示了受黄酮-3-醇和羟基肉桂酸结构特性显著影响的化合物特异性渗透谱。相比之下，体外人体皮肤样本的屏障更为严格，只有CGA和NCGA能够被量化，24小时后的渗透率为44%–50%，且显示出较高的皮肤保留率（63%–70%）。所有测试化合物均未引起细胞毒性作用。
**结论**
本研究表明，全层3D皮肤模型是一种稳健且符合伦理要求的化妆品成分筛选平台，它填补了传统2D单培养与体外人体皮肤样本之间的空白，并有助于减少皮肤吸收研究中的人体组织使用。
**摘要**
评估化妆品成分透过人体皮肤的渗透性是开发外用制剂安全性和有效性的关键方面。传统方法受限于体外人体皮肤样本的有限可用性、供体间差异及伦理限制。3D体外皮肤模型作为有前景的替代方案，但其预测能力仍需验证。本研究使用3D全层皮肤模型和体外人体皮肤样本，比较了儿茶素、表儿茶素、绿原酸、新绿原酸及其混合物的渗透情况。
**引言**
皮肤是人体的主要保护器官，可抵御化学、物理和生物压力，调节体温，防止紫外线（UV）辐射、机械损伤和微生物侵害，并支持免疫监视[1, 2]。在正常情况下，其抗氧化系统能控制活性氧（ROS）；但过度暴露于紫外线或化学物质会破坏这些防御机制，导致氧化应激和损伤[3, 4]。近年来，消费者越来越关注产品成分，植物来源的多酚因其抗氧化、抗炎和防紫外线作用而成为有前景的外用成分，符合对更可持续和生物基化妆品成分的需求[5]。最适用于皮肤应用的多酚是黄酮类（如儿茶素、表儿茶素）和酚酸类（如绿原酸、新绿原酸）[6]。例如，羟基肉桂酸（尤其是绿原酸和新绿原酸）能吸收UVA和UVB辐射，并通过激活Nrf2/抗氧化反应通路刺激抗氧化酶活性，从而预防氧化应激[7]。研究表明，浓度为6.25和25 μg/mL的绿原酸可有效抑制BJ细胞系（一种经典的UV诱导皮肤老化模型）中的光老化[8]，显著降低IL-1β和TNF-α水平[8]。作者证实CGA具有显著的抗炎作用，并显著降低ROS水平[8]。此外，CGA处理后细胞内ROS水平显著下降。流式细胞术分析显示CGA处理后细胞活力增强，凋亡减少。CGA还显著上调COL-3基因表达（该基因编码III型胶原蛋白的α1链），表明其有助于促进胶原蛋白生成和皮肤修复[8]。儿茶素类也能清除ROS并防止环境压力（如紫外线）引起的细胞外基质（ECM）降解[9]。例如，富含儿茶素和表儿茶素的阿萨姆茶提取物在HaCaT/HDF共培养和体外人体皮肤模型中表现出显著的光保护作用[10]。在UV诱导的共培养系统中，50 μg/mL浓度的提取物可保护细胞免受UV损伤，显著降低促炎细胞因子及MMP-1和MMP-9的表达，从而减轻炎症和ECM破坏[10]。体外皮肤模型显示该提取物能有效降低IL-6和MMP-1水平，同时促进透明质酸和I型前胶原肽的生成，表明其具有改善胶原蛋白合成的作用[10]。尽管多酚具有诸多生物活性，但存在稳定性差、溶解度低和皮肤渗透性受限等挑战，这些需克服以提高其在化妆品中的效果[5, 11]。角质层（SC）是控制化妆品成分渗透的主要屏障[12, 13]，其富含脂质的基质在调节活性成分扩散中起关键作用[14]。根据欧盟法规（EC）第1223/2009号，使用体外人体皮肤和体外验证模型评估皮肤渗透性对于确保外用化妆品的安全性至关重要[15]。传统2D细胞培养系统因简单、快速且成本低廉而被广泛用于初步筛选化妆品成分的毒性[16]，但它们缺乏天然皮肤的复杂结构和细胞间相互作用，无法准确模拟体内反应[16, 17]。相比之下，全层或3D共培养皮肤模型通过再现表皮-真皮相互作用和屏障特性，提供了更准确的皮肤渗透性和安全性预测，同时符合欧洲法规[16, 18]。这些模型通常通过将角质形成细胞层叠在含有胶原基水凝胶的真皮基质上来构建，该基质支持ECM分泌和粘附结构，有助于维持组织稳态和恢复天然微环境[19, 20]。3D模型在研究ECM动态、渗透性和毒性方面具有明显优势，但成本较高，需要特殊培养基和更长的培养时间[18, 19]。