在缺血性中风的大鼠模型中，再通后给予雷帕霉素可改善功能结局并减少梗死面积

摘要

尽管在缺血性中风的内血管再通方面取得了进展，许多患者的预后仍然不佳。需要辅助的脑保护疗法来改善恢复情况。哺乳动物雷帕霉素复合体1（mTORC1）抑制剂雷帕霉素在临床前中风模型中显示出了神经保护作用。然而，大多数研究是在中风发作前或发作期间给予雷帕霉素的，这限制了其转化应用的价值。本研究的目的是确定在中风再通后立即给予雷帕霉素是否能够减少梗死体积和改善功能结果，以及这些效果是否与脑血流量（CBF）或血脑屏障（BBB）完整性的变化有关。

目的
尽管在缺血性中风的内血管再通方面取得了进展，许多患者的预后仍然不佳。因此，需要辅助的脑保护疗法来改善恢复情况。雷帕霉素（mTORC1抑制剂）在临床前中风模型中显示出神经保护作用。然而，大多数研究是在中风发作前或发作期间给予雷帕霉素的，这限制了其转化应用的价值。本研究的目的是确定在中风再通后立即给予雷帕霉素是否能够减少梗死体积和改善功能结果，以及这些效果是否与脑血流量（CBF）或血脑屏障（BBB）完整性的变化有关。

方法
雄性Wistar Han大鼠接受短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）处理90分钟。使用密封信封方法将大鼠随机分为两组：一组接受静脉注射雷帕霉素（250 μg/kg，n=9），另一组接受安慰剂（n=9），并在再通后立即给药。在72小时时通过磁共振成像（MRI）评估梗死体积、CBF和BBB完整性，并进行经过验证的神经学测试。组间比较使用未配对的学生t检验进行。

结果
与安慰剂组相比，雷帕霉素组梗死体积显著减少（44.77 ± 30.93 mm³ vs 113.44 ± 60.19 mm³，p=0.0114），Garcia神经学评分也有所改善（12.78 ± 1.04 vs 11.67 ± 0.87，p=0.0295）。在粘性物质移除测试中，雷帕霉素处理组的大鼠注意到刺激的时间更短（45.04 ± 11.91 s vs 72.33 ± 12.17 s，p=0.0002）。72小时时，雷帕霉素对CBF、BBB损伤或水肿没有显著影响（所有p值>0.05）。第3天时，两组之间的p-mTOR/mTOR比值没有显著差异（0.55 ± 0.32 vs 0.90 ± 0.41，p=0.1880）。

讨论
在中风再通后给予雷帕霉素可以改善功能结果并减少梗死体积，而不会改变持续的灌注或BBB通透性。这些发现揭示了一种与灌注无关、时间敏感的脑保护机制，并支持将雷帕霉素作为缺血性中风的辅助疗法的发展。

亮点
- 中风再通后给予雷帕霉素可显著减少梗死体积。
- 雷帕霉素处理的大鼠在粘性物质移除测试中表现出更好的体感功能。
- 雷帕霉素对急性或亚急性脑血流量没有影响，表明其脑保护作用独立于灌注的增强。
- 基于磁共振成像的评估显示，在中风后3天，雷帕霉素处理组没有显著的血脑屏障通透性或水肿变化。
- 这些发现支持雷帕霉素作为中风再通后立即给予的辅助脑保护疗法的潜力。

1 引言
近年来，由于再通疗法和成像技术的进步，中风治疗发生了革命性变化，患者选择也得到了改善。尽管再通率较高（60%-70%），但仍有约一半的患者功能恢复不佳，只有约10%的患者在3个月后症状消失。因此，具有神经元和血管保护作用的辅助药物治疗可能有助于改善再通后的结果。已证明，使用FDA批准的免疫抑制药物雷帕霉素抑制（mTORC1）可以在实验性中风过程中保护脑组织。然而，雷帕霉素发挥脑保护作用的机制及其针对的脑细胞和解剖结构仍在研究中。大量文献表明，雷帕霉素可以减少梗死体积并改善神经功能。然而，只有少数研究探讨了雷帕霉素对短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）后血脑屏障（BBB）结构和脑血流量（CBF）变化的影响。其中，五项研究报告雷帕霉素处理后BBB损伤减轻。最近的研究还表明，雷帕霉素可以缓解周细胞介导的毛细血管收缩并改善再通后的微血管再灌注，进一步支持其脑血管保护潜力。

