纯净且含有锌的石墨碳氮化物：一种环保型种子处理剂，可缓解水稻的盐分胁迫

M.S. Amritha | Sudhir Sharma | Jos T. Puthur | Kishore Sridharan | Jason C. White | Om Parkash Dhankher
印度喀拉拉邦卡利卡特大学植物学系植物生理学与生物化学部门，邮政信箱Thenhipalam 673635

**摘要**
气候变化加剧的盐度胁迫对全球水稻生产构成了威胁。尽管已经有许多策略来提高水稻的耐盐性，但利用可持续纳米材料作为种子处理剂的研究仍然不足。因此，本研究评估了通过尿素一步热聚缩合合成的含锌和纯石墨碳氮化物（g-C3N4和Zn/g-C3N4）纳米片在增强水稻耐盐性方面的有效性。合成的g-C3N4具有二维层状结构，厚度约为3-10纳米，其基质中均匀分布着0.7%的锌（Zn），且没有形成次级的ZnO相。纳米片折叠的超薄结构有助于增强种子表面的相互作用。使用g-C3N4和Zn/g-C3N4作为处理剂可以减轻NaCl胁迫引起的发芽率降低和生物量积累。Zn/g-C3N4在通过减少脂质过氧化和活性氧（ROS）积累来有效缓解盐度诱导的膜损伤方面表现优于g-C3N4，这归因于其增强的抗氧化防御机制。锌含量的增加有助于稳定细胞膜，从而维持Na+/K+的平衡。纳米处理通过Ca2+和ABA介导的OsCu/ZnSOD、OsPOX1和OsAPX等基因的上调，激活了氧化还原调节途径，进而提高了抗氧化物质的生物合成。OsSOS1和OsNHX1的差异调节有助于有效管理Na+的运输和液泡隔离，从而防止离子毒性。因此，本研究提出了一种新型、可扩展且环境可持续的方法，即将锌掺入到具有氧化还原活性的π-共轭g-C3N4框架中，提供了一个多功能处理平台，该平台能够增强抗氧化活性并维持离子平衡，以提高水稻的耐盐性和气候适应性。

**1. 引言**
非生物胁迫因素，包括极端温度、干旱和土壤盐度升高，会阻碍植物生长和生产力。气候变化通过改变降水和温度模式加剧了这些非生物胁迫。其中，土壤盐度是一个关键因素，由于海水入侵和蒸发率增加，它阻碍了植物生长，导致渗透压失衡、水分不足、营养吸收不良、光合作用减弱以及细胞损伤不可逆。联合国粮食及农业组织（FAO）指出，盐度已经对14亿公顷的土地产生了负面影响，占全球土地面积的近10%。这一现象影响了全球超过30亿人的主要食物来源——水稻的种植，从而危及全球粮食安全（Jamal等人，2023年；Bose和Pal，2025年）。因此，由于盐度导致的水稻产量下降，迫切需要开发可持续的、以农民为中心的、广泛适用的策略来提高水稻的耐盐性（Sen和Puthur，2020年；Amritha等人，2021年）。从传统育种到现代基因工程的各种策略已被用于提高作物的耐盐性（Singh等人，2020年）。尽管这些方法取得了成功，但由于涉及较高的资源成本，往往给农民带来挑战。在这种情况下，种子处理提供了一种经济高效且适合农民的方法，通过用天然或合成化合物预处理种子来触发有利的生理状态，从而提高植物的抗逆性。在各种现有的处理技术中，化学处理使用大量化学物质作为处理剂，显示出显著提高作物对非生物胁迫（包括干旱、高温和盐度）抵抗力的能力（Louis等人，2023年）。虽然种子和幼苗在处理过程中可以容易吸收各种化学物质，但由于大小、结构问题或缺乏特定载体，它们在吸收某些处理剂时遇到困难，这突显了化学处理的局限性。因此，纳米材料因其纳米级尺寸（1-100纳米）以及较大的表面积和增强的结构及化学稳定性，被视为替代大量化学物质的理想选择。与大量化学物质相比，纳米材料在植物组织中的渗透性、相互作用和保留能力更强，即使在少量使用时也能提高耐逆性和产量，从而减少了传统种子处理相关的化学废物（Roduner，2006年；Amritha等人，2021年）。最近的研究表明，纳米材料在提高植物对盐分和其他非生物胁迫（包括有毒金属）的耐受性方面有效，通过促进均匀发芽、增强幼苗活力和减轻氧化损伤（Almutairi，2016年；Hao等人，2023年；Ashwini等人，2024年）。基于纳米材料的种子处理在缓解盐度胁迫方面显示出有益效果。具体来说，一些纳米材料，如纳米二氧化硅、银纳米颗粒（AgNPs）、纳米壳聚糖和二氧化锰（Mn2O3）纳米颗粒，在番茄、水稻、小麦、绿豆和甜椒暴露于盐度胁迫时，已被证明可以改善发芽、生长、抗氧化防御机制和激素平衡（Almutairi，2016年；Abdel-Haliem等人，2017年；Mushtaq等人，2017年；Abou-Zeid和Ismail，2018年；Sen等人，2020年；Ye等人，2020年）。尽管纳米材料处理取得了积极成果，但其有效性取决于材料的大小和结构以及处理时间等因素，因此需要仔细的表征和剂量优化。在探索用于缓解盐度胁迫的各种纳米材料中，锌（Zn）以纳米颗粒形式（ZnO NPs）受到了广泛关注，因为它作为植物微量营养素在酶激活、膜稳定和激素信号传导中起着重要作用（Ashwini等人，2024年；Ghosh等人，2024年；Ashwini等人，2026年）。例如，使用ZnO NP作为处理剂已被证明可以在盐度胁迫下提高孜然、小麦和羽扇豆的光合作用、渗透调节、抗氧化活性和根系发育，同时降低MDA和钠（Na）的水平（Madadi等人，2016年；Abdel Latef等人，2017年；Wang等人，2020年）。这些发现共同表明，基于锌的纳米材料在盐度胁迫下增强抗氧化防御机制和离子平衡方面具有优势。同时，石墨碳氮化物（g-C3N4）是一种无金属且富含氮的聚合物纳米材料，通过尿素等前体的聚缩合合成，作为一种有前景的生物应用候选材料。其二维层状结构使其能够与植物表面紧密相互作用，而其π-共轭框架和丰富的氮功能提供了一个能够与离子和生物分子相互作用的氧化还原活性平台（Johnson等人，2025a）。Hao等人（2023年）的一项最新研究揭示了g-C3N4在对抗重金属毒性中的作用。该研究进一步证明，电子特性和层状结构有助于代谢激活和氧化还原调节。从材料设计的角度来看，在热聚合过程中将锌掺入富含氮的g-C3N4基质中，可以使氧化还原响应的聚合物框架与锌的已知生理功能相结合。锌有潜力在氮含量高的位置结合，从而在整个基质中分散，而不是形成独立的氧化物相。这种原子级别的协调预计会调节聚合物框架与生物系统接口时的氧化还原行为（Johnson等人，2025b）。因此，g-C3N4与锌结合后的结构和电子修饰可能增强抗氧化反应，并改变早期应激信号的传递，从而提高植物对盐度胁迫的抵抗力。尽管有这些强有力的机制依据，但元数据分析表明，迄今为止还没有研究评估g-C3N4及其含锌衍生物作为种子处理剂在提高植物耐盐性方面的潜力，这突显了本研究的新颖性（图S1）。因此，我们决定填补这一知识空白，并假设用纯g-C3N4处理种子可以通过调节细胞氧化还原平衡来提高耐盐性，而含锌的g-C3N4（Zn/g-C3N4）可能提供额外的微量营养素辅助的抗氧化防御和离子运输机制调节。重要的是，为了确保研究的转化和农艺适用性，所选的盐度水平和纳米材料剂量旨在反映环境相关条件。