尽管体外人体皮肤样本因能保留完整组织结构和天然屏障功能而成为皮肤渗透研究的金标准[21]，但其可用性有限，储存过程中可能失去活力和酶活性[12, 22]。供体差异可能影响渗透结果（尤其是对于皮肤渗透性较低的化合物），但也能提供不同皮肤类型下配方性能的宝贵信息。每种模型都有其优缺点：2D培养具有成本效益和高通量筛选优势，3D重建皮肤模型提供更生理相关的机制信息，而体外皮肤模型提供最准确的渗透性和屏障研究数据，尽管存在实际限制。因此，本研究的主要目标是建立并比较评估体外3D人体皮肤共培养模型（HDF/HaCaT）和体外人体皮肤模型在多酚皮肤渗透性评估中的表现。通过TEER指标表征体外模型，并直接比较两种模型的渗透谱，以确定最能准确预测人体皮肤行为的模型。多酚渗透性通过LC-DAD-MS量化，细胞相容性通过MTT实验评估。
**材料与方法**
化学品和试剂
除非另有说明，所有化学品和塑料器皿均购自Sigma-Aldrich（德国Steinheim）。纯酚类化合物购自Sigma-Aldrich（德国Steinheim）：(+)-儿茶素（≥98%）；(−)-表儿茶素（≥98%）；绿原酸（欧洲药典参考标准）；新绿原酸（通过HPLC检测，来自Lonicera japonica，纯度≥98%）。细胞系购自美国典型培养收集中心（ATCC，美国）。细胞试剂购自Biowest（法国Nuaillé）、PAN-Biotech（德国Aidenbach）和Innoprot（西班牙Bizkaia, Derio）。LC-DAD-MS分析所用溶剂由Evonik Operations GmbH（德国Darmstadt）提供。所有实验均使用去离子水。
**3D体外皮肤共培养模型**
根据Rikken等人的方法[23]，并稍作修改，使用永生化非肿瘤性角质形成细胞（HaCaT，传代47–52）和人真皮成纤维细胞（HDF，传代7–9）构建3D体外皮肤共培养模型。这些细胞最初在标准培养条件（37°C，5% CO2）下的75 cm²组织培养瓶中扩增。HaCaT使用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）培养，添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素；HDF使用Fibroblast Medium（FM）培养，添加2%（v/v）FBS、1%（v/v）成纤维细胞生长补充剂（FGS）和1%（v/v）青霉素-链霉素。
**3D体外皮肤模型构建过程**
当HDF和HaCaT细胞达到汇合状态后，将12孔Transwell™板（孔径22.1 mm，面积3.8 cm²）与Transwell™插件（孔径11.9 mm，面积1.1 cm²）一起使用I型胶原水凝胶（0.1 mg/mL）包被，然后在4°C下孵育1小时。接下来，在顶室加入HDF细胞（密度为1.82 × 10^5 cells/cm²），并在37°C、5% CO2条件下孵育48小时（基于Rikken等人的优化研究，稍作修改[23]）。随后加入HaCaT细胞，同样条件下孵育24小时。移除顶室中的培养基以形成气液界面，模型在37°C、5% CO2条件下维持14天，每周更换两次基底室培养基。在每次更换培养基之前，使用EVOM上皮电压计（World Precision Instruments，美国佛罗里达州萨拉索塔市）进行跨上皮电阻（TEER）测量，该仪器配备有筷子电极，以监测并确保3D模型的完整性。
**3D体外皮肤模型渗透性测定**
在培养的第14天，根据使用HaCaT和HDF细胞系进行的初步2D细胞活力测定结果，向每个插片的顶侧室中加入400 μL的每种化合物（浓度为500 μg/mL）。选择未引起细胞毒性的最高浓度以确保细胞兼容性。在加入化合物之前，将插片在标准培养条件下用HBSS稳定30分钟。在预定的时间点（15、30、45、60、90、120、180和240分钟），从基底侧室收集200 μL的样本，并立即用等体积的新鲜培养基替换，以在整个实验过程中保持恒定的渗透条件。渗透测定结束后，也收集了剩余的顶侧溶液。在测定开始前、进行过程中和结束时进行TEER测量，以监测屏障的完整性。通过LC-DAD-MS对3D体外皮肤模型中渗透的化合物进行定量分析。
