鲍义登|薛燕王|李明|李伟华|李阳硕|张静|王宇|于中家|张楠
佛山大学动物科学与技术学院，中国佛山
**摘要**
滑膜支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是一种重要的家禽病原体，可引起多系统病理损伤，尤其是传染性滑膜炎，给家禽产业带来显著的经济损失。替米考星（Tilmicosin，TMS）是治疗支原体感染的一线抗菌药物；然而，其难以渗透到受MS感染的鸡的关节组织中，从而影响了临床疗效。从 Stephania tetrandra 中提取的生物碱——辛诺明（Sinomenine，SIN）具有特定的抗关节炎和抗炎作用。先前的研究表明，TMS 和 SIN 的联合使用对 MS 感染具有协同效应，但其作用机制尚不清楚。本研究旨在通过分析受 MS 感染鸡体内的药代动力学变化和抗炎作用，阐明 TMS 和 SIN 的协同机制。
**方法**
采用微透析技术比较了单独使用 TMS 和 SIN 或两者联合使用的药代动力学。收集膝关节样本进行组织病理学检查，并使用苏木精-伊红（hematoxylin–eosin）和番红花红-O-快绿（safranin O–fast green）染色。通过 RT-PCR 测定滑膜组织中的炎症细胞因子 mRNA 水平，同时通过 Western blotting 和四色免疫荧光技术评估 JAK1、p-JAK1、STAT3 和 p-STAT3 的表达和亚细胞定位。
**结果**
联合治疗显著增加了前三天内 TMS 的浓度-时间曲线下面积，同时减少了早期阶段 SIN 的暴露量。与单药治疗相比，MIX 组的 MS 细菌负荷显著降低。SIN 显著减轻了滑膜和软骨损伤，下调了促炎细胞因子，并抑制了 JAK/STAT 信号通路的激活。这些发现表明，SIN 可增强 TMS 在关节部位的积累，并发挥协同抗炎作用，为 MS 感染的优化临床治疗提供了科学依据。
**引言**
滑膜支原体（MS）已成为全球家禽生产中重要的流行病病原体，其流行率凸显了其大流行的潜力。在欧洲的商业产蛋鸡中，基于 PCR 的检测显示感染率从波兰的 29% 高至英国的 78.6%，德国（75%）、法国（68%）和葡萄牙（66.7%）也有类似的高感染率（Kursa 等，2019）。西班牙东部的血清学和分子调查显示，商业鸡群中的 MS 血清阳性率为 74%，后院养殖系统中的阳性率为 95%（Cortés 等，2021），表明该病原体在多种生产系统中广泛传播。作为一种具有重大流行病学意义的条件性病原体，MS 通过水平（接触）和垂直（卵传播）途径传播（Galluzzo 等，2022）。感染会导致多系统病理损伤，典型临床表现包括由于呼吸道黏液纤毛功能障碍引起的持续咳嗽和喘息；由于关节滑膜囊炎引起的跛行和运动障碍；以及生殖道感染导致的产蛋量显著下降和蛋壳质量异常（Sun 等，2017）。这些病理过程共同降低了生产性能指标，包括日增重和饲料转化率，最终增加了鸡群的淘汰率，给家禽产业造成了巨大的经济损失。MS 感染的快速传播及其对生产的严重影响迫切需要全面研究其传播机制、疫苗策略和生物安全干预措施。
替米考星（TMS）是一种专门用于牲畜和家禽的大环内酯类抗生素，广泛用于治疗猪和鸡的支原体感染。然而，随着抗菌药物耐药性的不断出现，越来越多的临床分离株表现出对 TMS 的耐药性（Wang 等，2022）。即使选择了适当的抗菌药物，由于剂量过低或治疗时间过短导致的药物浓度不足，仍然是耐药性发展的主要因素。MS 感染主要影响关节、足垫和龙骨等血液循环较差的部位。这种有限的血管化阻碍了药物向感染部位的充分分布，从而降低了治疗效果并促进了耐药性的产生。Yanxiu 等（Yan 等，2023）报告称，尽管 TMS 常用于控制牲畜和家禽的支原体感染，但其组织渗透率仅为 51%。对于 MS 感染，单独使用抗菌药物面临两大挑战：首先，药物难以渗透到关节组织中，限制了其在主要感染部位的治疗效果；其次，MS 感染通常是慢性的——细菌主要在急性期定植于关节，而在后期细菌负荷显著减少，但关节炎症状往往仍然存在（Yan 等，2023）。因此，抗菌治疗在这个阶段通常无效，这突显了探索新型治疗策略的必要性。近年来，结合天然化合物和抗生素以降低毒性和增强疗效的方法得到了认可和普及（Malczak 等，2023）。