**摘要**
小RNA（sRNAs）是植物防御的关键调节因子，并且已被发现与病原体之间存在跨界相互作用。半生物营养型真菌Colletotrichum higginsianum通过三个阶段感染拟南芥（Arabidopsis thaliana）：附着器穿透、生物营养阶段和坏死营养阶段。然而，这三个阶段中真菌和植物sRNA群体的动态变化尚未得到阐明。通过高通量测序技术，我们分析了拟南芥和C. higginsianum在植物体内附着器形成（PA）、生物营养（BP）和坏死营养（NP）阶段的sRNA特征，并将其与真菌菌丝（MY）和体外形成的附着器（VA）进行了比较。我们的分析揭示了植物和病原体中sRNA积累的阶段特异性模式。在C. higginsianum中，PA、BP和VA阶段的sRNA主要由29个核苷酸（nt）长的分子组成，而在NP阶段则转变为18个nt长的分子，这与宿主细胞死亡过程中的RNA降解一致。在拟南芥中，sRNA从PA/BP阶段的30–33个nt长转变为NP阶段的21个nt长为主。此外，在NP阶段，来自转录后（TE）的siRNAs以及其他调控性sRNAs（miRNAs、ncRNAs、snoRNAs和snRNAs）的数量减少。共有62个宿主miRNAs表现出差异性积累，包括在感染各阶段都活跃的核心植物发育调节因子，以及如miR396、miR170/171、miR472和miR858b这样的阶段特异性miRNAs。tRFs在宿主和病原体中的趋势相反：病原体的tRFs数量减少，而宿主的tRFs数量增加。这些tRFs的对比趋势可能反映了宿主和病原体之间RNA处理或降解的差异。我们的研究为RNA介导的植物-真菌相互作用提供了新的见解。
**1 引言**
Colletotrichum higginsianum是一种半生物营养型子囊菌，可引起多种十字花科植物的炭疽病（Damm等人，2014年；Yan等人，2018年）。这包括芸苔属（Brassica）植物，如甘蓝（Brassica oleracea）和芜菁（Brassica rapa），以及萝卜属（Raphanus）植物，如萝卜（Raphanus sativus）（Narusaka等人，2006年；Lee等人，2018年；Choi等人，2019年）。由于该病原体具有导致重大经济损失的潜力，已成为农业的重要威胁（Yan等人，2018年）。C. higginsianum采用多阶段的半生物营养感染过程。首先，一个圆顶形的附着器通过机械压力和局部酶解作用穿透宿主表面。然后，在活的表皮细胞内生长出被宿主质膜包裹的球状生物营养菌丝。最后，真菌进入坏死营养阶段（NP），产生细长且快速扩展的菌丝，杀死并降解宿主组织（O'Connell等人，2012年）。C. higginsianum还会感染模式植物拟南芥（Tsushima等人，2019年）。由于大多数拟南芥生态型都易受该真菌感染，因此认为它非常适合感染拟南芥（Shimada等人，2006年）。因此，其与拟南芥的相互作用成为研究真菌致病性的细胞和分子机制的宝贵模型系统（Koch等人，2025年）。植物具有复杂的免疫系统。病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）能够通过称为模式识别受体（PRRs）的膜受体和/或表面受体（如跨膜受体样激酶）检测保守的微生物分子，如鞭毛蛋白、几丁质和糖蛋白（Jiang等人，2023年）。PTI的激活会导致与病原性相关的（PR）基因表达、活性氧（ROS）的产生以及水杨酸（SA）的积累（David等人，2019年）。作为响应，病原体会向宿主植物分泌效应蛋白以抑制PTI，从而促进感染（Zhang等人，2022年）。效应蛋白触发的免疫（ETI）是植物通过直接或间接识别效应蛋白来检测病原体的另一种方式，通过称为核苷酸结合-亮氨酸富集重复序列受体（NLRs）的抵抗蛋白触发更强烈和更快的免疫反应（Nguyen等人，2021年）。小RNA（sRNAs）通过直接或间接调节多种基因，是植物防御反应的重要组成部分（Jiang等人，2023年）。它们甚至被认为可以通过称为宿主诱导的基因沉默（HIGS）的过程直接靶向病原体基因，从而发挥抗菌作用（You等人，2019年）。sRNAs是18–30个核苷酸长的分子，是发育、生长、繁殖以及生物和非生物胁迫反应的关键调节因子（Zhan和Meyers，2023年）。它们主要分为两大类：微小RNA（miRNAs）和小干扰RNA（siRNAs）。miRNAs来源于内源性MIR基因，由RNA聚合酶II（Pol II）转录成初级miRNAs（pri-miRNAs）。成熟的miRNAs通常长20–22个nt。siRNAs长度在21到24个nt之间，来源于长的双链RNA分子（Baldrich等人，2022年；Bilir等人，2022年）。与miRNAs不同，siRNAs可以来源于内源性基因和外部来源，如病毒、转座子和转基因（Bilir等人，2022年）。本研究旨在识别和表征在感染各阶段（即植物体内形成的附着器、生物营养阶段（BP）和NP阶段）中起作用的植物和病原体的sRNAs，通过将其特征与无菌培养的真菌菌丝和体外形成的附着器的特征进行比较。为此，我们对不同感染阶段的sRNAs进行了测序和比较分析。识别这些sRNAs有助于开发可持续的真菌感染控制策略，这些策略不仅适用于拟南芥，也适用于其他植物物种。