2 方法
2.1 伦理和动物护理
所有实验程序均获得了英国内政部（1986年《动物法》和科学程序的批准（许可证编号PP7444704，颁发日期2022年12月23日），并遵循牛津大学的临床医学伦理审查指南、ARRIVE和IMPROVE动物及临床前中风工作指南进行。雄性Wistar Han大鼠（250-320克，8-11周龄，来自英格兰Blackthorn的Envigo Research Model Services）被分组饲养在单独通风的笼子中，每天12小时光照/12小时黑暗周期，自由获取食物（标准颗粒饲料）和水。手术前后大鼠均保持群体饲养。只有在出于福利原因必要时才会单独饲养，但本研究中没有这种情况。主要研究者（AMS）在手术前3天开始每天的动物处理、称重和训练大鼠进行粘性物质移除测试。手术后的3天内，每天对大鼠进行福利评估。

2.2 研究设计
2.2.1 对照组和排除标准
所有实验都包括了适当的对照组。在雷帕霉素比较研究中使用了安慰剂组。由于类似的动物研究中包含了未处理组且研究者尽量减少了动物的使用数量，因此本研究中未包括假对照组。在可能的情况下，使用了被试内对照，例如比较同侧半球与对侧半球的脑损伤扩散情况。手术期间的预定排除标准是激光多普勒流量（LDF）信号低于基线的30%以及确定的蛛网膜下腔出血（SAH），这是该局灶性缺血性中风模型中的一种罕见但已知的并发症。

2.2.2 随机化和盲法
使用密封信封方法将大鼠随机分为两组：一组接受雷帕霉素（Sigma Aldrich，目录号R0395-1MG，250 μg/kg，n=9），另一组接受安慰剂（<5%乙醇的 saline，n=9），并由主要研究者盲法分配治疗。整个实验过程中及数据采集完成前都保持盲法。

2.3 麻醉和监测
大鼠最初用5%异氟烷和70% N2O及30% O2混合气体麻醉，随后维持在1%–2%异氟烷和70% N2O及30% O2的浓度下。手术期间，使用直肠温度计（Harvard Apparatus，英国Cambourne）将核心体温维持在37.0 ± 0.5°C。每15分钟记录一次体温和呼吸频率，并通过调整异氟烷浓度来维持呼吸频率在50至60次/分钟之间。

2.4 脑血流量测量
使用连接到LDF装置（Oxyflo 2000 Optronix，英国牛津）的光纤探针连续监测大脑中动脉区域（MCA）的灌注情况。具体操作方法如前所述。将大鼠头部固定在立体定向框架中，探针放置在距离中线外侧4毫米、Bregma后方2毫米的位置。LDF数据记录在运行WinDaq数据采集软件（Dataq Instruments，美国Akron）的Windows XP工作站上。在整个实验过程中记录MCA区域的灌注情况。

2.5 CBF分析
使用LDF评估MCA闭塞前后及再通期间的CBF。为了比较不同治疗组，将连续记录的数据在预定义的实验阶段（基线、闭塞和再通后）进行总结。原始CBF数据以时间序列文件的形式导出并在Excel中处理。为了减少信号噪声，使用OFFSET函数对数据进行了10分钟间隔的平均处理。通过四分位数范围（IQR）方法识别并移除了异常值。此外，根据原始信号的突然丢失或与生理变化无关的伪影，手动排除了少数异常值。

2.6 局灶性脑缺血和雷帕霉素治疗
本研究使用了22只大鼠。所有操作均在无菌条件下进行。采用Longa丝模型对MCA进行短暂闭塞（tMCAO），持续90分钟。再通后立即通过尾静脉注射雷帕霉素（250 μg/kg）或安慰剂。雷帕霉素的剂量和给药途径是基于我们实验室关于雷帕霉素剂量依赖性效应的 meta-analysis 结果选择的。再通后继续记录CBF 90分钟。