辛诺明（SIN）是从 Tetrandraceae 植物中提取的生物碱，具有抗炎和镇痛作用，对关节炎有特殊效果（Huang 等，2022）。在本研究的初步实验中，建立了鸡关节炎 MS 的急性感染模型，发现 TMS 与 SIN 联合使用对 MS 感染具有协同作用。联合使用后，滑液中的 MS 数量显著减少，SIN 还显著改善了红肿和发热等炎症症状。然而，其协同机制仍需进一步阐明。TMS 可直接杀死 MS，而 SIN 可促进 TMS 在鸡膝关节中的积累。此外，它们的协同作用也可能是 TMS 对 MS 的抗菌作用和 SIN 对炎症的抑制作用共同作用的结果。基于此，研究关节中药物浓度的动态变化以及 SIN 对 MS 诱导的关节炎的抗炎机制尤为重要。
**材料与方法**
**实验动物分组和感染方法**
8 周大的 SPF 鸡（新星大华农牧有限公司）随机分为 5 组（每组 6 只）：3 个实验组、1 个阳性对照组和 1 个阴性对照组。三个实验组和阳性对照组均用 MS 标准菌株 WVU1853T（中国兽药监督研究所）进行感染，阴性对照组接受假处理。感染模型采用双途径接种方法，即每侧跖垫皮下注射 0.5 mL 与每个膝关节关节内注射 1 mL，每天间隔 8 小时连续接种五天。实验组和阳性对照组的接种浓度为 5 × 10⁸ CFU/mL，阴性对照组接受等体积的无菌 PBS。所有体内实验均获得佛山大学动物伦理委员会的批准（批准编号：2022048）。
**药代动力学实验**
三组感染鸡分别通过灌胃给予 100 mg/kg 体重的 SIN（西安瑞林生物技术有限公司）、15 mg/kg 体重的 TMS（湖北若明生物技术有限公司）以及 15 mg/kg 体重的 TMS 和 100 mg/kg 体重的 SIN（连续三天，每天一次）。将 MS 感染的鸡固定在笼中，并使用 MD-2000 线性探针（BioS，美国）穿过鸡的关节腔，确保半透膜部分位于关节腔内。在给药前收集 0 小时的关节透析液。在给药后 1～12 小时、24～36 小时、48～60 小时以及 72 小时分别收集关节透析液。透析液样本在 4°C 的冰箱中保存两周，并使用 HPLC-MS/MS（LCMS-8045，岛津公司，日本）进行分析。
**SIN 的微透析回收率检测方法**
采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法。流动相由 0.1% 甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成。多反应监测（MRM）模式下监测的离子对为 330.10→181.00 和 330.10→207.00。检测限（LOD）为 2 ng/mL，定量限（LOQ）为 5 ng/mL。线性范围为 5–500 ng/mL，R²>0.999。体外正向回收率（RR）和反向回收率（RL）分别为约 39.82% 和 40.19%，最佳流速为 1.0 μL/min，且与药物浓度无显著相关性。体内正向回收率约为 39.92%，平均反向回收率为 41.68%，用于校正鸡关节中游离 SIN 的浓度。
**TMS 的微透析回收率检测方法**
MRM 模式下监测的离子对为 869.50→696.40（定量）和 869.50→174.40（定性）。检测限为 2 ng/mL，定量限为 4 ng/mL。使用反向透析法测得的体内平均反向回收率为 41.68%，表明探针在鸡关节中的性能稳定。该回收率用于校正实际游离 TMS 的浓度。
**药代动力学参数**
通过 WinNonlin 8.1.0 软件拟合获得 AUC、Cmax、Tmax、t1/2 和 MRT 等药代动力学参数，并进行统计分析。
**药效学实验**
在首次给药前及给药后 24 小时、48 小时和 72 小时无菌收集鸡膝关节液，每个时间点各取 8 只鸡的样本。将稀释后的 10 μL 流体滴在琼脂板上，然后在 5% CO₂ 培养箱中培养 7～10 天。在显微镜下计数 MS 数量。将感染鸡的临床症状与健康鸡进行比较。首次给药后 72 小时，对每组鸡实施安乐死。使用骨剪和手术剪解剖膝关节，并将其浸泡在 4% 组织固定剂中超过 48 小时。脱钙后，沿中矢状面切割膝关节制备组织切片。通过苏木精-伊红（HE）染色和番红花红-O-快绿（safranin O-fast green）染色观察滑膜的病理变化。