**2. 材料与方法**
**2.1. g-C3N4和Zn/g-C3N4的合成与表征**
纯g-C3N4是通过尿素的热聚缩合合成的。简要来说，将10克分析级尿素（Merck，印度）放入一个带盖的氧化铝坩埚（容量50毫升）中，以限制过度升华并允许气体副产物的释放。坩埚在程序化马弗炉中以5°C/分钟的升温速率加热至550°C，并在静态空气中保持该温度2小时。在炉内自然冷却至室温后，使用玛瑙研钵将得到的黄色团聚产物研磨成粉末。对于Zn/g-C3N4，按尿素质量的0.5%添加Zn(NO3)2·6H2O。混合物在机械研磨下充分混合10分钟，然后按照上述相同条件进行热处理。选择这种锌含量是为了确保在富含氮的聚合物框架中低水平掺入锌，同时最小化聚合过程中ZnO相分离或g-C3N4网络结构崩溃的可能性。每种材料制备了三个独立批次以确保可重复性。所得粉末依次用去离子水和乙醇洗涤，以去除残留的可溶性物质和松散结合的表面杂质，然后在60°C下真空干燥12小时。结构表征使用粉末X射线衍射（X′pert3 Powder，PANalytical，荷兰）进行，使用Cu Kα辐射（λ = 1.5418 Å），扫描速率为2°/分钟，范围为10-80°。形态特征使用场发射扫描电子显微镜（FESEM，Gemini SEM300，德国）进行观察。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）、选区电子衍射图案（SAED）和能量分散X射线光谱（EDS）分析使用JEOL JEM 2010（日本）进行，操作电压为200 kV。TEM样品通过超声处理将粉末分散在乙醇中15分钟，然后滴涂在镀碳的铜网格上，并在室温下干燥。

**2.2. 种子材料、种子处理、胁迫处理、生长条件和生物标志物**
印度喀拉拉邦Vyttila的水稻研究站提供了Oryza sativa ssp. Indica var. Vyttila 10（Lavanya）种子用于研究。经过初步筛选（浓度梯度为0 mM、25 mM、50 mM、75 mM、125 mM和150 mM），选择100 mM NaCl作为诱导胁迫的浓度，因为它导致MDA含量增加（约50%）和评估的生长指标显著下降（图S4）。通过剂量和时间依赖性筛选实验，选择了250 µg/L的最佳处理浓度和处理时间为12小时。种子分别用50 µg/L和250 µg/L的g-C3N4和Zn/g-C3N4处理6小时、12小时和18小时，然后暴露于100 mM NaCl和250 µg/L的处理浓度下12小时，结果显示其植物毒性效应和MDA含量较低（图S5）。用去离子水（DI）冲洗后，种子用10%过氧化氢（H2O2）表面消毒10分钟。g-C3N4和Zn/g-C3N4在去离子水中使用浴式超声处理（40 kHz）3小时，以获得均匀分布的悬浮液。种子放入含有相应处理溶液的锥形烧瓶中，在黑暗中以50 rpm的速度摇晃12小时，以防止纳米片沉淀并促进与种子的相互作用。未经处理的表面消毒种子作为对照组。为了研究处理后种子的形态和结构变化，处理过的和未处理的种子（n ≤ 10）用蒸馏水洗涤并干燥（72小时）。完整的、去壳的、切片的种子安装在碳带涂层的样品台上，然后进行溅射镀金。样品使用FESEM观察，无需临界点干燥。