**2 材料与方法**
**2.1 植物和真菌材料的准备**
C. higginsianum菌株IMI 349063A在Mathur's琼脂培养基上培养以产生孢子，方法如前所述（Rutter等人，2022年）。为了在体外大量生产真菌附着器，将40毫升孢子悬浮液（2×10^6个孢子/毫升）倒入12厘米见方的聚苯乙烯培养皿中，让孢子沉淀40分钟。然后用一块12厘米见方的尼龙网（孔径50微米）覆盖培养皿底部，倾倒多余的水分，将培养皿在25°C的潮湿环境中培养22小时。随后轻轻将尼龙网取出，剧烈摇晃去除残留液体，加入25毫升Tritol试剂（ThermoFisher Scientific），并使用细胞刮刀（Corning，产品编号3011）破坏附着器。总RNA的提取按照制造商的说明进行。每个生物学重复实验包括来自五个培养皿的提取物（总共约4×10^8个附着器）。为了获得未分化的真菌菌丝，在250毫升Erlenmeyer烧瓶中加入马铃薯葡萄糖肉汤（100毫升），接种孢子悬浮液至最终浓度1×10^6个孢子/毫升，并在25°C下以100转/分钟的速度摇晃。3天后，通过尼龙网过滤收集菌丝，然后在预冷的研钵和杵中用液氮研磨，再用Tritol提取总RNA。为了从受感染的拟南芥叶片中提取RNA，将Col-0生态型的拟南芥植物种植在基于泥炭的培养基（Floradur-B，Floragard，Oldenburg，德国）中，使用Percival AR-36L3生长箱（CLF PlantClimatics GmbH，Wertingen，德国；12小时光照周期，230微摩尔/平方米的光子通量密度，23°C/21°C的昼夜温度，70%相对湿度）。从5周大的植物上切下完全展开的莲座叶，用尼龙网（孔径50微米，1厘米×2厘米）在叶片背面刷涂约100微升孢子悬浮液（5×10^6个孢子/毫升），以在整个叶片表面保持一层薄薄的接种物。接种后的叶片在黑暗的潮湿环境中于25°C下培养。植物体内的附着器（PA）包括叶片表面的预穿透附着器，早期生物营养阶段（BP）包括穿透后的附着器和年轻的生物营养菌丝，分别在感染后22小时和40小时收集。为此，首先用双面胶带将叶片正面粘在培养皿上，然后用镊子剥离受感染的表皮部分，并立即在液氮中快速冷冻。为了采集NP阶段的样本，在感染后60小时，用手术刀切下呈现透明且浸水的坏死叶片组织，并在液氮中快速冷冻。所有样本随后在液氮中研磨，并按照上述方法提取总RNA。每个生物学重复实验包括每个时间点、每个条件下大约30片叶片的组织。所有提取的总RNA样本的质量和数量通过Qubit荧光计检测和RNA变性琼脂糖凝胶分析进行测量。在准备sRNA文库之前，样本在GenTegraRNA管（GenTegra，Pleasanton，CA 94566，美国）中干燥，并在室温下储存。
**2.2 拟南芥和C. higginsianum基因组的注释**
拟南芥基因组组装（TAIR10）和注释文件从TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org）下载。C. higginsianum基因组组装和注释文件从JGI基因组门户网站（https://genome.jgi.doe.gov/portal/）下载。对于C. higginsianum基因组，使用RepeatMasker v4.1.5（Smit和Hubley，2015年）对重复区域进行注释。首先使用BuildDatabase命令和默认参数从基因组组装创建RepeatModeler数据库。然后使用RepeatModeler v2.0.3（Smit和Hubley，2015年）对基因组组装进行运行，并使用-LTRStructoption标志来识别长末端重复序列（LTR）逆转录转座子结构。使用RepClassifier GPLv2（Smit和Hubley，2015年）进行两轮分类细化。将分类和未分类的重复序列与RepBase v23.08 fngrep参考数据库合并成全面的重复序列库。最后，使用RepeatMasker在基因组组装中屏蔽重复序列。rRNA基因使用RNAMMER（Lagesen等人，2007年）和默认参数进行预测。tRNA基因使用tRNAscan-SE 2.0（Chan等人，2021年）和默认参数进行预测。对于拟南芥和C. higginsianum基因组，tRNA衍生物片段使用Unitas v1.8.0（Gebert等人，2017年）和默认参数进行注释。
**2.3 文库制备、测序和分析**
使用NEBNext Small RNA Library Prep Set按照制造商的说明构建sRNA文库。文库在特拉华大学DNA测序与基因分型中心（Newark，DE，美国）使用Illumina NextSeq 500平台进行单端模式（100 bp）测序。使用Cutadapt v4.10（Martin，2011年）对测序接头进行修剪，参数如下：-a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC -g GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC -u 1 -m 10 -j 0 --max-n 0 -o sample.fq。使用MultiQC v1.8（Ewels等人，2016年）评估读取质量。使用Bowtie v2.4.5（Langmead和Salzberg，2012年）将清洁读取序列与拟南芥和C. higginsianum基因组及其相应的基因组特征对齐。原始读取计数进行归一化。对rlog转换后的计数进行主成分分析（PCA），以评估生物学重复实验的聚类情况。在确认聚类一致后（图S1），使用R v4.3.0（R Core Team，2023年）进一步可视化数据。
使用最新版本的miRBase（https://www.mirbase.org）识别拟南芥的miRNAs，这些序列是拟南芥特有的。由于真菌miRNAs（milRNAs）的注释不足且缺乏标准化的预测框架，因此我们没有对C. higginsianum进行milRNA特异性分析。使用DESeq2 v1.40.2（Love等人，2014年）在R中进行miRNAs的差异积累（DA）分析。输入数据包括来自Bowtie2对齐的原始miRNA读取计数。Wald测试用于计算条件间差异表达的p值，显著性阈值为α=0.05。使用ggplot2包v3.4.4（Wickham，2016年）生成图表，用于探索性数据分析和解释。Unitas流程的原始读取计数进行归一化，可视化也使用R创建。