2.7 行为评估
手术后的3天内对所有大鼠进行了神经学评估，以测量中风后的损伤情况。评估内容包括Bederson、Garcia和粘性物质移除测试。Bederson量表通过评估前肢屈曲、抵抗侧向推力和圈行行为来评估中风后的行为缺陷（0-3分）。Garcia电池包含6项测试，用于评估感觉运动缺陷（0-3分），总分范围为0-18分。粘性物质移除测试通过将1厘米×1厘米的粘合剂放置在左侧或右侧前爪上，然后测量首次触碰到粘合剂的时间（“接触时间”）和移除粘合剂的时间（“移除时间”），以评估对侧前爪的感觉和运动功能。的应用顺序是随机的，且施加压力均匀。为减少个体间差异，在手术前3天进行了3天的训练（每天2次），并比较了雷帕霉素组和安慰剂组注意到和移除粘合剂的时间。

2.8 磁共振成像（MRI）
在雷帕霉素给药后72小时使用9.4 T水平孔径扫描仪（Agilent Technologies，美国）进行MRI检查，配备72毫米发射线圈和4通道接收阵列（Rapid Biomedical，德国）。使用5%异氟烷和70% N2及30% O2混合物诱导麻醉，并在同一气体混合物中维持1%–2%的异氟烷浓度。大鼠被放置在带有立体定向支架的托盘中，使用直肠温度计和压力探头监测呼吸。使用反馈控制的加热垫（Harvard Apparatus，英国Cambourne）将核心体温维持在37.0 ± 0.5°C，并通过调整异氟烷浓度来维持呼吸频率在50至60次/分钟之间。在成像过程中定期记录生理参数。获取T1和T2松弛时间（秒）、脑血流量（CBF，mL/100 g/min）的定量图谱，以及通过动脉自旋标记（ASL）获得的脑血流量数据。T1w和T2w图像采用SPIN-ECHO回波平面成像（EPI）序列获取，视野（FOV）为32×32毫米²，矩阵（matrix）为256×256毫米²，厚度（thickness）为1毫米，共10层。T1w和T2w解剖图像使用SPIN-ECHO回波平面成像序列获取，FOV为32×32毫米²，矩阵为256×256毫米²，厚度为1毫米，共10层。T1w解剖图像的扫描重复时间（TR）和回波时间（TE）分别为500毫秒和20毫秒；增强图像是在注射150微升钆基对比剂（GBCA；Gadodiamide [Omniscan，德国]）后获得的。T1w图像使用反转恢复序列（TI=13.14, 29.3, 65.3, 145, 324, 723, 1610, 8000毫秒）获取。T2w解剖图像使用SPIN-ECHO回波平面成像序列获取，FOV为32×32毫米²，矩阵为256×256毫米²，厚度为1毫米，共10层。DW成像扫描使用二维SPIN-ECHO回波平面成像序列获取。

2.8.1 MRI分析
使用ITK-SNAP（版本3.8.0，2019）和MATLAB（Mathworks，Natick，MA）进行分割和分析。在T2加权（T2w）图像上，缺血区域被识别为高信号区域。34 在T1加权（T1w）图像上，通过减去注射钆剂前后的图像，大脑血脑屏障（BBB）损伤区域也被识别为高信号区域。缺血和BBB损伤的兴趣区域（ROIs）在横截面中手动分割。梗死体积使用Kaplan公式进行了水肿校正：校正后的梗死体积 = 梗死体积 × 对侧半球体积 / 同侧半球体积。35 在ADC（扩散张量）图像上，缺血区域被识别为相对于对侧半球扩散减少23%以上的区域。在ASL（动脉自旋标记）图像上，低灌注区域被定义为血流减少57%以上的区域。36 对侧半球的边界是通过从中央沟到脑底的线来定义的，这条线将同侧半球划分出来。预定义的皮层区域的相对扩散和灌注比例如下计算：扩散和灌注比率 = 同侧ROI的扩散/灌注 ÷ 对侧ROI的扩散/灌注。所有ROI均由主要研究者（AMS）手动选择，该研究者对治疗方案不知情。

2.9 Waxholm脑图谱

Waxholm空间图谱是一个基于各向同性磁共振和扩散张量图像的开放获取的大鼠脑解剖图谱，数据来自80天大的Sprague Dawley雄性大鼠（Waxholm Sprague Dawley大鼠脑图谱（RRID:SCR_017124）。37 图谱的空间参考使用Waxholm坐标系。该图谱用于将在同一立体定向空间内获取的T2w MRI图像进行叠加，坐标使用bregma和lambda之间的距离来确定。