水稻种子在半浓度的Hoagland溶液（PhytoTech LAB，Kanas，美国）中水培生长，以研究形态和生理变化。处理过的水稻种子在塑料罐（12x7x5厘米）中在受控环境中生长（26±2°C，300 µmolm-2s-1的光照强度，55±5%的相对湿度，14/10小时的光周期）。研究包括六种处理：对照组、未处理的条件（g-C3N4和Zn/g-C3N4）、NaCl胁迫（100 mM）以及用NaCl处理的种子（NaCl+g-C3N4和NaCl+Zn/g-C3N4）。为了确定处理对发芽的影响，在48小时后研究了水解酶（包括α-淀粉酶和蛋白酶）的活性（Miller，1959年；Wen等人，2009年），并在含有或不含100 mM NaCl的Hoagland营养溶液中计算72小时后的发芽种子数量。此外，还在相似条件下生长的21天大的幼苗用于短期生理和生化评估。测量了这些幼苗的地上部分/根部的生物量和长度。根据Ma等人（2021年）的研究，部分组织在75°C下烘烤72小时以进行元素分析，而其余组织则在-80°C的液氮中快速冷冻，以便进行进一步的生化和分子研究。2.3. 脂质过氧化、过氧化氢、超氧阴离子和电解质泄漏的估计MDA的定量使用了Heath和Packer（1968年）的方法，计算时采用了消光系数（155 mM-1 cm-1）。样品中过氧化氢（H2O2）的含量则采用Junglee等人（2014年）的方法进行测定。根部的ROS定位使用了2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）染色，按照Kaur等人（2016年）的协议进行，图像由带有荧光功能的显微镜（Leica DM6 B，德国）捕获。根据Doke（1983年）的方法测量了超氧阴离子（O2-），并以硝酸钠（NaNO2）作为标准物质。超氧阴离子的定位使用了NBT染色，并借助带有Axicam 105彩色相机的立体显微镜（Zeiss，Stemi 508，耶拿，德国）进行图像采集，遵循Qiao等人（2015年）的协议。电解质泄漏（EL）通过Lutts等人（1996年）的协议通过测量电导率（EC）来确定。2.4. 钠和其他必需元素的定量组织被采集后，用去离子水（DI）冲洗，并在75°C的烤箱中干燥72小时。干燥后的根和茎组织样本用浓硝酸（HNO3）和H2O2消化（Ma等人，2021年）。使用电感耦合等离子体光发射光谱仪（ICP-OES，iCAP 6500，Thermo Fisher Scientific，美国德克萨斯州）来定量元素。准备了经过认证的参考材料（NIST-SRF 1570a和1547，新泽西州梅楚肯），并使用相同的方法进行分析，以测量微量元素的准确性。校准过程中使用了空白样品（不含任何植物组织）和不同浓度的添加样品以及内标钇（Y）。2.5. 非酶抗氧化剂的估计谷胱甘肽（GSH）和抗坏血酸（AsA）的水平使用改良的Moron（1979年）和Law（1983年）的协议进行测量。L-抗坏血酸和还原型谷胱甘肽被用作样品中AsA和GSH的定量标准。使用Bates（1973年）的方法估计脯氨酸含量，以L-脯氨酸作为标准。类黄酮的提取和花青素的定量按照Mirecki和Teramura（1984年）以及Mancinelli（1975年）的协议进行。2.6. 酶抗氧化剂的估计植物样本提取物按照Polle（1994年）的方法制备。使用Bradford（1976年）的方法定量酶提取物中的蛋白质浓度，脱脂的牛血清白蛋白（第五组分）作为标准。超氧化物歧化酶（SOD）的活性根据Giannopolitis和Ries（1977年）的协议进行评估。抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性根据Nakano和Asada（1981年）的协议进行评估。过氧化氢酶（CAT）的活性根据Kar和Mishra（1976年）的协议进行测量。愈创木酚过氧化物酶（POD）的活性根据Moncousin和Gaspar（1983年）的协议进行评估。谷胱甘肽还原酶（GR）的活性根据Kalt-Torres（1984年）的协议进行估计。2.7. 光合色素组成和荧光参数使用Arnon（1949年）的方法分析了叶片组织中的叶绿素和类胡萝卜素含量。为了测量叶绿素a的荧光参数，使用了Plant Efficiency Analyzer（Handy PEA；Hansatech Ltd.，英国诺福克）这种便携式荧光仪（Strasser等人，2004年）。数据使用Bioenergetics Laboratory（日内瓦大学，瑞士）的Biolyzer HP3程序进行分析。2.8. 基因表达分析使用Quick-RNATM Plant MiniPrep试剂盒（Zymo Research，美国）提取RNA。使用Verso cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific，立陶宛维尔纽斯）将1 µg的RNA转化为cDNA。根据Chhikara等人（2018年）描述的方法，使用基因特异性引物和水稻肌动蛋白1（OsACT1）作为内参基因，使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix试剂盒（Thermo Scientific，立陶宛维尔纽斯）在Eppendorf Master cycler Ep realplex热循环仪（德国）中进行定量RT-PCR。2.9. 统计分析和语言校正研究中的所有生理、生化、酶学、光合和分子数据均来自三个独立的生物重复实验（n=3），而离子组学分析则使用了四个或五个生物重复实验（n ≥4）。表格和图表中的数据以平均值±标准误差（SE）显示，数据标签来自范围测试。使用SPSS 16.0（SPSS Inc.，美国芝加哥）进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），并使用Duncan的多重范围测试在5%的概率水平上进行。使用R语言中的GGally包（版本4.5.1；R Core Team，2025年，奥地利维也纳）进行皮尔逊相关性分析以及散点图、密度曲线和特定处理的箱线图，从而能够比较不同处理下的参数之间的线性关系。使用QuillBot版本29.15.0（Course Hero, Inc.，美国）进行语法和语言校正。3. 结果3.1. g-C3N4和Zn/g-C3N4纳米片的表征g-C3N4的XRD图谱（图S2）显示两个特征性反射峰，分别位于2θ =13.1°和27.4°，对应于三嗪单元的平面内结构排列（100平面）和共轭芳香系统的层间堆叠（002平面）（Sridharan等人，2014年；Johnson等人，2025a和b）。27.4°处的相对宽（002）反射峰表明热处理的g-C3N4具有聚合物性质且部分无序。Zn/g-C3N4样品显示出类似的衍射谱，没有额外的晶体相，也没有观察到表明存在ZnO或其他含Zn物种的明显峰，这意味着在XRD检测阈值内没有分离的ZnO域。FESEM图像（图S3）展示了尿素聚缩过程中形成的特征性二维聚集纳米片，宏观层面上g-C3N4和Zn/g-C3N4之间没有明显差异。在高倍放大下，Zn/g-C3N4纳米片（图S3d）的表面粗糙度略有增加，这可能与分散的Zn物种或聚合过程中引入的结构扰动有关。TEM进一步证实了原始g-C3N4中形成了薄层纳米片（图1a-c）。这些片层部分折叠并重叠，与聚合物g-C3N4的柔性和多层结构一致。HRTEM图像（图1d）显示晶格条纹可见度有限，这是由于g-C3N4的低结晶度和聚合物框架所致。环状SAED图案（图1c的插图）证实了XRD观察到的半结晶结构。原始g-C3N4的EDS谱（图1e）确认主要元素为碳和氮，而检测到的Cu信号来自TEM网格，因此从组成分析中排除。对于Zn/g-C3N4，TEM图像（图1f-h）显示出类似的层状结构和纳米片堆叠。HRTEM（图1i）中没有观察到明显的晶体纳米颗粒或明确的晶格条纹，进一步支持了不存在分离的ZnO域。SAED图案（图1h的插图）与g-C3N4相同，表明在加入Zn后框架保持不变。EDS分析确认Zn/g-C3N4样品中存在Zn（图1j）。相对较低的Zn含量和缺乏额外的晶体相表明Zn物种分散在富含氮的g-C3N4基质中，而不是形成可检测的结晶ZnO纳米颗粒。下载：下载高分辨率图像（792KB）下载：下载全尺寸图像图1. g-C3N4和Zn/g-C3N4纳米片的结构和组成表征。(a-c) 不同放大倍数下的原始g-C3N4的TEM图像，显示薄层纳米片形态；(d) g-C3N4的HRTEM图像，显示其低结晶度的聚合物框架；(c)中的插图显示相应的环状SAED图案；(e) g-C3N4的EDS谱，确认存在C和N（Cu信号来自TEM网格）。(f-h) 不同放大倍数下的Zn/g-C3N4的TEM图像，显示类似的层状纳米片结构；(i) Zn/g-C3N4的HRTEM图像；(h)中的插图显示相应的SAED图案；(j) Zn/g-C3N4的EDS谱，确认存在Zn以及C和N（Cu信号来自TEM网格）。3.2. 经过纳米处理的和未经处理的稻种子的结构变化未经纳米处理的对照种子的外壳SEM显微照片看起来均匀且光滑（图2a）。相比之下，经过g-C3N4处理的种子外壳表面较粗糙，壳层凹槽中有分散的纳米颗粒沉积（图2b），而经过Zn/g-C3N4处理的种子在凹槽中的沉积更为均匀连续，从而增强了与种皮的粘附（图2c）。对照种子的横截面分析显示内胚乳组织有规律，细胞结构不规则，孔隙率高，糊粉层相对较薄。即使在高放大倍数下，也没有观察到与外源物质的相互作用（图2d和g）。相反，经过g-C3N4处理的种子显示出结构化的内胚乳配置，孔隙率降低，细胞壁适度增厚，糊粉层也有所增厚。相比之下，Zn/g-C3N4纳米片的特征是细胞壁和糊粉层紧密堆积，细胞间隙最小（图2e和f）。高倍SEM图像证实了纳米材料在麸层中的大量渗透（图2h和i）。与结构变化一致，元素分析显示经过处理的种子尤其是Zn/g-C3N4处理的种子中的Zn含量增加（73%），与未经处理的种子相比（图S6a）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. 经过纳米材料处理的和未经处理的稻种的SEM图像。(a) 对照种子的外壳层表面视图；(b) 经过250 µg/L g-C3N4处理的种子；(c) 经过250 µg/L Zn/g-C3N4处理的种子。 (d) 对照种子，(e) 经过g-C3N4处理的种子，以及(f) 经过Zn/g-C3N4处理的种子的内部和糊粉层横截面视图，这些种子已经去壳。 (g) 对照种子，(h) 经过g-C3N4处理的种子，以及(i) 经过Zn/g-C3N4处理的去壳种子的的高倍图像，显示麸层上附着有纳米材料。3.3. g-C3N4和Zn/g-C3N4对发芽和稻苗生长的影响在盐胁迫条件下生长的未经处理的稻种子显示出α-淀粉酶（58%）和蛋白酶活性（62%）显著下降，从而导致发芽率（20%）降低，与在对照条件下生长的种子相比。相比之下，经过g-C3N4和Zn/g-C3N4处理的种子在盐胁迫条件下显示出α-淀粉酶（28%和67%）和蛋白酶活性（17%和57%）显著增强。研究发现，Zn/g-C3N4在水解酶活性方面的增强效果优于原始g-C3N4，这也与GP的增加相关，Zn/g-C3N4处理的种子发芽率更高，其次是经过盐胁迫处理的g-C3N4处理的种子。在对照条件下，经过g-C3N4和Zn/g-C3N4处理的种子相对于未经处理的种子显示出类似的增加，因为α-淀粉酶和蛋白酶活性有所提高（图S6 b和c；图3d）。研究还表明，种子处理的效果传递到了幼苗阶段，导致幼苗表型显著改善，而未经处理的种子在NaCl暴露下则表现出不利影响（图3a-c）。下载：下载高分辨率图像（577KB）下载：下载全尺寸图像图3. 在Hogland溶液中含有250 µg/L g-C3N4和Zn/g-C3N4纳米片的未经处理和经过处理的稻种子萌发的情况。 (a) 未经处理的和经过处理的种子在无盐胁迫条件下生长的21天大的稻苗。 (b) 在100 mM NaCl条件下生长的经过250 µg/L g-C3N4和Zn/g-C3N4处理的种子和未经处理的种子。 (c) 在对照、经过g-C3N4处理的和经过Zn/g-C3N4处理的种子中产生的单个幼苗。 (d) 不同处理下的发芽率（%），而(e)、(f)和(g)分别显示了茎和根的长度、鲜重和干重。图表中的条形代表三个重复实验的平均值，误差条表示标准误差，数据标签显示了范围测试。与对照幼苗相比，100 mM NaCl处理显著降低了未经处理的种子产生的茎和根的长度。相比之下，经过g-C3N4处理的种子在NaCl胁迫下的茎和根长度增加了≥63%，而经过Zn/g-C3N4处理的种子在NaCl胁迫下的茎和根长度分别增加了90%和85%。在无压力控制条件下，Zn/g-C3N4处理显著增加了茎和根的长度，其生长改善效果超过了单独使用g-C3N4处理（图3e）。100 mM NaCl处理导致幼苗伸长受到抑制，这进一步体现在茎和根的鲜重和干重均有所减少。相比之下，经过Zn/g-C3N4处理的种子在NaCl压力下表现出显著的生物量恢复，尤其是与未经处理的种子相比，其恢复效果更为明显。在无NaCl的压力控制条件下，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理均增强了茎和根的鲜重和干重（图3f和3g）。