**3 结果**
**3.1 C. higginsianum感染周期不同阶段的sRNA特征不同**
为了识别C. higginsianum感染拟南芥过程中涉及的sRNAs，我们从五个不同阶段生成了sRNA文库，每个阶段有三个生物学重复实验。将三个感染阶段（即植物体内形成的附着器（PA）、生物营养阶段（BP）和坏死营养阶段（NP）与两个无菌真菌阶段（即液体培养的菌丝（MY）和体外形成的附着器（VA）进行了比较。为了识别来自植物和真菌双方的sRNAs，我们将所有读取序列映射到相应的参考基因组：拟南芥的TAIR10（https://www.arabidopsis.org）和C. higginsianum的Colhig2（https://genome.jgi.doe.gov/portal/）。在PA、BP和NP阶段，大约70%–80%的sRNA读取序列映射到拟南芥基因组，而在C. higginsianum基因组中仅映射5%–17%。这与这些阶段代表C. higginsianum和拟南芥之间的活跃相互作用一致，其中拟南芥提供了用于RNA提取的大部分生物量。相比之下，在MY和VA阶段，40%–70%的读取序列映射到C. higginsianum基因组（图S2）。为了进一步表征sRNA群体，我们分析了不同感染阶段（PA、BP和NP）和对照阶段（MY和VA）的sRNA大小分布。与典型的真菌sRNA类别一致（He等人，2023年），C. higginsianum的sRNAs在所有阶段都显示出29个nt长的显著峰值，除了NP阶段（图S3A）。NP阶段显示出明显不同的大小分布，其特征是18个nt长的峰值。另一方面，拟南芥（A. thaliana）的sRNAs在附着器（PA）和生物营养阶段（BP）都显示出最高的峰值在30个核苷酸（nt）处，而在坏死营养阶段（NP）则显示出最大峰值在21个nt处。在PA和BP阶段，次级峰值出现在18、21、24和33个nt处。同时，NP阶段的sRNA丰度水平在18到34个nt的广泛范围内都很高（见图S3B）。这说明了sRNA群体之间的差异，不仅存在于不同生物体之间，也存在于感染过程的不同阶段之间。
3.2 感染进程伴随着宿主和病原体sRNAs的减少
为了理解感染过程中sRNAs的基因组起源，我们注释了来自C. higginsianum基因组的共同特征，包括核糖体RNA（rRNAs）、转运RNA（tRNAs）和重复元件，因为这些信息对于这个物种来说是不可用的。对于rRNAs，我们发现了223个基因，分别对应于145个8S、40个18S和38个28S（见表S1）。我们还注释了354个tRNAs（见表S2）。我们进一步发现，基因组的5.55%由重复元件组成，其中2.00%是逆转录元件，2.58%是DNA转座子，0.01%是滚环，0.96%未分类（见表S3）。这些注释为研究C. higginsianum感染拟南芥期间sRNAs的起源和潜在功能提供了基础的基因组背景。为了研究C. higginsianum感染过程中sRNAs在基因组特征中的分布，我们分析了PA、BP、NP和VA阶段的sRNA丰度，并按基因组特征对读段进行了分类。我们观察到C. higginsianum不同感染阶段的sRNA丰度存在差异（见图1A）。在所有特征中，TEs和rRNAs显示出最高的sRNA丰度。这两个特征在五个感染阶段都表现出相似的表达模式，TEs的丰度始终高于rRNAs。相比之下，基因和CDSs的sRNA丰度略低于TEs和rRNAs。它们的水平在MY和VA阶段达到峰值，在PA和BP阶段下降，在NP阶段显著减少。tRNAs在分析的基因组特征中显示出最低的sRNA丰度。它们的水平在PA和BP阶段最高，在MY和VA阶段略有下降，在NP阶段急剧减少。所有这些都表明C. higginsianum中的sRNA水平因特征和阶段而异，在NP阶段显著下降。
图1：C. higginsianum和拟南芥感染过程中的阶段特异性基因表达动态。C. higginsianum（B）和拟南芥（A）的sRNA映射到每个基因组特征的情况。（A）y轴显示了不同阶段的RNA丰度（以每百万读段计，RPM）：在植物附着器（PA）、生物营养阶段（BP）、坏死营养阶段（NP）、体外附着器（VA）和菌丝体（MY）。三个重复实验用不同的颜色表示（蓝色、芥末黄和橙色）。x轴代表各种C. higginsianum特征，包括核糖体rRNAs（rRNAs）、转座元件（TEs）、编码DNA序列（CDSs）、基因和转运RNA（tRNAs）。（B）y轴显示了拟南芥在PA、BP和NP感染阶段的RNA丰度（RPM）。x轴表示拟南芥的相应特征，如基因、rRNAs、tRNAs、信使RNA（mRNAs）、microRNAs（miRNAs）、非编码RNA（ncRNAs）、假基因、小核RNA（snoRNAs）和小核RNA（snRNAs）。三个重复实验用不同的颜色表示（蓝色、绿色和芥末黄）。在拟南芥中，基因在所有阶段显示出最高的sRNA丰度，在PA和BP阶段相对稳定，然后在NP阶段略有下降（见图1B）。rRNAs是第二丰富的特征，在NP阶段相比PA和BP略有增加。tRNAs在所有分析的基因组特征中显示出最低的sRNA丰度。它们的水平在PA和BP阶段最高，在MY和VA阶段略有下降（特别是在VA阶段），在NP阶段急剧减少。所有这些都表明C. higginsianum中的sRNA水平因特征和阶段而异，在NP阶段显著下降。