2.10 西部印迹（Western blotting）

成像后，大鼠通过腹腔注射戊巴比妥（800毫克/千克）处以安乐死。38 取出大脑，并使用冰镇的不锈钢切片机切成2毫米厚的冠状切片。从每个半球的纹状体和皮质中取出1平方毫米的样本并快速冷冻。使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液从同侧皮质损伤处提取蛋白质。蛋白质定量使用BCA测定法（Pierce BCA Protein Assay Kit，23225，Thermo Fisher Scientific）进行。50微克蛋白质在95摄氏度下加热5分钟进行变性处理，然后使用裂解液和Laemmli样品缓冲液（161-0737，Bio-Rad，含DTT）处理。样品在10%梯度凝胶（Criterion TGX Precast Gel，5671033，Bio-Rad）上进行电泳，电泳设备为Bio-Rad（Cressier，瑞士）。蛋白质被转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。非特异性结合用含有5% BSA和0.1% Tween-20的PBS在室温下浸泡1小时后，再用初级抗体（mTOR和phospho-mTOR（Ser 2448），Cell Signaling，稀释倍数均为1:1000）在5% PBS-T中孵育过夜。在PBS-T中洗涤3次后，将膜在二级抗体山羊抗兔（IgG H&L (HRP)，ab6721，Abcam，稀释倍数1:2000）中孵育1小时。再次用PBS-T洗涤3次后，使用增强型化学发光（ECL；12644055，Fisher Scientific）显色5分钟并立即成像。Western Blot分析和定量使用密度计进行，并以β-管蛋白为标准进行归一化。

2.9 Waxholm脑图谱

Waxholm空间图谱是一个基于各向同性磁共振和扩散张量图像的开放获取的大鼠脑解剖图谱，数据来自80天大的Sprague Dawley雄性大鼠（Waxholm Sprague Dawley大鼠脑图谱（RRID:SCR_017124）。图谱的空间参考使用Waxholm坐标系。该图谱用于将在同一立体定向空间内获取的T2w MRI图像进行叠加，坐标使用bregma和lambda的距离来确定。

2.10 Western Blotting

成像后，大鼠通过腹腔注射戊巴比妥（800毫克/千克）处以安乐死。取出大脑，并使用冰镇的不锈钢切片机切成2毫米厚的冠状切片。从每个半球的纹状体和皮质中取出1平方毫米的样本并快速冷冻。使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液从同侧皮质损伤处提取蛋白质。蛋白质定量使用BCA测定法（Pierce BCA Protein Assay Kit，23225，Thermo Fisher Scientific）进行。50微克蛋白质在95摄氏度下加热5分钟进行变性处理，然后使用裂解液和Laemmli样品缓冲液（161-0737，Bio-Rad，含DTT）处理。样品在10%梯度凝胶（Criterion TGX Precast Gel，5671033，Bio-Rad）上进行电泳，电泳设备为Bio-Rad（Cressier，瑞士）。蛋白质被转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。非特异性结合用含有5% BSA和0.1% Tween-20的PBS在室温下浸泡1小时后，再用初级抗体（mTOR和phospho-mTOR（Ser 2448），Cell Signaling，稀释倍数均为1:1000）在5% PBS-T中孵育过夜。在PBS-T中洗涤3次后，使用增强型化学发光（ECL；12644055，Fisher Scientific）显色5分钟并立即成像。Western Blot分析和定量使用密度计进行，并以β-管蛋白为标准进行归一化。膜经过两次抗体清洗，首先使用温和的抗体清洗液（7.5克甘氨酸，0.5克SDS，5毫升Tween-20，pH调整至2.2，稀释至500毫升蒸馏水）清洗2×7分钟，然后用PBS洗涤2次，再用PBS-T洗涤2次，最后再次用含有5% BSA和0.1% Tween-20的PBS清洗。