收集的样本按照Dall'Acqua等人的方法[24]，使用液相色谱与二极管阵列检测和质谱（LC-DAD-MS）进行分析。色谱分离使用Agilent Eclipse XDB C-18（3.0 × 150 mm，3.5 μm）柱子，以水（A）和乙腈（B）的梯度进行。洗脱梯度从0到5分钟为85%（A）和15%（B），15分钟后变为70%（A）和30%（B），25分钟后达到100%（B）。流动相流速设置为0.400 mL/min，样品注射体积为10 μL。以下是用于化合物定量的线性回归曲线：
根据各自的校准曲线对儿茶素和CGA进行定量。对于表儿茶素和NCGA，使用结构相似的参考化合物的校准曲线进行半定量，假设检测器响应因子相当，并将结果表示为相应参考标准的等效物。渗透数据按照Teixeira等人的方法[25]表示为渗透百分比（%）。
**3D体外皮肤模型细胞活力测定**
使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法评估3D皮肤模型中的细胞活力。在暴露于酚类化合物4小时后，小心地将含有3D皮肤膜的Transwell插件从12孔培养板中取出，并转移到一个新的12孔板中，加入500 μL的MTT试剂（0.5 mg/mL），在37°C和5% CO2气氛下孵育3小时。随后丢弃MTT，并加入500 μL的DMSO以完全溶解形成的甲酚蓝晶体。将板子振荡10分钟，使用Synergy HT Microplate Reader（Biotek Instruments, Inc., 美国佛蒙特州Winooski）在570 nm和690 nm处测量吸光度。Triton X-100（1%，v/v）和空藻酸盐微粒分别作为阳性和阴性对照。结果表示为细胞活力的百分比（%）。
**体外皮肤渗透研究**
渗透测定使用静态垂直玻璃Franz扩散细胞（9 mm夹套Franz扩散细胞，O型环接头，透明玻璃，夹具和搅拌棒；PermeGear, Inc., 美国）进行，受体体积为5 mL。人体皮肤新鲜标本来自葡萄牙波尔图São João医院整形外科手术。研究方案获得了São João医院生物伦理委员会的批准（方案代码：90_17），并在组织收集前获得了每位捐赠者的书面知情同意。手术后立即处理皮肤。小心去除皮下脂肪和深层真皮层以及皮肤受损部分。剩余的组织被切割成适合Franz扩散细胞扩散面积（0.785 cm²）的片段。实验重复三次（n = 3），对应于来自同一捐赠者的三个独立样本。将预处理的皮肤样本放置在Franz扩散细胞中，确保SC面朝向捐赠者室。受体室用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）填充，保持在37 ± 1°C，并用磁力搅拌棒连续搅拌。向捐赠者室中加入500 μL的每种化合物（浓度为500 μg/mL）。在预定的时间点（30、60、90、120、150、180、240、360、480分钟和24小时），从受体室收集300 μL的样本，并立即用等体积的PBS替换，以保持恒定体积。渗透测定完成后，回收整个皮肤片段，并用高速分散器（Ultra-Turrax VDI 12，VWR International, 美国）在1 mL甲醇中匀浆，以提取酚类化合物。皮肤保留率表示为施加剂量的百分比，以确保与文献一致，并在所有化合物和实验之间具有可比性和一致性。通过LC-DAD-MS对渗透的化合物进行定量。