3.3 C. higginsianum sRNA片段的大小分布表明NP阶段的RNA周转率更高
分析映射到每个特征的读段的大小分布可以提供关于它们在感染阶段处理和周转的见解。C. higginsianum sRNAs映射到rRNA序列的大小分布曲线在PA、BP、MY和VA阶段都显示出29个nt的主峰。相比之下，NP阶段的主要峰值为18个nt，伴随着19到32个nt的广泛sRNA大小分布。虽然MY和VA阶段仅以29个nt的峰值为主，但PA和BP阶段还显示出额外的32个nt的次级峰值，其丰度从PA到BP逐渐增加。在NP阶段，29个nt和32个nt的峰值仍然可以检测到，但不再是最丰富的特征（见图S4）。我们假设rRNA片段分布的差异可能对应于细胞死亡的不同阶段。我们在映射到TEs的C. higginsianum sRNA读段的大小分布曲线中也观察到了类似的模式（见图S5）。在PA、BP、MY和VA阶段，TEs衍生的RNA以29个nt为主峰，而在NP阶段，主要峰值转移到18个nt，伴随着19到32个nt的广泛sRNA大小分布。这种在NP阶段的转变表明TEs衍生的RNA分解增加，这与坏死营养过程中观察到的整体较高RNA周转率一致。映射到真菌基因特征的读段也显示出类似的大小分布模式；然而，在这种情况下，我们在PA、BP和VA阶段观察到单一的显著峰值在29个nt。在NP阶段，主要峰值为18个nt，其次是29个nt的较小峰值（见图S6）。这加强了我们的假设，即NP阶段的较小读段降解模式更高，可能由于NP期间诱导的细胞死亡。
3.4 拟南芥sRNA片段的大小分布也表明NP阶段的RNA周转率更高
我们使用了TAIR10基因组中注释的拟南芥特征（https://www.arabidopsis.org）进行了相同的片段大小分布分析。基因和rRNA衍生的读段的大小分布模式大致相似。在两个特征中，PA和BP阶段都显示出30-33个nt的显著峰值，随后是21个nt的次级峰值。对于rRNA衍生的sRNAs，在PA和BP阶段，峰值出现在18个nt。相比之下，NP阶段的特点是向较短片段转变，主要峰值为21个nt，读段大小分布在18到32个nt之间（见图S8和S9）。这些变化表明NP阶段的RNA周转率增加，与C. higginsianum观察到的模式一致。同样，ncRNA衍生的读段在PA和BP阶段也显示出21个nt的主要峰值。在NP阶段，这个21个nt的峰值保持不变，但丰度在更广泛的18-24个nt范围内增加（见图S10）。这也反映了NP阶段降解活动的增加。相比之下，TEs、miRNAs和snRNAs的读段大小分布曲线在NP阶段都急剧下降。TEs衍生的读段在PA和BP阶段显示出强烈的23-24个nt峰值，但在NP阶段这些峰值消失，映射的读段总体上减少（见图S11）。类似地，miRNAs在所有阶段都显示出一致的21个nt峰值，但它们的丰度从PA到NP显著下降（见图S12）。snRNAs也遵循相同的趋势：虽然PA和BP阶段有明显的24-27个nt峰值，但NP阶段的总体积累减少，分布更平缓（见图S13）。这些结果共同表明，在感染后期，这些特征的sRNA积累显著减少，可能反映了降解动态。
tRNA衍生的sRNAs显示出不同的模式。BP阶段显示出最高的积累，峰值在31、30和32个nt。在NP阶段，峰值转移到30个nt，相邻的峰值在29和31个nt。PA阶段则完全不同，显示出29-35个nt的广泛峰值，但总体丰度较低（见图S14）。这表明tRNA衍生的sRNAs在PA阶段的处理具有阶段特异性，积累减少。最后，snoRNA衍生的读段在所有阶段都保持较低且相对稳定。PA和BP阶段显示出21-23个nt的小峰值，而NP阶段则以21个nt的适度峰值为主。与其他特征不同，snoRNAs在NP阶段没有表现出明显的下降（见图S15）。
3.5 在所有感染阶段都存在差异积累的拟南芥miRNAs核心
为了了解拟南芥miRNAs在感染各阶段的作用，我们对三个不同阶段的已知miRNAs进行了定量和差异分析（见图2A）。我们观察到拟南芥在C. higginsianum不同感染阶段的miRNA表达动态变化，比较中观察到不同的调控模式。在分析的350个miRNAs中，有62个miRNAs在至少一次比较中显示出差异积累（DA）。尽管图2B和C显示了62个上调和18个下调事件，但有些miRNAs在不同比较中同时属于这两个类别。因此，图2B和C中显示的计数代表DA事件，而不是不同的miRNA身份。在这62个独特的miRNAs中，我们识别出一组在所有三个比较中都差异积累的26个miRNAs。
图2：C. higginsianum感染期间拟南芥miRNAs的差异积累（DA）表明miRNAs在PA和NP阶段之间的差异最为显著。（A）热图显示了C. higginsianum各阶段miRNAs的对数2倍变化（log2FC）：在植物附着器（PA）与生物营养阶段（BP）、BP与坏死营养阶段（NP）以及NP与PA之间的对比。深橙色和淡紫色分别表示上调和下调的miRNAs。星号表示显著性水平：*q < 0.05。（B）和（C）直方图总结了每个C. higginsianum阶段中显著上调（log2FC > 0）和下调（log2FC < 0）的miRNAs的数量。这些计数代表差异积累事件，单个miRNAs可能出现在多个类别中。为了更好地了解哪些miRNAs在感染期间上调或下调，我们将它们分为这两类，并分析了它们在阶段比较中的共享情况。我们对上调miRNAs（log2FC > 0）的定量分析显示，有44个miRNAs在三个比较中都上调。有13个miRNAs在BP与PA和NP与PA之间上调。只有两个miRNAs在BP与PA和NP与BP之间都上调（见图2B）。例如，miR396b-5p、miR159a、miR159-3p在所有比较中都显著上调。miR398bc-5p也在所有阶段都上调，但仅在NP/BP与PA阶段的比较中显著。miRNA858a也在所有阶段都上调，但仅在NP与PA阶段的比较中显著。这表明这些miRNAs在整个感染过程中起着稳定的作用。相比之下，下调的miRNAs（log2FC < 0）的重叠较少，分布较窄（见图2C）。只有两个miRNAs在BP与PA和NP与PA之间都下调。有13个miRNAs在NP与BP之间下调。我们没有观察到在所有三个阶段比较中都下调的miRNAs，但我们观察到一个miRNA（miR169b-3p）在BP与PA和NP与BP之间都下调。这些结果表明，在感染过程中，miRNA的上调更为显著且具有阶段特异性，而下调则相对有限。