3.4. 处理对脂质过氧化、活性氧和电解质泄漏的缓解作用
未经处理的种子在100 mM NaCl压力下生长的水稻幼苗，其茎中的丙二醛（MDA）水平分别增加了22%，根中的MDA水平增加了73%，而对照组幼苗则没有这种变化。同样，在NaCl压力下，茎中的过氧化氢（H2O2）水平增加了185%，根中的H2O2水平增加了42%。超氧阴离子（O2⁻）水平也显著上升，茎中增加了161%，根中增加了287%（图4a、b和d）。在100 mM NaCl处理下，Zn/g-C3N4处理比g-C3N4处理更能有效降低MDA水平，使茎和根中的MDA水平分别降低了40%。同样，在NaCl引起的盐胁迫下，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理也显著降低了H2O2水平。Zn/g-C3N4处理使两种组织中的H2O2水平降低了约61%，效果优于g-C3N4处理（图4a和b）。在无压力控制条件下，两种处理均降低了MDA、H2O2和O2⁻的水平，其中Zn/g-C3N4处理的抗氧化效果更为显著（图4a、4b和4d）。

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图4. 处理对100 mM NaCl压力引起的脂质过氧化、电解质泄漏以及21天大水稻幼苗元素重新分布的影响。图(a)显示了在对照组和NaCl（100 mM）条件下，经过处理和未经处理的种子生长的水稻幼苗的丙二醛浓度。图(b)显示了过氧化氢含量，图(c)使用H2DCFDA染色显示了活性氧的定位，图(d)显示了超氧阴离子的定位，图(e)使用NBT染色显示了超氧阴离子的定位，图(f)显示了电解质泄漏情况。图(g)显示了每种处理下的钠含量，图(h)显示了Na+/K+比率，图(i)、(j)、(k)分别显示了钾（K）、锌（Zn）和铁（Fe）的含量。

在非盐胁迫条件下，用H2DCFDA处理的g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子根尖显示出微弱的荧光，表明有基部的活性氧产生。相比之下，未经处理的种子在100 mM NaCl压力下生长的根尖在整个分生组织中显示出强烈的荧光，反映了过量的活性氧产生和氧化损伤。然而，用g-C3N4处理过的种子在NaCl压力下生长的根尖荧光减弱，而Zn/g-C3N4处理过的种子根尖的荧光进一步减弱，这表明处理增强了活性氧的氧化还原平衡（图4c）。同样，在非盐胁迫条件下，用硝基蓝四唑（NBT）处理的g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子显示出最小的染色，表明O2⁻的产生减少。然而，未经处理的种子在100 mM NaCl压力下生长的根尖显示出强烈的蓝色染色，表明O2⁻的产生增加。用g-C3N4处理过的种子生长的根和叶子的染色减弱，尤其是在NaCl压力下，Zn/g-C3N4处理过的种子表现出更明显的减弱（图4e）。