2.11 统计分析

实验设计和动物数量经过优化，以验证假设并符合科学报告标准。39 统计分析在研究结束后进行，没有新增动物。研究的统计效力为每组n=9只动物，基于估计的效应大小为30%（±20%的变异性），主要结果的成功率为80%（α=0.05）。次要结果，包括行为亚测试、MRI衍生指标和Western Blot分析，被视为探索性研究，没有单独设置效力来检测较小的效应大小。因此，选定次要结果中没有统计显著性应理解为受到统计效力有限和生物学变异性的影响。统计分析使用GraphPad Prism 8.42（La Jolla，美国）软件进行。数据的正态性通过D'Agostino和Pearson检验进行评估，仅当满足正态性假设时才应用参数检验。使用非配对Student's t检验比较治疗组。成像参数和功能结果之间的相关性通过线性回归进行分析，根据Funder和Ozer的分类标准分为极小（<0.05）、非常小（0.05–0.1）、小（0.1–0.2）、中等（0.2–0.3）、大（0.3–0.4）或非常大（≥0.4）。p值<0.05被认为是统计学上显著的，数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。

3 结果

3.1 被排除的动物

共有22只大鼠接受了手术。其中4只在手术过程中因LDF下降不足（n=3）或蛛网膜下腔出血（n=1）而被排除，因此有18只大鼠可用于术后分析。所有剩余大鼠（n=18）均进行了行为评估。对于基于MRI的分析，有1只大鼠未进行MRI检查，因此被排除在所有MRI衍生结果之外（n=17）。另外1只大鼠没有进行T2加权成像，故也被排除在梗死体积分析之外（n=16）。对于T1加权增强成像，有5只大鼠因图像质量不足而被排除。对于BBB（血脑屏障）分析，另有4只大鼠因钆剂对比度不足而被排除，最终样本量为n=12。对于CBF（脑血流量）分析，有6只大鼠因无可靠信号而被排除，因此样本量为n=16。扩散和灌注MRI分析在17只大鼠中进行。Western Blot分析在部分大鼠（n=10；对照组n=6，雷帕霉素组n=4）中进行，因为有些样本因图像质量不足而被排除；排除标准仅基于预定义的质量标准，与治疗分配无关。

3.2 雷帕霉素显著减少梗死体积

雷帕霉素在中风后72小时显著减少了梗死体积（雷帕霉素组：44.77±30.93毫米³ vs 对照组：113.44±60.19毫米³，p=0.0114；图1）。将Waxholm空间图谱叠加在T2加权MRI切片上显示，表明多个皮质和皮下区域受到影响，包括体感皮质（补充图1，补充表1）。图1显示，雷帕霉素在中风后72小时显著减少了梗死体积，通过T2加权磁共振成像（MRI）评估，并校正了水肿的影响。与对照组相比，雷帕霉素组的梗死体积显著减小。数据以平均值（标准差）呈现，对照组n=7，雷帕霉素组n=9（*p<0.05）。统计分析使用非配对Student's t检验进行。代表性冠状切片见补充图1。

3.3 雷帕霉素显著改善功能结果

雷帕霉素显著提高了Garcia测试的表现（雷帕霉素组：12.78±1.04分 vs 对照组：11.67±0.87分，p=0.0295，图2A）。它没有改善Bederson测试的表现（雷帕霉素组：1.56±0.73分 vs 对照组：2.11±0.60分，p=0.0962，图2B）。雷帕霉素处理的大鼠除去前爪上的胶带所需时间更短，表明感觉功能有所改善（雷帕霉素组：45.04±11.91秒 vs 对照组：72.33±12.17秒，p=0.0002，图2C）。它们也更快地移除了胶带（雷帕霉素组：49.89±23.09秒 vs 对照组：76.56±12.92秒，p=0.0146，图2D）。观察到梗死体积与神经学测试结果之间存在强相关性，较大的梗死体积导致更差的功能（梗死体积与Garcia测试的相关性：r=-0.5502，p=0.0272；图3A；梗死体积与Bederson测试的相关性：r=0.6138，p=0.0114，图3B；梗死体积与注意到前爪的时间的相关性：r=0.5486，p=0.0278，图3C）。图2显示了雷帕霉素显著改善了功能结果。（A）中风后72小时的Garcia评分神经学评估。（B）中风后72小时的Bederson评分神经学评估。（C）雷帕霉素显著减少了通过胶带去除测试评估的感觉缺陷。注意到对侧前爪的时间，计算为基线和中风后72分钟之间的差异（秒）。（D）雷帕霉素显著减少了通过胶带去除测试评估的运动缺陷。去除对侧前爪上的胶带的时间，计算为基线和中风后72分钟之间的差异（秒）。数据以平均值（标准差）呈现，*p<0.05，***p<0.001，与对照组相比。所有组n=9。