3.6 少数拟南芥（A. thaliana）的miRNA在真菌感染期间表现出阶段特异性模式
此外，有17种miRNA在不同比较中显示出明显的差异性表达模式（DA），这表明它们在特定阶段具有重要的作用。例如，miR396a-5p和miR170-5p_miR171a-5p在菌核（NP）阶段与菌丝体（PA）相比显著下调，但在菌核与菌丝体阶段相比显著上调。在菌核与菌丝体阶段的比较中，miR396a-5p和miR170-5p_miR171a-5p也上调，但其变化并不显著。这表明这些miRNA在菌丝体阶段具有特定的作用。另外，miR472-5p和miR165ab-3p的表达趋势相反；它们在菌核阶段与菌丝体相比显著下调，但在菌核与菌丝体以及菌核与病原体之间的比较中显著上调。值得注意的是，miR396a-3p在菌丝体阶段与菌丝体相比显著下调，而在菌核与菌丝体以及菌核与病原体之间的比较中显著上调，这表明它们在生物营养型建立和坏死营养型转变过程中具有不同的作用。相反，miR398bc-3p在菌丝体阶段与菌丝体相比下调，尽管这种变化在统计学上并不显著。它在菌核与菌丝体之间的比较中显著上调，但在菌核与病原体之间的比较中并未显著上调。miR858b在菌核阶段与菌丝体相比下调并不显著，但在菌核与菌丝体以及菌核与病原体之间的比较中显著上调，这表明它在菌核形成和菌核阶段具有作用。miR169b-3p在菌丝体与病原体以及菌核与病原体之间的比较中下调并不显著，但在菌核与菌丝体之间的比较中显著上调，这表明它在感染后期具有特定的作用。
3.7 tRF的丰度在拟南芥（A. thaliana）和C. higginsianum中随感染阶段而变化
为了研究植物-真菌相互作用中的tRF动态，我们使用Unitas软件（Gebert等人，2017年）分析了它们在不同感染阶段的丰度。所识别的tRF是根据它们在成熟tRNA和前tRNA结构中的切割位置进行分类的（图3A,B）。这些包括来自前tRNA的tRF，如5′引导序列（tRNA-leader）和含有poly-U末端的3′尾序列（tRF-1s），以及来自成熟tRNA体的片段，如5′-tRFs、3′-tRFs（带有和不带有CCA尾）、5′/3′-tR-halves，以及各种内部映射但不与定义的末端区域对齐的misc-tRFs（Akiyama和Ivanov，2023年）。我们在拟南芥中观察到C. higginsianum感染期间tRF丰度的不同模式（图3C）。在所有类型的tRF中，3′-tRNA halves在所有感染阶段中最为丰富。misc-tRFs排在其次，在菌丝体（PA）和菌核（BP）阶段水平较高，但在菌核（NP）、菌丝体（MY）和菌丝体（VA）阶段降至较低且稳定的水平。5′-tRNA halves显示出类似的趋势：在PA/BP阶段丰富，在NP、MY和VA阶段急剧减少。3′-CCA-tRFs总体上较少，但在菌丝体（MY）阶段有一个明显的峰值，而在PA、BP、NP和VA阶段保持较低水平。5′-tRFs紧随其后，在PA和BP阶段水平相对稳定，在NP、MY和VA阶段减少。接下来是3′-tRFs，在菌丝体（MY）阶段水平最高，在PA和BP阶段水平中等，在NP阶段最低。最后，tRF-1和tRNA leader片段在所有tRF类型中丰度最低。两者在菌丝体（BP）阶段都有一个峰值，其他阶段则保持较低水平（图3C）。总体而言，tRF的水平动态变化，许多类型在菌核（NP）阶段减少。
图3：拟南芥（A. thaliana）中C. higginsianum感染期间tRNA衍生片段（tRFs）的丰度具有阶段特异性。(A) 和 (B) 根据tRNA结构中的来源对各种类型的tRF进行分类的示意图。tRNA-leaders来源于前tRNA结构的5′引导序列。tRF-1s是从前tRNA的3′末端产生的微小片段，其3′末端包含“poly-U”序列。5′ tRFs从5′末端延伸到D-loop；5′ tR-halves从5′末端延伸到反密码子环；3′-tRFs从TψC-loop延伸到3′末端（不包括CCA尾）；3′ CCA-tRFs从TψC-loop延伸到3′ CCA序列；3′ tR-halves从反密码子环延伸到3′末端；misc-tRFs是那些映射到成熟tRNA但不精确对齐到定义的末端区域的片段（Akiyama和Ivanov，2023年）。(C) y轴显示了C. higginsianum不同阶段的RNA丰度（以每百万读数（RPM）表示：在植物中的菌核（PA）、生物营养型阶段（BP）、坏死营养型阶段（NP）、体外菌核（VA）和菌丝体（MY）。三种重复实验用不同的颜色表示（蓝色、芥末黄和橙色）。x轴代表不同的tRF类型。(D) y轴显示了拟南芥（A. thaliana）在PA、BP和NP感染阶段的RNA丰度（RPM）。x轴代表不同的tRF类型。三种重复实验用不同的颜色表示（蓝色、绿色和芥末黄）。我们在拟南芥（A. thaliana）中也观察到了类似的现象（图3D）。最丰富的tRF类型与C. higginsianum中的相同，每种类型都显示出阶段特异性的波动，有些在菌丝体（BP）阶段达到峰值，有些在菌核（NP）阶段下降。