未经处理的种子在100 mM NaCl压力下生长的水稻幼苗中观察到的脂质过氧化和活性氧产生增加，导致茎部电解质泄漏显著增加，而根部仅略有增加。而g-C3N4处理使茎部的电解质泄漏减少了48%，根部电解质泄漏增加了23%。Zn/g-C3N4处理使茎部的电解质泄漏减少了58%，根部电解质泄漏增加了32%（图4f）。

3.5. 处理对Na+/K+比率、锌（Zn）及其他微量和常量元素的影响
与在非盐胁迫条件下生长的未经处理的种子相比，经过100 mM NaCl压力处理的未经处理的种子在茎部的Na+含量增加了148倍，在根部增加了19倍，从而导致茎部和根部的Na+/K+比率分别增加了629倍和138倍（图4g和h）。g-C3N4处理通过降低茎部和根部的Na+/K+比率及Na+含量产生了积极影响。然而，Zn/g-C3N4处理的效果更好，分别使茎部的Na+/K+比率降低了81%，Na+含量降低了40%。Zn/g-C3N4处理还降低了根部的Na+含量30%，同时Na+/K+比率增加了76%（图4g和h）。同样，100 mM NaCl引起的盐胁迫使茎部和根部的锌（Zn）含量分别增加了66%和213%（图4j）。g-C3N4处理对锌的积累影响较小。然而，经过Zn/g-C3N4处理过的种子在盐胁迫下，茎部的锌含量增加了109%，根部的锌含量增加了81%。在无压力控制条件下，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子生长的幼苗显示出锌含量的显著增加，其中Zn/g-C3N4处理的锌吸收量最高（图4j）。处理还改善了其他常量和微量营养素（如钾（K）、铁（Fe）、硫（S）、磷（P）、镁（Mg）和锰（Mn）的吸收和储存，表明在盐胁迫下这些有益营养素的吸收得到增强（图4i和k；表S1和S2）。

3.6. 处理对防御系统的增强作用
3.6.1. 脯氨酸和非酶抗氧化剂
在100 mM NaCl压力下，未经处理的水稻幼苗的茎部脯氨酸含量增加了132%，根部增加了35%（图5a）。然而，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理降低了茎部和根部的脯氨酸积累（图5a）。与对照组幼苗相比，未经处理的种子在压力下生长的幼苗的茎部和根部花青素含量分别增加了71%和138%。同样，Zn/g-C3N4处理在压力下进一步增加了茎部和根部的花青素含量，分别增加了35%和79%，超过了g-C3N4处理的效果（图5b）。与花青素类似，100 mM NaCl压力也增加了未经处理的种子生长的水稻幼苗茎部和根部的黄酮类化合物含量（图5c）。Zn/g-C3N4处理在压力下进一步增加了总黄酮类化合物含量，与g-C3N4处理和未经处理的种子在100 mM NaCl压力下的效果相当（图5c）。在无压力控制条件下，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理显著增强了酚类代谢物的积累（图5b和5c）。相比之下，在100 mM NaCl压力下，抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的含量在茎部和根部减少。而g-C3N4和Zn/g-C3N4处理显著恢复了NaCl压力下的AsA和GSH积累。其中，Zn/g-C3N4处理在茎部和根部分别将AsA和GSH含量增加了128%和183%，效果更明显（图5d和e）。

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图5. 100 mM NaCl压力对茎部和根部非酶抗氧化剂、色素含量及光合效率的影响，以及g-C3N4和Zn/g-C3N4处理的缓解作用。图(a)显示了脯氨酸含量，图(b)显示了花青素含量，图(c)显示了水稻幼苗的黄酮类化合物含量，图(d)显示了不同处理下的抗坏血酸含量，图(e)显示了每种处理下的谷胱甘肽水平，图(f)显示了超氧化物歧化酶（SOD）的活性，图(g)显示了抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，图(h)显示了过氧化氢酶（CAT）的活性，图(i)显示了愈创木酚过氧化物酶（POD）的活性，图(j)显示了谷胱甘肽还原酶（GR）的活性，图(k)显示了色素含量（叶绿素和类胡萝卜素含量），图(l)显示了通过Fv/Fm和ETo/CSm测量的光合性能。

3.6.2. 酶抗氧化剂
在100 mM NaCl压力下，未经处理的种子生长的水稻幼苗的茎部和根部蛋白质含量分别增加了27%和14%。用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子在对照组和盐胁迫条件下进一步轻微增加了蛋白质含量（补充图S6d）。在NaCl压力下，未经处理的种子生长的幼苗的茎部和根部SOD、CAT和POD活性增加，但APX和GR活性在两种组织中均下降（图5f-j）。有趣的是，g-C3N4处理显著减轻了NaCl压力对幼苗的氧化损伤，茎部的SOD活性增加，而根部的变化不大（图5f）。对于其余酶，包括APX、CAT和POD，茎部和根部的酶活性均增强，其中根部的活性最高。值得注意的是，在g-C3N4处理下，GR在茎部和根部的活性清除能力相当（图5f-j）。相比之下，Zn/g-C3N4纳米材料处理进一步增强了盐胁迫下的ROS清除能力，这通过SOD活性的显著增加得到证实（茎部增加27%，根部增加20%）。Zn/g-C3N4处理在茎部和根部的APX、CAT和POD酶活性方面优于g-C3N4处理。此外，Zn/g-C3N4处理在盐胁迫下增强了茎部和根部的GSH含量，效果更明显（图5d和e）。

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图5. 100 mM NaCl压力对茎部和根部非酶抗氧化剂、酶抗氧化剂、色素含量及光合效率的影响，以及g-C3N4和Zn/g-C3N4处理的缓解作用。图(a)显示了脯氨酸含量，图(b)显示了花青素含量，图(c)显示了水稻幼苗的黄酮类化合物含量，图(d)显示了不同处理下的抗坏血酸含量，图(e)显示了每种处理下的谷胱甘肽水平，图(f)显示了超氧化物歧化酶（SOD）的活性，图(g)显示了抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，图(h)显示了过氧化氢酶（CAT）的活性，图(i)显示了愈创木酚过氧化物酶（POD）的活性，图(j)显示了谷胱甘肽还原酶（GR）的活性，图(k)显示了色素含量（叶绿素和类胡萝卜素含量），图(l)显示了通过Fv/Fm和ETo/CSm测量的光合性能。