**统计分析**
每个实验重复三次（n = 3），所得结果表示为平均值±标准差（SD）。统计分析使用IBM SPSS Statistics Version 31.0.1.0（SPSS Inc., 美国芝加哥市）软件进行。单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey's HSD检验，显著性水平p < 0.05被视为统计学上显著。
**3D共培养皮肤模型**
构建3D共培养模型是为了评估化妆品成分的渗透性和细胞毒性潜力。尽管角质形成细胞是永生化细胞，但它们在皮肤模型中被广泛使用，因为它们保持高分化能力，消除捐赠者间的变异性，并生成组织良好的表皮[26]。另一方面，真皮成纤维细胞保持产生ECM成分的能力，而胶原水凝胶则构成一种生物相容的替代物，支持成纤维细胞的生长并促进表皮-真皮之间的交流[27]。通过TEER评估3D共培养皮肤模型的功能性和皮肤屏障的完整性，TEER是一种非破坏性的紧密连接功能指标，已通过经济合作与发展组织（OECD）的皮肤腐蚀测试指南430验证[28]。在本研究中，从第2天开始在浸没条件下测量TEER，直到第14天在空气-液体界面条件下测量。这些测量也在多酚暴露后的渗透性测定期间进行。结果如图1所示。
**3D共培养皮肤的跨上皮电阻（TEER）**
在（a）14天的生长期间和（b）240分钟的渗透性测定期间，暴露于Hank's平衡盐溶液（HBSS）、儿茶素（CA）、表儿茶素（EPI）、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）和4种多酚混合物（MIX）时进行了监测。结果表示为平均值±标准差（SD）（n = 3）。可以看出，从共培养的第2天到第12天，TEER值逐渐增加，表明屏障形成良好、表皮分层和模型完整性（图1a）。在较早的时间点（第2天），值较低，范围为127.3 ± 5.7至142.8 ± 11.9 Ω.cm²，反映了初始的细胞附着过程和不完全的细胞间粘附。随着表皮的发展和分化，TEER值显著增加，直到第12天生长时，变化范围为204.5 ± 6.4至212.1 ± 2.6 Ω.cm²。从第12天开始，值达到一个稳定平台，保持在狭窄范围内（210.5 ± 3.5至217.5 ± 3.1 Ω.cm²）。这种稳定性表明建立了功能性和成熟的皮肤屏障，验证了该模型用于后续渗透性和细胞活力测定的适用性[28]。只有达到稳定TEER值超过200 Ω.cm²的插件被选用于后续实验。在确认3D共培养皮肤模型中的屏障形成后，进行了多酚的渗透性测定。在化合物暴露之前，用HBSS稳定后重新评估TEER值，基线值为255.5 ± 27.4至275.0 ± 1.4 Ω.cm²。与图1a中报告的共培养期相比，这种增加可能与基底侧培养基组成的变化有关，这些变化影响组织的水分并直接影响电阻，正如Hołyńska-Iwan等人[29]所评估的。然而，在渗透性测定期间，所有样本的值随时间略有下降，变化范围为184.0 ± 21.1至222.5 ± 0.7 Ω.cm²（图1b）。尽管如此，没有观察到突然下降，表明化合物的跨细胞和旁细胞渗透性增加，而没有损害先前形成的皮肤屏障的结构完整性[28]。此外，这些轻微下降表明活性化合物的渗透性取决于它们的结构，而不是由屏障破坏驱动的。
**细胞毒性评估**
为了确保获得的渗透曲线不受所选化合物产生的任何细胞毒性或屏障损伤效应的影响，在3D共培养皮肤模型上进行了细胞活力测定。在暴露于儿茶素、表儿茶素、CGA、NCGA和多酚混合物（浓度为500 μg/mL）后进行了MTT测定（图2）。
**3D共培养模型在暴露于Hank's平衡盐溶液（HBSS）、儿茶素（CA）、表儿茶素（EPI）、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）和4种多酚混合物（MIX）后的MTT测定**
根据第2.4.1节描述的方法对化合物进行定量。渗透百分比通过通过人体皮肤标本的化合物质量与施加到捐赠者室的化合物初始质量之比计算（公式2）。