3.4 雷帕霉素不改善再通立即后的血流量

在MCAo（middle cerebral artery occlusion）之前和期间，血流量没有差异，这两个时间点都是在雷帕霉素治疗之前。（治疗前：对照组：91.73±9.97% vs 雷帕霉素组：82.21±6.87%，p=0.0784，图4A；治疗期间：对照组：40.28±13.32% vs 雷帕霉素组：46.25±9.11%，p=0.3774，图4B）。雷帕霉素没有改变再通后前90分钟的平均MCA区域血流量（治疗后：对照组：96.73±10.6% vs 雷帕霉素组：94.82±16.37%，p=0.8386，图4C）。图4显示，雷帕霉素没有改善再通立即后的血流量。图4显示，雷帕霉素没有改善再通立即后的血流量。（A）大脑血流量（CBF）表示为MCAo前的百分比。（B）MCAo前的平均CBF。（C）MCAo期间的CBF。（D）再通后前90分钟的平均CBF。雷帕霉素在再通后立即给药。在治疗前后的任何时间点，对照组（n=7）和雷帕霉素组（n=9）之间没有观察到显著差异（所有p>0.05）。数据以平均值（标准差）呈现。统计分析使用非配对Student's t检验进行。

3.5 雷帕霉素不改变扩散或灌注

在评估了雷帕霉素对急性期血流的影响后，我们研究了其对亚急性期空间匹配的动态变化的影响。在3天时，没有大鼠的扩散缺陷足以将皮质MCA区域定义为缺血区。雷帕霉素没有显著改变相对扩散（雷帕霉素组：1.12±0.05 vs 对照组：1.11±0.09，p=0.5765，图5A）或同侧ROI的绝对扩散（雷帕霉素组：0.00081±0.0001×10^4毫米^2/秒 vs 对照组：0.00080±0.0001×10^4毫米^2/秒，p=0.6099，图5B）。图5显示，雷帕霉素没有改变扩散或灌注。图5显示，雷帕霉素没有改变扩散或灌注。（A）使用磁共振成像（MRI）和表观扩散系数（ADC）映射评估的病变区域内同侧与相应对侧区域的相对扩散。（B）同侧半球的绝对扩散值。（C）使用动脉自旋标记（ASL）MRI评估的病变区域内同侧与相应对侧区域的相对灌注。（D）同侧半球的绝对灌注值。所有测量均在中风后72小时（tMCAo）进行。对照组（n=8）和雷帕霉素组（n=9）之间没有显著差异。数据以平均值（标准差）呈现。统计分析使用非配对Student's t检验进行（所有p>0.05）。一只大鼠显示出半球间的灌注异常。然而，雷帕霉素没有显著改变相对灌注（雷帕霉素组：0.9997±0.3364 vs 对照组：1.065±0.1856，p=0.6340，图5C）或绝对灌注（雷帕霉素组：94.60±34.67毫升/100克/分钟 vs 对照组：139.10±87.92毫升/分钟，p=0.4807，图5D）。

3.6 雷帕霉素对水肿形成和血脑屏障完整性的影响

使用Kaplan的公式评估T2w图像上的水肿形成：水肿范围 = 同侧半球体积 - 对侧半球体积 / 对侧半球体积。雷帕霉素没有显著影响水肿体积（雷帕霉素组：9±5.66毫米³ vs 对照组：14.25±7.19毫米³，p=0.1129，图6A）。T1w成像结合钆剂注射评估了血脑屏障（BBB）的完整性，对于BBB分析，有5只大鼠因T1加权图像质量不足而被排除，另有4只大鼠因钆剂对比度不足而被排除，最终样本量为n=12。雷帕霉素没有显著改变BBB的破坏（雷帕霉素组：3.27±2.34毫米³ vs 对照组：7.65±4.50毫米³，p=0.0606，图6B）。图6显示，雷帕霉素没有显著影响水肿形成和血脑屏障（BBB）的完整性。（A）使用T2加权磁共振成像（MRI）在中风后72小时评估脑水肿，以整个大脑体积的百分比表示。对照组（n=8）和雷帕霉素组（n=9）之间没有显著差异。（B）使用注射钆基对比剂（GBCA）前后增强T1加权自旋回波MRI评估血脑屏障的通透性，数据已校正水肿形成。图6显示，两组之间没有显著差异（每组n=6）。数据以平均值（标准差）呈现。统计分析使用非配对Student's t检验进行（所有p>0.05）。