3.6.2. 酶抗氧化剂
在100 mM NaCl压力下，未经处理的种子生长的水稻幼苗的茎部和根部蛋白质含量分别增加了27%和14%。用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子在对照组和盐胁迫条件下进一步轻微增加了蛋白质含量（补充图S6d）。在NaCl压力下，未经处理的种子生长的幼苗的茎部和根部SOD、CAT和POD活性增加，但APX和GR活性在两种组织中均下降（图5f-j）。有趣的是，g-C3N4处理显著减轻了NaCl压力对幼苗的氧化损伤，茎部的SOD活性增加，而根部的变化不大（图5f）。对于其余酶，包括APX、CAT和POD，茎部和根部的酶活性均增强，其中根部的活性最高。值得注意的是，在g-C3N4处理下，GR在茎部和根部的活性清除能力相当（图5f-j）。相比之下，Zn/g-C3N4纳米材料处理进一步增强了盐胁迫下的ROS清除能力和保护作用，这通过SOD活性的显著增加得到证实（茎部增加27%，根部增加20%）。Zn/g-C3N4处理在茎部和根部的APX、CAT、POD和GR酶活性方面优于g-C3N4处理。此外，在非压力条件下，g-C3N4处理也轻微增加了SOD、APX、CAT和POD的活性，而Zn/g-C3N4处理进一步增强了这些反应（补充图S6c和图5f-j）。

3.7. 色素组成和光合参数
盐胁迫导致叶绿素和类胡萝卜素含量分别减少了30%和31%。相比之下，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理在盐胁迫下增加了叶绿素含量33%，类胡萝卜素含量增加了45%（图5k）。同样，在非盐胁迫条件下，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子生长的植物比对照植物显示出叶绿素和类胡萝卜素含量的显著增加（图5k）。在盐胁迫下，通过最大量子产率（Fv/Fm）和电子传输通量（ETo/CSm）测量的光合效率分别减少了30%和71%。另一方面，Zn/g-C3N4处理在盐胁迫下表现出更好的恢复效果，Fv/Fm增加了53%，ETo/CSm增加了627%，优于用g-C3N4处理过的植物（图5l）。同样，在控制条件下，Zn/g-C3N4处理也增强了Fv/Fm和ETo/CSm，优于用g-C3N4处理过的植物（图5l）。

3.8. 基因表达的差异调节
在本研究中，当未经处理的种子在100 mM NaCl压力下生长时，液泡Na+/H+反向转运蛋白基因（OsNHX1）、高亲和力钾转运蛋白（OsHAK1）、液泡内在蛋白1;1（OsTIP1;1）和质膜内在蛋白2;1（OsPIP2;1）的表达分别增加了6.2倍、23倍、12倍和9倍，与在控制条件下生长的未经处理的种子相比（图6a和b；图S6e和f）。g-C3N4和Zn/g-C3N4处理抑制了NaCl诱导的OsNHX1、OsTIP1;1和OsPIP2;1的上调，使其在压力和非压力条件下的表达接近对照组水平。相比之下，与对照组未经处理的植物相比，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理使OsHAK1的表达增加了7倍。在NaCl压力下，g-C3N4和Zn/g-C3N4处理进一步将其增加了11.8倍和10.6倍（图6a和b；图S6e和f）。

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图6. 盐诱导转运蛋白和水通道基因对NaCl压力的特异性响应，显示了处理剂的影响。这些图表展示了以下基因的相对表达水平：(a) 液泡Na+/H+反向转运蛋白基因（OsNHX1），(b) 高亲和力钾转运蛋白（OsHAK1），(c) 对盐分过度敏感的基因1（OsSOS1），(d) 重金属ATP酶2（OsHMA2），(e) 环状核苷酸门控钙通道（OsCNGC14），(f) 脱水响应元件结合蛋白（OsDREB1A），(g) 脱落酸2（OsABA2），(h) 还原型抗坏血酸酶1（OsDHAR1），(i) 谷胱甘肽合成酶（OsGS1），(j) 苯丙氨酸氨裂解酶1（OsPAL1），(k) 查尔酮合成酶2（OsCHS2），(l) Cu/Zn超氧化物歧化酶（OsCu/ZnSOD），(m) 抗坏血酸过氧化物酶（OsAPX1）以及(n) 过氧化物酶（OsPOX1）。与在对照条件下生长的未经处理的未受胁迫幼苗相比，暴露于NaCl胁迫下的未处理幼苗中，对盐分过度敏感的基因1（OsSOS1）的表达增加了5.6倍。然而，在对照条件下生长的未经处理的未受胁迫幼苗，在用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理后，NaCl胁迫下OsSOS1基因的表达虽然增加幅度较小，但仍具有显著性（图6c）。同样，从未经处理的种子中生长出来的并暴露于NaCl胁迫下的幼苗中，重金属ATP酶2（OsHMA2）和ZRT、IRT样蛋白3（OsZIP3）的表达分别增加了5倍和3.9倍。与此类似，与对照幼苗（非盐胁迫）相比，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子在NaCl胁迫下显示出OsHMA2表达的适度但显著的上调，而OsZIP3的表达则恢复到对照水平。在非胁迫条件下，这些基因在使用任一纳米材料处理后均没有变化（图6c和d；图S6g）。

在100 mM NaCl胁迫下，环状核苷酸门控钙通道（OsCNGC14）、缺乏脱落酸的基因（OsABA2；参与ABA生物合成）以及脱水响应元件结合蛋白（OsDREB1A）的表达分别增加了1.7倍、1.5倍和2.1倍。用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理显著增强了OsCNGC14、OsABA2和OsDREB1A的表达，其中Zn/g-C3N4处理下的增幅最大（分别为2.4倍、2.4倍和3.57倍）（图6e–g）。在非胁迫条件下，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理后的种子中，还原型抗坏血酸酶（OsDHAR1）、谷胱甘肽合成酶（OsGS1）、苯丙氨酸氨裂解酶（OsPAL1）和查尔酮合成酶（OsCHS2）的表达与对照幼苗相当。值得注意的是，NaCl胁迫显著增加了OsDHAR1、OsGS1、OsPAL1和OsCHS2的表达，增幅分别为2倍、3.3倍、3倍和2倍（图6h-k）。而从用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子中生长出来的并暴露于NaCl胁迫下的幼苗中，OsDHAR1和OsGS1的表达进一步增加（图6h和i）。同样，在NaCl胁迫下，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理增强了OsPAL1和OsCHS2的表达，其中Zn/g-C3N4处理的增幅最大，分别为5.7倍和3.4倍（图6j和k）。此外，在对照条件下，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子中，Cu/Zn超氧化物歧化酶（OsCu/ZnSOD）、抗坏血酸过氧化物酶（OsAPX1）和过氧化物酶（OsPOX1）的表达与对照幼苗相当。然而，100 mM NaCl诱导的胁迫使OsCu/ZnSOD、OsAPX1和OsPOX1的表达分别增加了1.8倍、1.5倍和1.8倍。在盐胁迫条件下，用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理过的种子中，OsCu/ZnSOD的表达增加了2.6倍和3.3倍。OsAPX1和OsPOX1的表达模式与SOD相似，其中Zn/g-C3N4处理的增幅分别为2.2倍和3.3倍（图6l-n）。