**结果与讨论**
**3D共培养皮肤模型**
构建3D共培养模型是为了评估化妆品成分的渗透性和细胞毒性潜力。尽管角质形成细胞是永生化细胞，但它们在皮肤模型中被广泛使用，因为它们保持高分化能力，消除捐赠者间的变异性，并生成组织良好的表皮[26]。另一方面，真皮成纤维细胞保持产生ECM成分的能力，而胶原水凝胶构成了一种生物相容的替代物，支持成纤维细胞的生长并促进表皮-真皮之间的交流[27]。通过TEER评估3D共培养皮肤模型的功能性和皮肤屏障的完整性，TEER是一种非破坏性的紧密连接功能指标，已通过经济合作与发展组织（OECD）的测试指南430验证[28]。在本研究中，从第2天开始在浸没条件下测量TEER，直到第14天在空气-液体界面条件下测量。这些测量也在多酚暴露后的渗透性测定期间进行。结果如图1所示。
**3D共培养皮肤的跨上皮电阻（TEER）**
在（a）14天的生长期间和（b）240分钟的渗透性测定期间，暴露于Hank's平衡盐溶液（HBSS）、儿茶素（CA）、表儿茶素（EPI）、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）和4种多酚混合物（MIX）时进行了监测。结果表示为平均值±标准差（SD）（n = 3）。可以看出，从共培养的第2天到第12天，TEER值逐渐增加，表明屏障形成良好、表皮分层和模型完整性（图1a）。在较早的时间点（第2天），值较低，范围为127.3 ± 5.7至142.8 ± 11.9 Ω.cm²，反映了初始的细胞附着过程和不完全的细胞间粘附。随着表皮的发展和分化，TEER值显著增加，直到第12天生长时，变化范围为204.5 ± 6.4至212.1 ± 2.6 Ω.cm²。从第12天开始，值达到一个稳定平台，保持在狭窄范围内（210.5 ± 3.5至217.5 ± 3.1 Ω.cm²）。这种稳定性表明建立了功能性和成熟的皮肤屏障，验证了该模型用于后续渗透性和细胞活力测定的适用性[28]。只有达到稳定TEER值超过200 Ω.cm²的插件被选用于后续实验。在确认3D共培养皮肤模型中的屏障形成后，进行了多酚的渗透性测定。在化合物暴露之前，用HBSS稳定后重新评估TEER值，基线值为255.5 ± 27.4至275.0 ± 1.4 Ω.cm²。与图1a中报告的共培养期相比，这种增加可能与基底侧培养基组成的变化有关，这些变化影响组织的水分并直接影响电阻，正如Hołyńska-Iwan等人[29]所评估的。然而，在渗透性测定期间，所有样本的值随时间略有下降，变化范围为184.0 ± 21.1至222.5 ± 0.7 Ω.cm²（图1b）。尽管如此，没有观察到突然下降，表明化合物的跨细胞和旁细胞渗透性增加，而没有损害先前形成的皮肤屏障的结构完整性[28]。此外，这些轻微下降表明活性化合物的渗透性取决于它们的结构，而不是由屏障破坏驱动的。
**细胞毒性评估**
为了确保获得的渗透曲线不受所选化合物产生的任何细胞毒性或屏障损伤效应的影响，在3D共培养皮肤模型上进行了细胞活力测定。在暴露于儿茶素、表儿茶素、CGA、NCGA和多酚混合物（浓度为500 μg/mL）后进行了MTT测定（图2）。
**3D共培养模型在暴露于Hank's平衡盐溶液（HBSS）、儿茶素（CA）、表儿茶素（EPI）、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）和4种多酚混合物（MIX）后的MTT测定**
根据图2，没有一种测试化合物导致细胞活力显著降低。事实上，表儿茶素与对照组相比显著增加了细胞活力（p < 0.05），达到134.71%，而儿茶素、CGA、NCGA和混合物分别导致细胞活力为99.87%、104.30%、88.83%和104.77%。这些结果表明这些化合物被3D共培养皮肤模型良好耐受，突显了它们的生物相容性，并支持所获得的渗透数据的生理相关性。