当比较C. higginsianum和拟南芥（A. thaliana）在PA、BP和NP阶段的tRNA丰度时，我们发现3p-tRNA halves在拟南芥（A. thaliana）中的丰度高于C. higginsianum，并且在两种物种中都显示出从PA到NP的丰度下降趋势。在C. higginsianum中，misc-tRFs的丰度在各个阶段都减少，尤其是在菌核（NP）阶段大幅下降。相反，拟南芥（A. thaliana）中的misc-tRFs从PA增加到NP。对于5p-tRNA halves，我们在菌丝体（BP）阶段观察到显著差异，拟南芥（A. thaliana）的丰度明显高于C. higginsianum。两种物种的3p-CCA-tRFs丰度都较低。在C. higginsianum中，5p-tRFs从PA阶段到NP阶段减少，而在拟南芥（A. thaliana）中，它们在PA阶段保持稳定但在NP阶段减少。对于3p-tRFs，在C. higginsianum中从PA阶段到NP阶段减少，而在拟南芥（A. thaliana）中从PA阶段到NP阶段增加。对于tRF-1，在C. higginsianum中在菌丝体（BP）阶段达到峰值，而在拟南芥（A. thaliana）中在PA阶段达到峰值。最后，tRNA leader片段在所有tRF类型中的丰度最低。两者在菌丝体（BP）阶段都有一个峰值，其他阶段则保持较低水平（图3C）。总体而言，tRF的水平动态变化，许多类型在菌核（NP）阶段减少。
4 讨论
4.1 不同的sRNA谱型反映了阶段特异性的调控动态
评估读长分布是推断任何给定过程中不同sRNA作用的强大工具（Silvestri等人，2019年）。在C. higginsianum中，PA、BP、MY和VA阶段的主要29 nt sRNA峰值与非经典RNAi途径一致，特别是涉及RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的Dicer独立机制（Weiberg等人，2013年；Wang等人，2016年，2022年）。这些sRNA通常与真菌的毒力有关，正如在其他病原体如Botrytis cinerea中观察到的那样。相比之下，NP阶段表现出一个明显的18 nt峰值和广泛的尺寸分布，这表明宿主对真菌转录本的降解增加或病原体的应激反应（Melnyk等人，2011年）。TE和rRNA衍生的sRNA在NP阶段的急剧下降进一步支持了真菌基于RNA的防御机制的破坏，可能是由于宿主的反击或坏死营养型转变相关的RNA周转。在拟南芥（A. thaliana）中，PA/BP阶段以30–33 nt sRNA为特征（推测与DCL无关），并在21–24 nt处有次要峰值（经典DCL产物），表明活跃的RNA导向DNA甲基化（RdDM）和转录沉默（Melnyk等人，2011年）。在NP阶段转变为主要的21 nt峰值表明向转录后基因沉默的转变（Cao等人，2014年），而广泛的分布（18–34 nt）则暗示了广泛的RNA降解或sRNA群体（例如，tRFs）。TE相关的24-nt siRNAs和其他调节性sRNAs（miRNAs、ncRNAs）在NP阶段的减少突显了随着感染进展植物调节免疫反应能力的减弱。
4.2 不同的sRNA特征来源也反映了宿主-病原体之间的阶段特异性相互作用
在感染过程中，C. higginsianum和拟南芥（A. thaliana）在不同阶段表现出sRNA的来源和丰度的不同但协调的变化。在C. higginsianum中，TEs和rRNAs是sRNA的主要来源，在PA和BP阶段水平始终较高，然后在NP阶段显著减少。尽管tRNA片段的贡献总体上较少，但它们在PA/BP阶段显示出sRNA产生的显著增加，表明可能是由应激引起的、阶段特异性的切割。这些特定tRNA衍生片段的积累可能在功能上具有重要意义，因为它们作为植物和病原体之间跨界通讯的关键信号分子出现（Kusch等人，2023年）。相比之下，拟南芥（A. thaliana）主要从基因生成sRNA，在PA/BP阶段水平稳定，在NP阶段减少。其他来源，如TEs、miRNAs、ncRNAs、snoRNAs和snRNAs，也显示出从PA到NP的类似下降趋势，与真菌的谱型一致。这些观察表明，这两种生物表现出不同的sRNA来源，但在时间上具有同步的模式，表明在感染进展过程中存在相互关联的调控或共享的触发机制。
4.3 在拟南芥（A. thaliana）对抗C. higginsianum的过程中，一些miRNAs在所有感染阶段都显示出差异性表达
我们的研究揭示了宿主在感染过程中的复杂miRNA动态，一些miRNA在所有不同的感染阶段都发挥作用。例如，miR393在感染假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）的拟南芥（Zhang等人，2021年）和感染C. higginsianum的木薯（Pinweha等人，2015年）中显示出丰度增加。我们的结果显示，miR393a-3p在所有三个阶段都上调，这与Pinweha等人（2015年）报告的miR393上调一致，并表明持续抑制生长素信号（因为它靶向TIR1，一种关键的生长素受体）是不同植物-病原体相互作用中的保守反应。此外，miR159-GAMYB通路在多种植物物种中高度保守，包括拟南芥、烟草和水稻（de Oliveira Cabral等人，2024年；Zheng等人，2020年）。GAMYB是MYB家族中的一个转录因子，调节参与植物生长和发育的基因表达，特别是在响应赤霉素激素信号时（Liu等人，2024年）。在烟草中，抑制miR159会导致GAMYB驱动的激活，从而触发PR基因（Zheng等人，2020年）。在我们的研究中，miR159a和miR159b-3p在所有感染阶段的上调表明该通路在C. higginsianum感染期间仍然活跃。然而，在拟南芥（A. thaliana）中，miR159可能起到抑制GAMYB的作用，可能防止生长受阻或程序性细胞死亡等有害效应，从而避免更多的自我损伤并提供长期抗性，而不需要发育成本。这可能意味着miR159的作用取决于上下文和物种。