多元皮尔逊相关性分析显示，盐分胁迫由于活性氧种类的增加导致离子失衡，从而对水稻生长和光合作用产生了不利影响。然而，用g-C3N4和Zn/g-C3N4进行纳米处理通过增强酶促和非酶促抗氧化剂、基因调控以及微量营养素的稳态表现出恢复作用（图S7-S14）。活性氧与生物量和光合作用之间存在强烈的负相关。尽管如此，酶促和非酶促抗氧化剂（SOD、CAT、POD、APX、抗坏血酸、谷胱甘肽、酚类、黄酮类）与活性氧之间存在显著的正相关，尤其是在Zn/g-C3N4处理下（图S7-S12）。元素分析显示钠与生长特性之间存在显著的负相关，但这种负相关通过纳米处理得到了部分缓解。此外，纳米处理建立了必需元素（包括K、Ca、Mg、Fe和Zn）之间的正相关，这有助于提高植物的抗逆性（图S12-S13）。离子组学变化与纳米处理诱导的与水通道蛋白和离子转运蛋白（OsTIP1；1、OsHAK1、OsSOS1和OsHMA2）相关的基因的差异性调控有关（图S14）。同样，与酶促和非酶促抗氧化剂合成相关的基因（OsDHAR1、OsGS1、OsPAL1、OsCHS2、OsCu/ZnSOD、OsAPX1和OsPOX1）也通过纳米处理诱导的信号传导和胁迫响应基因（OsCNGC14、OsABA2和OsDREB1A）的上调而受到积极影响（图S14）。这些同步的转录变化保持了抗氧化剂的产生和离子组学平衡，从而改善了幼苗的表现，无论盐胁迫如何。

盐胁迫对水稻的生长和发育构成了重大挑战。与先前的研究一致，当前研究表明，100 mM NaCl引起的盐胁迫显著损害了发芽和随后的生长，对水稻的早期建立构成了关键且持续的阻碍（Sen和Puthur，2020；Singh等人，2023）。由于盐渍农业土壤的电导率（EC）值≥4 dS/m（约40 mM NaCl），并且电导率在5-7.5 dS/m之间的水平已被证明会抑制水稻的发育（Rodríguez Coca等人，2023）。因此，本研究中使用的100 mM胁迫水平（约8-10 dS/m）代表了受盐影响的水稻生态系统中的中等到高盐度水平，而不是极端恶劣的实验室处理条件。在这种明确的胁迫情景下，本研究中经过纳米处理的种子表现出更好的发芽动力学和早期幼苗表现。与传统的纳米处理不同，后者改善了种子表面相互作用和早期生理激活，我们的结果表明，尿素衍生的g-C3N4作为一个结构稳定的微量营养素输送平台和表面相互作用纳米材料发挥作用，尤其是在掺入Zn之后。结构研究证实了即使掺入Zn后，g-C3N4的稳定性仍然存在，表明Zn被均匀整合到层状结构中，而不影响其基本结构（Sridharan等人，2013；Sridharan等人，2015；Shenoy等人，2021）。此外，Zn/g-C3N4的二维层状结构、纳米级曲率和天然孔隙性可能有助于其功能的提升，这一点通过FESEM观察得到证实，显示Zn/g-C3N4处理后的种子涂层上纳米片的粘附更加均匀和增强。种子与纳米片之间的紧密稳定接触可能在吸水过程中增加了种子附近Zn的可用性。这一功能解释还得到了最近研究的支持，这些研究强调了纳米材料与生物界面（如种子和叶片）之间增强的相互作用（Mahakham等人，2017；Fonseca等人，2024；Ashwini等人，2026）。

因此，在100 mM NaCl处理下，用Zn/g-C3N4处理的种子表现出更高的发芽率和幼苗建立能力，这不能仅仅归因于水分吸收的增强，因为Zn作为必需的催化剂和调节剂，在促进储备物质的动员和代谢启动的酶中起作用（Rai-Kalal和Jajoo，2021）。此外，将纳米片应用于种子表面可能为胚胎组织提供部分保护，以抵御NaCl引起的渗透压胁迫。这反过来可能有助于提高种子发芽率，并保持幼苗的活力、长度和生物量。先前的研究已经证实了这一观点，因为ZnO和尿素基纳米处理在盐条件下增强了氮代谢、发芽和生长（Ain等人，2020；Singh等人，2023）。然而，当前的研究通过将这些成分工程化并整合到含有Zn的聚合物纳米基质中，提供了一个更高效和可持续的纳米处理平台，从而扩展了这一概念。研究表明，Na+过度积累和Na+/K+比率升高引起的渗透压胁迫会损害膜完整性，破坏电子传输链，并增加活性氧水平，导致脂质过氧化和电解质泄漏（Chawla等人，2013；Ahmed等人，2023）。然而，在用Zn/g-C3N4处理的种子中观察到的Na+流入减少、活性氧生成减少、脂质过氧化和电解质泄漏减少可以归因于Zn在激活抗氧化系统和通过稳定磷脂和巯基团来维持膜完整性方面的双重作用（Faizan等人，2021）。增强的膜稳定性可能限制了Na+的流入，从而有助于保留K+和其他元素。有趣的是，在盐胁迫下观察到的纳米处理诱导的根系电解质泄漏增加并不一定表明膜损伤。这种反应可能归因于离子的增强隔离、保留和区室化，这有助于在泄漏评估期间提高它们的流动性（Zhou等人，2021；Song等人，2022；Song等人，2023）。元素分析的结果也支持了这一概念。本研究中观察到的在盐胁迫下必需元素的减少在先前的研究中也有报道（Dogan等人，2012）。此外，Ma等人（2021）和Hao等人（2023）已经证明了g-C3N4纳米处理在增强必需元素方面的有益效果，这与它独特的物理化学性质有关，这些性质改善了营养物质的保留和吸收，因为促进了根系生长。Zn/g-C3N4的优异表现可能源于Zn在膜保护和营养吸收方面的双重作用。在Zn/g-C3N4处理下，Si含量的轻微下降可能反映了Zn和Si之间的竞争性吸收（Pavlovic等人，2021）。因此，纳米处理下营养物质的改善为在盐胁迫下观察到的抗氧化和防御反应的增强提供了生化基础。