**RT-PCR 检测炎症因子 mRNA 表达**
从健康组、感染组和治疗组（给药后第 3 天）收集膝关节滑膜组织，并立即在液氮中快速冷冻保存。使用武汉海威尔生物工程有限公司的 RNA 提取试剂盒通过裂解、氯仿分离、异丙醇沉淀、乙醇洗涤和无 RNase 水溶解等步骤提取总 RNA。随后，在 37°C 下使用 Takara RR036A 逆转录试剂盒将 2 μg RNA 逆转录为 cDNA，时间为 15 分钟和 85°C 5 秒。准备含有 SYBR Premix Ex Taq II、正向和反向引物及 cDNA 模板的 25 μL 反应混合物，并在 Thermo Fisher 荧光 PCR 仪器上进行两步 PCR：95°C 30 秒进行初始变性，随后进行 40 个循环，每个循环为 95°C 5 秒和 60°C 30 秒。检测 NOS、IL-1β、IL-17、IL-6、IL-17、IFN-γ 和 PGE2 的 mRNA 水平，以 β-actin 作为内参基因。使用 2^-ΔΔCt 方法计算相对表达水平。
**Western blot 结合免疫荧光检测信号通路蛋白表达**
在蛋白质水平上，EDTA 脱钙后机械研磨膝关节滑膜组织。使用上海比博生物工程有限公司的总蛋白提取试剂盒裂解组织，并通过 12,000 × g 离心收集上清液。使用 BCA 方法标准化蛋白质浓度。将 10 μg 样品与 Loading Buffer 混合并在 90°C 下变性 10 分钟。然后，将混合物进行8% SDS-PAGE（70 V→100 V）处理，并转移到用甲醇活化的PVDF膜上，使用湿转移系统（恒定电流100 mA，在冰上孵育120分钟）。膜在室温下用无蛋白封闭液封闭10分钟，然后在4°C下与来自MyBioSource的兔抗JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3（1:1000）孵育过夜。用TBST洗涤膜3×10分钟后，膜在室温下与鸡抗兔IgG-HRP（1:5000）在黑暗中孵育90分钟。使用ECL化学发光成像系统捕获信号。使用Image J软件计算JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3的相对表达水平，以β-actin作为内参来验证联合药物治疗对JAK/STAT通路的抑制效果。使用石蜡切片进行四重免疫荧光染色技术，以评估鸡膝关节软骨组织中多克隆JAK1、多克隆STAT3、Phospho-STAT3（Tyr705）和Phospho-JAK1蛋白的亚细胞定位和荧光强度。组织通过酒精梯度脱水，用TO型透明剂清除，然后在58–60°C下包埋在石蜡中。之后，使用Leica旋转切片机将组织切成3 µm厚的切片。切片在42°C的水浴中漂洗，然后在60°C下烘烤1小时，并在37°C下过夜。切片分别在TO型透明剂I和II中脱蜡15分钟，然后用100%、95%、90%、85%和75%的乙醇各漂洗2分钟。用PBS洗涤后，在pH 9.0的EDTA修复溶液中用微波处理10分钟进行抗原修复。自然冷却后，切片在摇床上用PBS洗涤3×5分钟。每个切片用免疫组化笔圈出，加入3% H₂O₂在室温下在黑暗中封闭25分钟以阻断内源性过氧化物酶。切片再次用PBS洗涤，然后用10%兔血清或3% BSA封闭30分钟。按适当稀释度依次加入一抗（兔JAK1 1:3000、兔STAT3 1:300、Phospho-STAT3 1:2000、Phospho-JAK1 1:3000，均购自MyBiosource或Affbiotech），并在湿润的孵育箱中4°C下孵育过夜。第二天，切片用PBS洗涤3×5分钟，然后加入相应的HRP标记的二抗并在室温下孵育50分钟。用PBS洗涤后，切片在黑暗中用TSA荧光放大试剂孵育10分钟，然后用TBST彻底洗涤。第一轮标记完成后，将结合的抗体通过在pH 6.0的柠檬酸修复溶液中用微波处理10分钟去除。切片再次用血清封闭，然后依次孵育剩余的三种一抗、二抗和TSA。四重标记后，用DAPI染色核10分钟，然后用PBS洗涤。切片用自动荧光淬灭剂处理5分钟，用流水冲洗10分钟，最后用抗褪色封片剂密封。使用倒置荧光显微镜（Mingmei MF53，MS60成像系统）在相应的激发/发射波长下收集2×图像，并通过灰度值评估细胞膜区域中每种蛋白的表达强度。