**3D体外皮肤模型中的共培养**
在确认屏障完整性后，进行了体外渗透性测定，以评估所选多酚在建立的共培养模型中的渗透特性。渗透性监测了240分钟，如图3所示。
**3D共培养模型中的渗透特性**
在暴露于儿茶素（CA）、表儿茶素（EPI）、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）和4种多酚混合物（MIX）240分钟期间，通过液相色谱与二极管阵列检测和质谱（LC-DAD-MS）进行了渗透性监测。结果表示为平均值±标准差（SD）（n = 3）。表儿茶素、CGA、NCGA和酚类混合物显示出时间依赖的渗透性，在240分钟内稳步增加，分别达到179.38%、157.41%、169.50%和172.00%（图3）。然而，儿茶素表现出独特的释放特性，在早期时间点（15至60分钟）渗透有限，随后在240分钟暴露后急剧增加至144.62%。尽管儿茶素和表儿茶素是异构体，但由于分子内的氢键作用，儿茶素的溶解度低于表儿茶素。这种相互作用增加了儿茶素的稳定性，但可能阻碍了其渗透性[30]。羟基肉桂酸表现出类似的行为，具有中等的渗透速率，这与它们的高极性一致，这略微限制了扩散，正如Veras等人[31]所报告的。渗透值超过100%可能是由于累积量化的变异性，包括与校准曲线、采样和化合物回收相关的分析不确定性，以及供体室和受体室之间的潜在质量平衡差异。此外，吸附到实验材料上和从顶侧室不完全回收也可能导致渗透量的高估，这反映了多酚在模型中的广泛扩散。尽管LC-DAD-MS提供了高灵敏度和选择性，但该方法主要是使用标准溶液校准的，可能无法完全考虑基质效应。此外，化合物的降解、转化或与基质成分的相互作用可能会产生额外的信号，影响量化结果。
**表1**在3D共培养皮肤模型中，经过240分钟的渗透后，留在顶层的儿茶素（CA）、表儿茶素（EPI）、绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）以及这四种多酚混合物（MIX）的百分比（%）。结果以平均值±标准差（SD）表示（n=3）。顶层保留率（%）
| CA | EPI | CGA | NCGA | MIX |
|------|------|------|------|------|
| 7.50±0.38 | 7.50±0.38 | 20.62±1.03 | 11.63±0.58 | 70±0.35 |
多酚混合物的顶层保留率最低（7.0%），黄烷-3-醇类也最低（7.5%），这表明这些分子可以迅速与3D模型中的皮肤层相互作用。相反，CGA和NCGA的保留率较高，分别为20.62%和11.63%，这与之前报道的高极性一致[31]。总体而言，这些结果表明3D共培养模型能够根据多酚的不同理化性质进行区分，从而得出反映其独特极性和溶解度的渗透曲线。在体外的人类皮肤切片中也得到了类似的结果。
为了评估图3中报告的体外发现的实际应用价值，使用了切除的人类皮肤进行渗透研究，因为这是评估局部吸收和生物利用度筛选的广泛接受的模型[22]。尽管体外切片不能完全复制体内条件，但可以建立强相关性，从而支持其在评估活性化合物皮肤递送方面的有效性[22]。图4展示了通过体外研究获得的选定多酚的渗透结果，而表2总结了CGA、NCGA和多酚混合物的皮肤保留百分比。
图4显示了使用Franz扩散细胞和液相色谱-二极管阵列检测-质谱（LC-DAD-MS）技术，在24小时内绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）以及四种多酚混合物（MIX）的释放情况。结果以平均值±标准差（SD）表示（n=3）。
表2显示了甲醇提取后，通过液相色谱-二极管阵列检测-质谱（LC-DAD-MS）定量得到的绿原酸（CGA）、新绿原酸（NCGA）和多酚混合物（MIX）的皮肤保留百分比。