100 mM NaCl引起的氧化胁迫适度降低了抗坏血酸和谷胱甘肽的含量，同时显示出渗透调节物质的过度积累（Ashraf和Foolad，2007；Sen和Puthur，2020）。用g-C3N4和Zn/g-C3N4处理种子进一步增加了抗氧化剂的数量，其中Zn/g-C3N4在胁迫下显示出酶促和非酶促抗氧化剂的最大增幅。这些发现证实了先前的报告，即g-C3N4在调节氧化还原平衡方面的作用（Ma等人，2021；Hao等人，2023），以及ZnO纳米颗粒通过增强抗氧化酶和苯丙烷类生物合成途径来缓解盐胁迫（Zhou等人，2021；Mahawar等人，2023；Seleiman等人，2023）。此外，在Zn/g-C3N4处理下，微量营养素的改善特别通过增强SOD、CAT和APX来改善了AsA-GSH循环和细胞氧化还原平衡，同时减少了盐胁迫下的脯氨酸积累（Ashraf和Foolad，2007；Mishra等人，2013；Hasanuzzaman等人，2019；Santos等人，2019；Zhang等人，2024）。同样，纳米处理诱导的酶促和非酶促抗氧化剂的增强可能提高了色素浓度和PSII活性，以应对盐胁迫。尽管直接支持这一概念的数据有限，但研究表明，在盐条件下应用ZnO可以增强光合作用和色素含量（Shang等人，2023；Seleiman等人，2023）。此外，在盐胁迫下，Zn/g-C3N4处理增强了光合作用活性，这与观察到的Zn、Cu和Fe含量的增加有关，这些元素对电子传输链的活性和稳定性至关重要（Foyer和Shigeoka，2011；Gomes等人，2013）。除了增强光合作用效率、微量营养素平衡和抗氧化调节外，纳米处理似乎还在转录水平上改变了离子和水的运输，以在100 mM NaCl胁迫下维持细胞平衡。

在未经处理的幼苗中，盐分显著影响了Na+的积累和Na+/K+比率，导致离子转运蛋白（OsNHX1、OsHAK1、OsSOS1）和水通道蛋白（OsTIP1；1、OsPIP2；1）的显著上调。相反，在盐胁迫下，从经过纳米处理的种子中生长出来的幼苗，尤其是那些经过Zn/g-C3N4处理的幼苗，表现出这些耗能转运系统的适度诱导。这种减少与观察到的离子平衡改善和Na+流入减少相符，表明纳米处理减少了与补偿性离子隔离相关的能量密集型过程的必要性（Serrano和Rodriguez-Navarro，2001）。盐分阻碍了植物对营养物质的吸收，本研究中观察到的Zn和Fe水平的增加可能归因于OsHMA2和OsZIP3的上调，这些转运蛋白促进了Zn和Fe的积累（Ajeesh Krishna等人，2020；Gill等人，2021）。尽管微量营养素的浓度增加了，但在经过纳米处理的种子中，尤其是Zn/g-C3N4处理后的种子中，转运蛋白的上调幅度最小，这支持了Zn/g-C3N4增强了种子中营养素保留的假设（Serrano和Rodriguez-Navarro，2001）。在盐胁迫下，纳米处理通过调节Ca2+流入、ABA生物合成和胁迫响应转录因子，激活了经典的胁迫信号通路，从而改善了渗透保护和对氧化胁迫的耐受性，超出了离子传输机制的范围（Mohamed等人，2025）。具体来说，在信号传导层面，Zn/g-C3N4处理过的种子中OsCNGC14、OsABA2和OsDREB1A的表达显著增加。这些应激响应基因的激活促进了抗氧化基因（OsSOD、OsPOX、OsAPX）以及非酶类氧化还原循环抗氧化剂（OsDHAR1和OsGS1）的相应过表达，这与研究中所记录的生化活性增强相一致。虽然仅盐分本身就能增加这些转录本的表达，但经过处理的种子表现出与之相关的转录增加，这有助于提高ROS的解毒效率。因此，这验证了“预处理可以优化而非过度增强抗逆性”的假设（Dawood等人，2022年）。尽管基因被激活，但在盐胁迫下AsA和GSH水平的降低可能表明AsA-GSH循环的快速周转（Mishra等人，2013年）。此外，PAL1和CHS2的上调，加上盐暴露时花青素和黄酮类化合物水平的增加，体现了典型的盐胁迫响应（Walia等人，2005年；Ma等人，2024年）。然而，Zn/g-C3N4处理过的种子中次生代谢产物的显著增加可能归因于锌的可用性提高及其在苯丙素途径中的作用（Hasanuzzaman等人，2019年；Seleiman等人，2023年）。使用纳米尿素和碳基纳米颗粒（Liu等人，2024年；Elbagory等人，2025年）以及在盐胁迫下对棉花、番茄和花生植物使用ZnO纳米颗粒（Aazami等人，2021年；Qian等人，2024年）也观察到了类似的酶类和非酶类抗氧化基因表达的改善。然而，当前的研究表明，结合锌介导的酶活性激活和氧化还原活性碳氮化物信号的Zn/g-C3N4预处理，能够带来更加协调的生理状态，表现为水分动态的改善、离子运输的稳定、氧化还原平衡的优化、次生代谢的增强以及转录激活的适度调节，从而帮助植物更好地应对盐胁迫。

5. 结论
当前的研究表明，将g-C3N4与锌结合使用，以及用原始g-C3N4对种子进行预处理，可以提高水稻对盐胁迫的耐受性（图7）。持续的锌生物可用性和纳米片与种子表面的相互作用共同作用，增强了ROS的清除能力，减少了离子转运蛋白的激活，并提高了膜稳定性。在盐胁迫条件下，经过处理的种子中观察到的转录变化，包括与抗氧化剂相关的基因的激活，有助于改善氧化还原平衡和整体植物表现。Zn/g-C3N4预处理似乎能够以节能的方式促进植物的抗逆适应，这体现在生理稳态的提高和对明显补偿性应激反应的需求减少。Zn/g-C3N4相较于原始g-C3N4的优越性能，凸显了其作为一种利用生物相容性和地球上丰富的元素来赋予植物非生物胁迫耐受性的可行技术的潜力。此外，未来的研究方向应集中在由g-C3N4预处理所改变的调控网络上，采用包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学在内的先进方法。同样，还需要通过田间实验和在多个农业生态区的研究来进一步验证其环境相关性，以评估其在土壤-植物系统中的生态毒理学影响和行为。

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图7. 由g-C3N4和Zn/g-C3N4种子预处理诱导的综合生理、生化和分子响应，这些响应增强了水稻的盐胁迫耐受性。

资金来源
本研究得到了印度科学研究院（CSIR）、印度政府（JRF和SRF）、IIE-USA、USIEF-India（富布赖特卡拉姆博士研究奖学金）、印度科技部（DST）FIST项目资助（SR/FST/LSI-532/2012）、印度科技部-SERB（SUR Grant，SUR/2022/002538-G）以及美国农业部（USDA-NIFA-AFRI 2020-67022-32416）的资助。

CRediT作者贡献声明
Sudhir Sharma：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究、正式分析。
M.S. Amritha：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析。
Jason C. White：撰写——审阅与编辑、验证、资源提供。
Kishore Sridharan：撰写——审阅与编辑、监督、资源提供、方法学、概念化。
Om Parkash Dhankher：撰写——审阅与编辑、监督、资源提供、项目管理、资金获取、概念化。
Jos T. Puthur：撰写——审阅与编辑、监督、资源提供、项目管理、资金获取、概念化。