**统计分析**
所有数据以平均值±标准差（SD）表示。药代动力学参数（包括AUC、Cmax、Tmax、t1/2和MRT）使用Phoenix WinNonlin计算。两组之间的差异使用Student’s t检验进行分析，而多组之间的比较使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey的多重比较检验。相对mRNA表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算，以β-actin作为内参基因。通过ImageJ的灰度值分析量化Western blotting和免疫荧光染色的蛋白质表达水平。P < 0.05被认为具有统计学意义，P < 0.01被认为极其显著。
**结果**
**SIN、TMS及其组合给药后的药代动力学特性**
从给药后0到72小时动态监测了关节腔内SIN和TMS的游离浓度。单独给药或联合给药的SIN以及单独给药或联合给药的TMS的浓度-时间曲线分别显示在图1和图2中。详细的药代动力学数据见附录中的表1.1–1.4。
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**图1.** 单独给药和联合给药后感染鸡关节中sinomenine的浓度-时间曲线。
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**图2.** 单独给药和联合给药后感染鸡关节中tilmicosin的浓度-时间曲线。
**SIN的主要药代动力学参数（包括AUC、Cmax、t1/2和MRT）在单药治疗和联合治疗之间的差异显示在图3.1–3.5中，详细数值见附录中的表2.1–2.2。**与单独使用SIN的组相比，联合给药在第1天和第2天显著降低了SIN的AUC、Cmax、t1/2和MRT（P < 0.05或P < 0.01），而在第3天没有观察到显著差异。在整个实验期间未检测到Tmax的显著差异。**
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**图3.1.** AUC差异分析结果。
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**图3.2.** Cmax差异分析结果。
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**图3.3.** Tmax差异分析结果。
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**图3.4.** t1/2差异分析结果。
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**图3.5.** MRT差异分析结果。**
**TMS的主要药代动力学参数在单药治疗和联合治疗之间的差异显示在图4.1–4.5中，详细数据见附录中的表2.3–2.4。**与单独使用TMS相比，联合治疗在第1天和第2天显著增加了TMS的AUC（P < 0.05），并在第3天极显著增加（P < 0.01）。TMS的Cmax在第1天至第3天显著增加（P < 0.05）。各组之间的Tmax没有显著差异。此外，联合给药后第2天的t1/2和MRT显著增加（P < 0.05），而在第1天和第3天没有显著差异。**
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**图4.1.** AUC差异分析结果。
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**图4.2.** Cmax差异分析结果。
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**图4.3.** Tmax差异分析结果。
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**图4.4.** t1/2差异分析结果。
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**图4.5.** MRT差异分析结果。**