注：结果以平均值±标准差（SD）表示（n=3）。CGA、NCGA和四种多酚混合物中，只有CGA可检测到，其渗透率随时间逐渐增加，在24小时后趋于稳定。这种稳定性表明Franz扩散细胞内达到了稳态条件，从而在两个隔室之间建立了平衡，导致稳定的渗透通量[32, 33]。此外，正如3D体外模型所报告的，渗透率超过100%可能反映了化合物的降解、转化或与基质成分的相互作用，从而影响了信号，导致估计值偏高。Champmartin等人[33]在评估双酚A通过人类皮肤的渗透时也发现了类似的现象，该化合物在丙酮中暴露16小时后、在人工皮脂中暴露20小时后达到了稳态。在多酚混合物中仅检测到CGA可能是由于羟基肉桂酸和儿茶素家族之间的竞争性相互作用。这些分子可以通过氢键和复合物形成相互作用，从而阻碍渗透，导致混合物中剩余化合物的定量几乎为零[34]。在最终时间点（1440分钟），CGA和NCGA的渗透率分别为49.45%和49.82%，而混合物的渗透率为44.36%。CGA和NCGA之间的相似性与其化学结构一致，因为它们都是咖啡酰奎宁酸的位置异构体，具有相似的极性和分子量[35]。儿茶素和表儿茶素未通过LC-DAD-MS进行定量。这些结果与Butkeviciute等人[36]在使用Bronaugh流动扩散细胞进行的24小时体外皮肤渗透研究中的发现一致。作者确定CGA能够渗透皮肤，进入表皮的浓度为8.1 μg/mL，进入真皮的浓度为4.0 μg/mL。然而，儿茶素的皮肤渗透率很低，而表儿茶素仅轻微渗透到表皮。黄烷-3-醇类的低皮肤渗透率可能受到其不利理化性质的影响，即由于多个OH基团和相对较高的分子量（290.27 Da），这阻碍了它们在角质层的扩散[36, 37]。有效的经皮递送需要分子量低于500 Da、分配系数（log p）在2-3范围内（亲脂性的度量）以及熔点低于200°C[38, 39]。Rosita等人[39]评估了改善表没食子儿茶素没食子酸酯局部递送的策略，该化合物与儿茶素和表儿茶素结构相关。这种化合物具有高极性和低log p值（约1.1），导致皮肤渗透性差[39]。获得的结果强调了理化性质在皮肤渗透中的重要性，并支持了图4中Franz细胞扩散试验中观察到的儿茶素和表儿茶素无法定量的现象。有趣的是，Wisuitiprot等人[40]报告称，用壳聚糖包封显著提高了儿茶素和表儿茶素通过皮肤的渗透率，同时保护了活性化合物免受皮肤酶的破坏，实现了超过60%的渗透率。相比之下，当以纯形式应用时，儿茶素的渗透率较低（<30%）。然而，应注意的是，这些评估是在新生儿皮肤上进行的，新生儿皮肤具有较薄的角质层，这可能有助于儿茶素的高渗透率[40]。甲醇提取后的皮肤保留分析显示，CGA的保留率为69.60%，NCGA为63.07%，混合物为66.06%（表2）。这些数据表明，尽管大量酚类化合物渗透到了表皮和真皮中，但仍有相当一部分留在皮肤内。Champmartin等人[33]在评估双酚S与人类皮肤之间的相互作用时也观察到了类似的储存效应。因此，皮肤可以作为储存库，将活性成分储存在角质层中，延长其释放和生物活性，从而增强其在化妆品和制药应用中的效果，同时限制系统吸收。这种类型的保留对于局部化妆品应用特别有利，因为它允许多酚在局部发挥抗氧化和皮肤保护作用。它们在皮肤层中的积累有助于中和ROS和保护结构成分[41]。将体外渗透数据与体外结果进行比较时，明显的定量差异显而易见。在体外模型中，所有四种化合物都能被检测到，而在体外渗透研究中，只有CGA、NCGA和混合物（其中CGA是唯一可检测到的化合物）显示出可测量的渗透率。儿茶素和表儿茶素在体外切片中未检测到。这些差异可以由体外模型和体外切片在厚度、屏障严格性和脂质组织方面的内在差异来解释。同时，切除的人类皮肤中存在的代谢酶可能导致儿茶素和表儿茶素的降解，从而影响其定量[42]。