miR396b-5p在所有比较中也都上调。根据我们的结果，miR396a-5p在NP阶段与PA阶段相比下调，这与Soto-Suárez等人（2017年）的发现一致，他们发现较低的miR396a-5p会释放生长调节因子（GRF）转录因子，以增强拟南芥等植物的坏死营养型防御。最后，根据我们的结果，miR858a在所有三个感染阶段（PA、BP和NP）都上调。这种一致的高表达值得注意，因为Camargo-Ramírez等人（2018年）之前的研究将miR858确定为拟南芥在C. higginsianum感染期间的疾病抗性负调节因子。因此，其过度表达增加了对真菌病原体的敏感性。因此，miR858a的持续上调表明在整个感染过程中抑制或延迟了植物的防御反应。综合这些观察结果，支持miR393、miR159、miR396和miR858在控制激素信号、生长-防御平衡和植物-病原体相互作用中的已知作用。同时，我们的结果显示这些miRNA在C. higginsianum感染的所有阶段都受到一致调控。这表明miRNA的调控在疾病进展过程中既是动态的也是稳定的，共享和上下文特定的机制塑造了植物的反应。
4.4 其他miRNAs在拟南芥（A. thaliana）对抗C. higginsianum的过程中表现出阶段特异性调控
我们的结果显示，不同的miR396家族成员表现出相反的调控作用：miR396a-3p在BP阶段与PA阶段相比下调，但在NP阶段与PA阶段以及NP阶段与BP阶段相比上调。研究表明，miR396通过靶向GRF转录因子来负调控对真菌病原体的免疫（Soto-Suárez等人，2017年）。事实上，这些作者的研究表明，在拟南芥（A. thaliana）MIM396突变体中，miR396水平的降低增强了其对真菌病原体（如P. cucumerina和C. higginsianum）的抵抗力，而miR396的过表达则会增加其易感性。因此，在感染过程中，miR396的水平逐渐下降，从而激活了诸如活性氧（ROS）、胼胝质沉积以及茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路等防御反应。已知miR170/miR171能够调节拟南芥中的Scarecrow样转录因子（Bologna等人，2013年）。其中，Scarecrow样14（SCL14）是一种属于GRAS家族的调节蛋白，参与激活与解毒有害化合物（如外源物质和其他有毒代谢物）相关的基因（Fode等人，2008年）。我们的结果显示，在NP阶段miR170-5p和miR171a-5p的表达下调，而在BP阶段则上调。因此，miR170-5p和miR171a-5p可能通过SCL-TF发挥防御作用，帮助植物应对感染过程中病原体产生的代谢物。本研究中发现miR858b的表达高度依赖于感染阶段：miR858的过表达会增加对真菌病原体的易感性，而其抑制则通过促进黄酮类特异性MYB转录因子的上调和抗真菌化合物（如山柰酚和其他苯丙素类化合物）的积累来增强抵抗力（Camargo-Ramírez等人，2018年）。在我们的结果中，miR858b在NP阶段相对于PA阶段上调，在BP阶段相对于NP阶段上调，但在NP阶段相对于BP阶段下调。这种模式表明，miR858b在NP阶段相对于BP阶段的下调可能有助于触发植物的初始防御反应（PTI），反映了植物试图抵抗感染的努力。此外，我们的结果还表明，miR472-5p在调节植物免疫方面起着复杂的作用，这种作用取决于病原体相互作用的阶段：它在NP阶段相对于PA阶段和BP阶段上调，而在NP阶段相对于BP阶段下调。已有研究表明，杨树中的miR472a通过靶向核苷酸结合位点（NBS）和富含亮氨酸的重复序列（LRR）基因参与对抗坏死型真菌Cystora chrysosperma的防御（Su等人，2018年）。因此，miR472-5p水平的增加可能是拟南芥在感染初期（PA和BP阶段）增强对C. higginsianum防御能力的一种调节反应。miR472-5p在NP阶段相对于BP阶段的下调可能表明植物对病原体的反应发生了变化，因为它在向坏死型生活方式转变时对miR472-5p的依赖性降低，这意味着其防御策略可能在此时发生了变化，可能依赖于其他机制来对抗C. higginsianum。
miR165-5p在NP阶段相对于BP阶段下调，但在NP阶段相对于PA阶段和BP阶段相对于PA阶段上调。miR165/166在生长素和脱落酸（ABA）信号通路中起作用，这两种物质是拟南芥应激反应的关键因素（Jia等人，2015年）。因此，miR165-5p可能通过调节HD-ZIP III转录因子在感染的不同阶段积极调节拟南芥的免疫反应。在感染早期阶段（PA/BP），其上调可能会抑制HD-ZIP III基因的表达，从而抑制ABA介导的防御机制（Zhou等人，2007年），这为病原体的建立创造了有利环境，因为此时植物尚未开始自我防御。相反，在NP阶段其下调可能会激活HD-ZIP III基因的表达，触发ABA响应基因（如RD26）和生长素信号通路，以抵抗真菌的扩散（Zhou等人，2007年）。