**SIN和TMS在感染鸡关节中的药效学研究**
(1) **细菌负荷的变化**
图5显示了给药后TMS、单独使用SIN及联合使用SIN时感染鸡关节中MS的细菌负荷变化，图6显示了MS数量变化的分析结果。结果表明，与对照组相比，单独使用SIN并未显著减少MS的数量。单独使用TMS后，48–72小时内MS的数量显著减少（P < 0.05）。联合使用TMS和SIN后，24–72小时内MS的数量极显著减少（P < 0.01）。此外，联合组的MS减少幅度大于单独使用TMS组（P < 0.05）。
(2) **临床症状和组织病理学观察**
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**图5.** 单独使用tilmicosin、sinomenine及联合使用后关节中MS数量的变化曲线。**
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**图6.** 单独使用tilmicosin、sinomenine及联合使用后关节中MS数量变化的差异分析。**
**健康鸡与MS感染鸡的关节和足垫比较显示在图7.1中。**MS感染鸡的关节和足垫明显肿胀，肿胀区域有发热感和波动。**
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**图7.1.** 对照组（左）和MS感染组（右）的关节和足垫。**
使用Safranin O快速绿色染色评估组织病理学变化：健康组的软骨组织结构完整，层次清晰分明，软骨层含有足够的蛋白多糖，未观察到明显损伤（图7.2-A）。在MS感染组中，软骨层结构紊乱，蛋白多糖丢失（图7.2-B）。在单独使用SIN和TMS处理的组中，软骨层结构紊乱，软骨层中的蛋白多糖含量减少（图7.2-C,D）。在联合治疗组（MIX组）中，软骨组织更完整，蛋白多糖含量更多（图7.2-E）。Safranin O快速绿色染色评分的差异分析显示在图7.3中。
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**图7.2.** (A) 对照组软骨；(B) MS感染组软骨；(C) SIN组软骨；(D) TMS组软骨；(E) MIX组软骨。**
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**图7.3.** OARSI差异分析。**
****:p<0.05，显著差异；****:p<0.01，极显著差异**
**通过苏木精和伊红（HE）染色评估组织病理学变化：**健康组的表面软骨层结构完整，层次分明。表面附着有一层薄薄的滑膜细胞，细胞形态正常，没有淋巴细胞和单核细胞的增生或浸润（图8.1-A）。在MS感染组中，表面软骨层分布紊乱，软骨细胞空泡减少，出现不规则裂隙，基底线不清晰。细胞形态显著改变，血管周围有大量淋巴细胞和单核细胞浸润（图8.1-B）。在SIN处理组中，表面软骨层结构受损，软骨细胞分布紊乱，空泡变性形成不规则裂隙（图8.1-C）。在TMS处理组中，表面软骨层结构略有损伤，局部纤维化和空泡化软骨细胞。炎症细胞浸润程度显著减少（图8.1-D）。在联合治疗组（MIX组）中，与两个单独治疗组相比，表面软骨层结构更完整，仅有少量毛细血管增生。淋巴细胞和单核细胞的浸润与健康组相似（图8.1-E）。HE染色评分的差异分析显示在图8.2中。
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**图8.1.** (A) 对照组；(B) MS感染组；(C) SIN组；(D) TMS组；(E) MIX组。**
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**图8.2.** Pelletier差异分析。**
****:p<0.05，显著差异；****:p<0.01，极显著差异**
**通过RT-PCR检测炎症细胞因子mRNA表达**
通过RT-PCR检测参考基因（β-actin）和炎症细胞因子基因的CT值，并使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平（表1）。结果显示，单独使用SIN显著降低了IL-1β、IL-6、IL-17、NOS和TNF-α的表达（所有P<0.05）；单独使用TMS仅降低了IL-6和TNF-α的表达（P<0.05）；联合治疗组显著降低了NOS、IL-6、IL-17和PGE2的表达（P<0.05）。