受体介质本身的组成也可能促进多酚的降解和不稳定，以及暴露于生物活性化合物的时间差异可能会影响渗透结果[43]。事实上，已有报道指出体外模型可能导致渗透率的过高估计。正如Dumont等人[43]所述，共培养皮肤模型中的渗透率可能是体外结果的3倍，而在商业重建的人类表皮模型中则高出10倍以上，主要是由于屏障完整性和脂质谱型的差异。3D共培养模型的这一特性可以作为一种优势，因为根据Agonia等人的说法，这些模型对于评估本身渗透率较低的化合物（如黄烷-3-醇类）非常有价值，这些化合物在体外切片中通常低于检测限[12]。因此，尽管体外和体外模型之间的渗透率存在差异，但在羟基肉桂酸的暴露方面观察到了一致的趋势，支持了使用这种3D筛选工具的应用。
结论
在这项工作中，成功构建了一个位于空气-液体界面的3D共培养皮肤模型，并通过TEER测量、渗透研究和细胞毒性评估进行了功能验证。该模型显示TEER值逐渐增加，表明分层正确且形成了功能性屏障。渗透性测定显示体外模型和体外切片之间存在显著差异。虽然3D模型能够检测到所有化合物，但在人类皮肤样本中，只有羟基肉桂酸（CGA和NCGA）是可量化的，其浓度在44%到50%之间，而黄烷-3-醇类（儿茶素和表儿茶素）低于检测限。这些发现与所选化合物的结构性质一致，这些性质直接影响皮肤运输，并反映了两种模型之间的差异，即更高的屏障严格性、代谢活性和脂质组织。尽管3D共培养模型在高估多酚的渗透率方面超过了体外人类皮肤切片，但它仍然保留了化合物特定的渗透趋势。在体外切片中观察到的高皮肤保留率（63%-70%）进一步支持了储存效应在局部制剂中的重要性，其中需要长时间的生物活性和暴露。总体而言，体外人类皮肤仍然是皮肤渗透研究的金标准，而3D共培养模型提供了一个可重复且实用的化合物筛选平台，尽管绝对渗透率较高，但仍能捕捉到相对的渗透趋势。
作者贡献
Mariana Marques：撰写——原始草稿、软件、方法学、研究、正式分析。
Filipa Teixeira：方法学、研究、正式分析。
Mónica Vieira：监督、方法学、研究、正式分析。
Paulo C. Costa：撰写——审阅和编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。
Stefano Dall'Acqua：方法学、研究、正式分析。
Francisca Rodrigues：撰写——审阅和编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。
致谢
Filipa Teixeira感谢FCT/MCTES提供的博士奖学金（2024.01202.BD）。
Berta Nogueira Estivinho感谢FCT/MCTES提供的合同（2023.06611.CEECIND/CP2834/CT0010；DOI 10.54499/2023.06611.CEECIND/CP2834/CT0010）。
Francisca Rodrigues得到了FCT – 科学技术基金会（I.P.）在TENURE项目下的支持（2023.14718.TENURE.016）。
这项工作得到了FCT – 科学技术基金会（I.P.）的支持，项目编号为UID/04378/2025（DOI标识符10.54499/UID/04378/2025）和UID/PRR/04378/2025（DOI标识符10.54499/UID/PRR/04378/2025），属于应用分子生物学研究单元UCIBIO，以及健康与生物经济联合实验室i4HB的项目LA/P/0140/2020（DOI标识符10.54499/LA/P/0140/2020）。开放获取出版物的资金由FCT提供（b-on）。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
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