miR169家族成员已知在杨树对生物/非生物胁迫的响应中起作用，它们通过靶向核转录因子Y亚基alpha（NF-YA）来发挥作用（Wang等人，2022年）。我们的研究结果显示，miR169-3p在BP阶段相对于PA阶段和NP阶段相对于BP阶段下调，但在NP阶段相对于PA阶段上调。它在NP阶段相对于PA阶段的上调可能反映了杨树的应激反应。我们没有检测到miRNA160的表达变化，而据报道，在感染P. syringae的拟南芥和感染C. higginsianum的木薯中miRNA160的表达会上调（Zhang等人，2021年；Pinweha等人，2015年）。其他一些先前被证实参与拟南芥对抗C. higginsianum防御机制的miRNA家族（如miR773）在我们的结果中未出现（Salvador-Guirao等人，2018年）。这种未检测到的现象可能是由于我们的数据集中没有未感染的拟南芥对照样本。因此，我们只能评估不同感染阶段之间的差异，而无法比较感染状态与未感染状态之间的差异，在感染状态下这些miRNA的表达变化可能已被检测到。总体而言，这些观察结果支持了先前关于这些miRNA在植物防御和应激反应中作用的描述。同时，我们的结果显示，在C. higginsianum感染过程中，它们的调控强烈依赖于感染阶段，某些miRNA在不同阶段表现出相反的表达模式。我们还发现了一些在实验条件下未被检测到的特定miRNA，这表明miRNA谱型高度依赖于感染阶段和所分析的生物学背景。总之，这表明随着疾病的发展，miRNA的调控会发生变化，因为植物会随着时间的推移调整其防御策略。为了更好地说明宿主和病原体的动态关系，我们在示意图（图4）中总结了miRNA和tRNA片段的阶段特异性调控。该图展示了某些sRNA在所有阶段都保持一致调控的情况，而其他sRNA则表现出阶段特异性模式。
4.5 tRFs作为感染动态中的关键角色
我们的结果显示，对于C. higginsianum来说，3p-tRNA片段是所有感染阶段中最丰富的tRFs，这表明它们在真菌感染中起着重要作用。然而，它们的丰度在NP阶段显著降低。实际上，在C. higginsianum中，所有tRFs的丰度在NP阶段都下降，这可能表明RNA发生了降解。3p-CCA-tRFs在大多数阶段的丰度较低，但在MY阶段达到峰值，可能与特定的真菌发育阶段有关。misc-tRFs、5p-tRNA片段和5p-tRFs在早期阶段（PA、BP）的丰度较高，表明它们可能在感染初期起作用。tRF-1和tRNA leader在BP阶段达到峰值，表明它们可能参与了BP阶段的转变，可能对其致病性有所贡献。对于拟南芥来说，3p-tRNA片段的丰度始终高于C. higginsianum，但两者都呈现出从PA到NP逐渐减少的趋势，表明对感染的响应具有保守性。misc-tRFs、5p-tRFs和3p-tRFs在C. higginsianum中减少，而在拟南芥中增加（从PA到NP）。这可能反映了宿主与病原体之间的调控差异。5p-tRNA片段在拟南芥的NP阶段达到峰值，但在C. higginsianum中保持较低水平，表明宿主具有特定的应激反应。3p-CCA-tRFs、tRF-1和tRNA leader在拟南芥中始终较低，表明它们对防御病原体的功能相关性可能较小。misc-tRFs、5p-tRFs和3p-tRFs的相反趋势表明，C. higginsianum可能在感染后期下调某些tRFs，而拟南芥则上调它们作为防御反应。两种物种中3p-tRNA片段的高丰度表明它们在应激/感染期间的RNA调控中具有保守作用（Chen等人，2025年；Pawar等人，2020年）。C. higginsianum中3p-CCA-tRFs在MY阶段的峰值可能与真菌的孢子形成或侵袭性生长有关。然而，我们知道基于连接的sRNA测序在捕获不同tRNA片段方面存在固有偏差（Shi等人，2021年），因此需要进一步研究植物-病原体相互作用过程中的tRNA代谢来验证这一假设。总之，C. higginsianum与拟南芥之间的相互作用反映了由sRNAs介导的持续分子拉锯战。在早期阶段，真菌释放大量的29个核苷酸的sRNA，而宿主则通过多样化的21–24个核苷酸和30个核苷酸的sRNA以及阶段特异性的miRNA调控来应对（例如，早期下调miR396，后期抑制miR858b）。在NP阶段，我们观察到sRNA大小的变化，真菌的sRNA显著减少。这些结果可能表明RNA的周转和降解增加，与宿主细胞死亡有关。同时，拟南芥转向以21个核苷酸的sRNA为主，但其整体调控能力随着感染的进展而减弱。这些结果表明，sRNA动态不仅是宿主-病原体竞争的核心，还突显了RNA周转作为塑造感染结果的关键机制。
作者贡献
P.B.、B.C.M.和R.J.O'C.设计了实验。T-T-H.C.准备了植物-真菌样本并进行了RNA分离。P.B.构建了小RNA文库。C.E.A.分析了数据。P.B.和C.E.A.撰写了手稿的第一稿，所有作者都阅读、评论并编辑了手稿。
致谢
我们衷心感谢Corbin D. Jones博士慷慨提供资源，支持这项工作的顺利完成。这项工作得到了美国国家科学基金会（NSF）对C.E.A.的资助（项目编号IOS-2243536）。R.J.O'C.和T-T-H.C.得到了法国国家研究署（ANR）的资助（项目编号ANR-17-CAPS-0004-01）。BIOGER团队得到了Saclay植物科学（ANR-17-EUR-0007）的支持。这项工作还得到了美国国家科学基金会（NSF）的资助（项目编号IOS-2441478和IOS-2514354）以及法国国家研究署（ANR-17-CAPS-0004-01）和Saclay植物科学（ANR-17-EUR-0007）的支持。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
本文的原始sRNA测序数据可以在NCBI基因表达组数据库中找到，访问号为GSE159900。
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