3.7 3天时mTOR活性未降低

使用磷酸化（p-mTOR）与总mTOR蛋白的比例作为路径活性的指标。中风后72小时，雷帕霉素处理组与对照组之间的p-mTOR/mTOR比值没有显著差异（雷帕霉素组：0.55±0.32 vs 对照组：0.90±0.41，p=0.1880；补充图1）。瑞帕霉素在再通后立即使用，可在第3天减少梗死体积并改善功能，缓解体感缺陷，同时不影响血脑屏障（BBB）的完整性。在再通后90分钟内以及第3天时，瑞帕霉素并未增加大脑中动脉（MCA）区域的脑血流量（CBF），这与早期研究结果相反，早期研究表明，在再通时或之前使用瑞帕霉素可以通过减少周细胞介导的毛细血管收缩来增强微血管再灌注。

这些发现表明，瑞帕霉素在再通后发挥的脑保护作用可能通过非急性或持续灌注的机制实现——可能是通过调节炎症或稳定新生血管单元（NVU）。这与多项研究结果一致，这些研究显示瑞帕霉素可以保护血脑屏障并调节小胶质细胞的功能。明确其细胞靶点、作用机制及最佳剂量对进一步的应用至关重要。瑞帕霉素在3天时减少了病灶体积，超过了我们之前基于30项啮齿动物研究的汇总分析中估计的22%的梗死减少幅度，实际减少了39%。磁共振成像（MRI）显示，两组在3天时的亚急性扩散或灌注情况没有差异，也未出现任何缺血后组织搏动（DPM），表明此时没有可挽救的组织。因此，由于没有动物满足预设的差异标准，扩散-灌注不匹配并未作为单独的评估指标。MCA阻塞后，缺血后组织搏动体积迅速下降，在45至210分钟内降至初始大小的四分之一。少数研究关注了暂时性MCA阻塞后的缺血后组织搏动情况；Meng等人发现，在再通后的前2小时内该情况最为明显。因此，早期再通阶段是进行辅助治疗的最佳时机，因为此时仍有大部分组织可以挽救。尽管瑞帕霉素在再通时使用，但其益处似乎独立于持续灌注，表明它可能通过其他机制发挥作用，如调节免疫、稳定血脑屏障或提供广泛的神经血管保护。然而，瑞帕霉素组与对照组之间的血脑屏障完整性没有差异。在小鼠的中脑动脉阻塞后，30分钟至6小时内可能会发生轻微的血脑屏障损伤，导致小分子（≤3 kDa）渗入脑实质。3小时后，较大分子（≥40 kDa）开始外渗，而在超急性期保持完整的紧密连接在大约48小时后开始受损，这是由于细胞因子激活的MMP-3、MMP-9和环氧化酶-2的作用。瑞帕霉素在先前的研究中已被证明可以减少血脑屏障的破坏。此处未观察到明显效果可能是因为统计能力有限，因为血脑屏障破坏是一个次要结果：平均差异约为50%，但高变异性（标准差约72%，样本量n=6）降低了统计显著性。另一种可能性是第3天时瑞帕霉素浓度降低，正如我们的Western blot实验所显示的，这与血脑屏障破坏的高峰时间相吻合。这些发现与我们早期关于中风后禁食的研究结果一致，早期再通可以减少炎症和血脑屏障破坏。由于禁食也能抑制mTOR，因此无论是药物还是代谢途径的mTOR抑制都可能保护血脑屏障，时机对于最大化效果至关重要。我们的T2加权成像分析显示，在3天时没有显著的水肿减少。瑞帕霉素改善了中风后的体感功能。行为测试对于评估脑保护疗法至关重要，中风后3天是检测持续缺陷的最佳时间点，此时没有手术恢复的干扰因素。我们的研究评估了运动、体感和整体功能。瑞帕霉素在减少注意到损伤的时间和清除粘附物的时间方面都有所改善，尤其是在注意到损伤的时间上（体感方面）改善更为显著。注意到损伤的时间与梗死体积相关性强，反映了其对体感皮层损伤的敏感性以及瑞帕霉素的部分修复作用。差异也可能源于手术对咀嚼肌的缺血影响，从而阻碍了粘附物的清除。瑞帕霉素没有改善Bederson或Garcia评分，这些评分用于评估不使用嘴巴时的感觉运动缺陷。总体而言，瑞帕霉素在感觉恢复方面比运动恢复更有效，这与先前的研究结果一致。同侧的皮层Western blot分析显示，3天时mTOR活性未发生变化，表明瑞帕霉素的作用已经发生。尽管没有超过3天的大鼠数据，但在Sprague Dawley大鼠中，1 mg/kg剂量后72小时瑞帕霉素的水平降至约1 nM（半衰期约25小时），低于有效的神经元培养浓度。瑞帕霉素在小鼠中的半衰期为58小时，在健康雄性大鼠中为79小时，表明存在物种差异。未来的研究应包括更早的评估时间点，以评估其对mTOR活性、微血管、梗死体积和功能的影响。测试后期给药情况可以明确其益处是否取决于超急性期的血流（2小时内）。进一步的研究应探讨后期阶段的病灶组织和血脑屏障稳定性，因为血脑屏障破坏从缺氧损伤发展为炎症。了解缺血后mTOR抑制的时间效应对于优化瑞帕霉素的临床应用至关重要。