**表1.** 每个基因相对于内参的相对表达水平。**
2-ΔΔct
NOS | IL-1β | IL-6 | IL-17 | TNF-α | IFN-γ | PGE2
--- | --- | --- | --- | --- | ---
MS感染 | 5.95 | 69 | 11.85 | 04 | 7.71 | 49 | 16.03 | 63 | 3.09 | 16 | 11.29 | 78 | 3.27 | 59
SIN | 2.85 | 18 | 4.22 | 79 | 4.28 | 91 | 12.14 | 46 | 2.25 | 04 | 11.00 | 73 | 2.47 | 29
TMS | 2.84 | 08 | 3.90 | 81 | 4.38 | 29 | 14.31 | 77 | 2.27 | 51 | 04 | 13 | 2.45 | 09
MIX | 2.54 | 42 | 51 | 67 | 4.49 | 04 | 11.23 | 24 | 2.29 | 67 | 11.35 | 37 | 2.17 | 20**
**通过Western Blot检测JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3蛋白表达**
将JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3的蛋白条带与β-actin的参考条带进行比较，以计算灰度比（表2）。与健康组相比，感染组中JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3蛋白的表达水平增加。与此同时，与感染组相比，所有治疗组中这四种蛋白质的表达水平均下调，且在MIX组中的下调幅度比单独使用药物的组别更为显著。表2. JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3/β-actin的灰度比值。灰度比值：对照组、MIX组、MS感染组、SIN组。JAK1/β-actin：0.1208、0.1815、0.8753、0.3351；p-JAK1/β-actin：0.7726、0.7849、1.2125、0.7982；STAT3/β-actin：0.1049、0.2372、0.3455、0.2815、0.3237；p-STAT3/β-actin：0.2473、0.2954、0.6783、0.5499、0.6697。图9：下载高分辨率图像（167KB）；下载全尺寸图像。图9. 炎症因子的差异分析。（**：p<0.05，显著差异；****：p<0.01，极显著差异）通过免疫荧光四重染色技术评估鸡膝关节组织中JAK1/STAT3信号通路的亚细胞定位和激活情况。图10显示了通过免疫荧光四重染色技术在鸡膝关节组织中检测到的多克隆-JAK1、多克隆-STAT3、Phospho-STAT3（Tyr705）和Phospho-JAK1蛋白的亚细胞定位和荧光强度结果。P-JAK1蛋白主要表达在骨组织的细胞膜上，其表达强度顺序为：MS组 > SIN组 > MIX组 > 对照组；P-STAT3蛋白主要表达在骨组织的细胞膜上，其表达强度顺序为：MS组 > SIN组 > MIX组 > 对照组；JAK1蛋白主要表达在骨组织的细胞膜上，其表达强度顺序为：MS组 > SIN组 > 对照组 > MIX组；STAT3蛋白主要表达在骨组织的细胞膜上，其表达强度顺序为：MS组 > SIN组 > MIX组 > 对照组。下载高分辨率图像（508KB）；下载全尺寸图像。图10. 多克隆-JAK1、多克隆-STAT3、Phospho-STAT3（Tyr705）、Phospho-JAK1（MS组、TMS组、SIN组、MIX组、对照组）的蛋白表达和荧光强度。讨论：本研究显示，SIN和TMS联合使用显著改善了MS感染鸡的关节病理状况，表现为软骨损伤减轻和炎症细胞浸润减少。值得注意的是，联合治疗的效果优于单独使用任一药物，表明具有协同治疗作用。