虽然这项研究的主要预后指标是梗死体积，但几个次要指标（包括基于Western blot的mTOR活性分析和基于MRI的血脑屏障破坏及灌注评估）显示出较大的变异性，可能不足以检测到更微妙的效应。此外，用于评估相关生物过程的技术不同（例如，通过LDF和ASL-MRI在不同时间点测量灌注），这些技术捕捉到了脑血管功能的不同空间和时间方面。在解释某些次要指标无显著效果时，应考虑这些因素。尽管瑞帕霉素是一种特征明确的mTORC1抑制剂，但本研究并未设计用于进行深入的机制分析。重要的是，组织样本是在中风后3天收集的，此时mTOR活性已恢复到基线水平，表明瑞帕霉素直接介导的通路调节窗口已经过去。因此，在这个阶段进行额外的分子或细胞分析可能无法捕捉到观察到的神经保护效应的主要机制。未来的研究应关注再通后的早期时间点，以明确mTOR抑制的时间动态，并研究下游通路，包括梗死区域的细胞存活信号传导、代谢应激反应和免疫调节。这项包含关键转化因素的瑞帕霉素临床前试验表明，再通时的mTOR抑制可以改善功能并减少梗死体积，且不会导致脑血流量显著增加。3天时，病灶大小减小，结果更好，表明其作用机制超出了血管效应。这种时间依赖性的多重作用支持将瑞帕霉素进一步开发为缺血性中风的辅助脑保护疗法。在更大规模的模型中进行验证并绘制时间动态图将对于其临床应用至关重要。

作者贡献：
Anna M. Schneider：概念构思（平等贡献）；数据整理（负责人）；正式分析（负责人）；研究设计（负责人）；项目管理（负责人）；可视化处理（负责人）；原始稿件撰写（负责人）。
Yvonne Couch：概念构思（平等贡献）；资源调配（平等贡献）；监督（平等贡献）；验证（平等贡献）；稿件审阅与编辑（平等贡献）。
James Larkin：方法学设计（平等贡献）；可视化处理（平等贡献）；稿件审阅与编辑（平等贡献）。
Alastair M. Buchan：概念构思（平等贡献）；资源调配（平等贡献）；监督（平等贡献）；验证（平等贡献）；稿件审阅与编辑（平等贡献）。
Daniel J. Beard：概念构思（平等贡献）；监督（平等贡献）；验证（平等贡献）；稿件审阅与编辑（平等贡献）。