这一观察结果与先前的研究一致，即天然化合物与抗生素联合使用可以增强治疗效果，同时可能减轻不良反应和抗菌耐药性（Li等人，2022年；Liu等人，2017年；Xiang等人，2023年）。从药代动力学的角度来看，我们的发现表明联合使用改变了两种药物在组织中的分布，表现为SIN浓度降低而TMS浓度升高。这种现象可能是由于涉及细胞色素P450（CYP450）酶的药物相互作用所致。SIN主要通过CYP3A4和CYP2C19代谢，而像TMS这样的 macrolide 抗生素是已知的CYP3A4抑制剂（Liu等人，2025年；Pérez-Del Palacio等人，2017年；Yao等人，2007年；Zhang等人，2022年）。因此，TMS可能会干扰SIN的代谢，从而改变其生物利用度和组织分布。已有报道指出中药化合物与传统药物之间存在类似的相互作用，这支持了联合治疗的合理性，同时也强调了进行仔细的药代动力学评估的必要性。在分子水平上，MS感染显著激活了JAK/STAT信号通路，导致JAK1和STAT3的磷酸化增强以及下游炎症介质的上调。SIN治疗有效抑制了这一通路，表明其抗炎活性与抑制JAK/STAT信号通路密切相关。相比之下，TMS主要减少了IL-6和TNF-α等上游细胞因子的表达，表明其作用机制不同但具有互补性。重要的是，联合治疗通过减少细胞因子产生和阻断细胞内信号转导双重调节，从而产生了更明显的抗炎效果。除了JAK/STAT信号通路外，NF-κB也是炎症基因表达和巨噬细胞激活的公认调节因子（Hayden等人，2011年）。尽管本研究未直接评估NF-κB活性，但观察到的促炎细胞因子减少表明该通路也可能参与其中。未来的研究需要进一步阐明SIN和TMS联合治疗背景下NF-κB信号通路与巨噬细胞极化之间的相互作用。尽管有这些有希望的发现，但仍需承认一些局限性。首先，未直接评估巨噬细胞的极化情况，包括CD86（M1）和CD206（M2）等表型标记物的检测将有助于更深入地解释机制。其次，本研究主要关注JAK/STAT通路，而其他关键炎症通路（包括NF-κB和NLRP3炎性小体）未得到全面研究。第三，虽然提出了药代动力学相互作用，但仍然缺乏酶水平上的直接实验验证。最后，由于本研究是在动物模型中进行的，因此需要进一步的临床验证以确认其转化相关性。尽管如此，本研究具有几个显著的优势。它结合了药代动力学分析、组织病理学评估和分子研究，提供了对SIN和TMS协同效应的全面理解。此外，它为天然化合物和抗生素联合使用作为治疗MS诱导性关节炎的有希望的治疗策略提供了新的见解。结论：药代动力学结果显示，联合使用后SIN在关节区域的分布减少，而TMS的分布增加。药效学结果显示，联合治疗组中的MS细菌负荷显著低于单独治疗组。MS感染对鸡关节造成了显著的病理损伤，MIX组的治疗效果明显优于单独治疗组。SIN组中鸡关节组织中的IL-1β、IL-6、IL-17、NOS和TNF-α的mRNA表达水平显著降低。Western blot分析显示，MS感染通过激活JAK/STAT信号通路引发了炎症反应。SIN抑制了JAK/STAT信号通路的激活，导致炎症因子的表达下调。本研究为MS感染的临床管理提供了新的见解，并为传染性疾病的合理联合治疗提供了参考。作者贡献：邓宝义、王雪燕：研究、初稿撰写、审稿与编辑、可视化；李伟霍：审稿与编辑；李阳硕、李明、常静、王宇：审稿与编辑；张楠：审稿与编辑、资金获取。资助：本研究得到了国家自然科学基金（编号32202866）的财政支持。利益冲突：作者声明无利益冲突。数据和材料的可用性：支持本系统评价的数据来自先前报道的研究和数据集，并已引用。伦理批准和参与同意：所有体内实验均获得了佛山大学动物伦理委员会的批准（批准编号：2022048）。出版同意：不适用。作者贡献声明：邓宝义：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、研究；王雪燕：审稿与编辑、初稿撰写、可视化；李明：审稿与编辑；李伟霍：审稿与编辑；李阳硕：审稿与编辑；常静：审稿与编辑；王宇：审稿与编辑；余中佳：审稿与编辑；张楠：审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金获取。
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