**Kohei Tokioka | Tsuyoshi Nojima | Takahiro Hirayama | Takashi Hongo | Takafumi Obara | Kohei Ageta | Takuro Igawa | Toshiyuki Aokage | Kohei Tsukahara | Tetsuya Yumoto | Hiromichi Naito | Atsunori Nakao**
**日本冈山大学医学院、牙科学院和药学院急诊、重症监护与灾难医学系**
**摘要**
背景：心脏移植一直面临供体短缺的问题；因此，尽管不可避免地会经历温缺血和随后的缺血-再灌注损伤，但来自循环死亡后的心脏捐献已成为一个可行的选择。胆绿素是一种内源性胆汁色素，具有强大的抗氧化和抗炎特性，在多种器官移植模型中显示出对缺血-再灌注损伤的保护作用。然而，胆绿素是否能够减轻循环死亡后心脏捐献中的温缺血损伤尚不清楚。本研究评估了在循环死亡后的大鼠心脏捐献模型中，将胆绿素添加到灌注液和保存液中的效果。
**方法**
在深度麻醉下诱导循环死亡，并维持18分钟的温缺血时间（包括5分钟的等待期）。随后用含有胆绿素的京都溶液冲洗供体心脏，并将其冷藏保存；而对照组的心脏则在移植前两个阶段都使用不含胆绿素的京都溶液进行保存。在再灌注后3小时和24小时对移植心脏进行评估（每组6只）。评估内容包括早期移植恢复情况、心肌损伤标志物、组织学和超微结构变化以及炎症和应激反应基因的表达。
**结果**
胆绿素显著改善了早期移植恢复情况，缩短了复苏时间，并在24小时时提高了左心室分数收缩率。胆绿素处理组的血清肌钙蛋白I水平较低。胆绿素还减少了组织学损伤和炎症细胞浸润。超微结构分析显示线粒体结构和完整性得到保持。早期促炎基因的表达也被抑制。
**结论**
在灌注液和保存液中添加胆绿素可以减轻循环死亡后大鼠心脏移植模型中的缺血-再灌注损伤。这些发现为进一步研究胆绿素在循环死亡后心脏捐献中对心肌的保护作用提供了概念验证。
**引言**
心脏移植仍然是治疗终末期心力衰竭患者的最有效方法；然而，合适的供体持续短缺仍然是一个关键挑战。在许多国家，供体器官的需求与供应之间存在巨大差距。因此，使用循环死亡后的心脏捐献（DCD）已成为一种可行且有前景的方法，这得到了早期临床结果的支持，并且有望大幅扩大供体来源。澳大利亚、美国和欧洲的临床项目报告称，DCD心脏移植的术后生存率与脑死亡后的心脏移植相当，这强调了DCD心脏移植的临床可行性。
尽管取得了这些进展，DCD心脏在再灌注前仍不可避免地会经历温缺血期，这会加剧缺血-再灌注损伤（IRI），成为广泛临床应用的主要障碍。再灌注会导致活性氧突然增加和钙超载，从而导致线粒体功能障碍和心肌细胞死亡。与冷缺血相比，温缺血会导致更严重的ATP耗竭和更强烈的炎症反应。虽然离体机器灌注技术提高了移植器官的保存和功能评估能力，但它技术要求高、成本高昂，且仅限于专业中心。然而，它可能无法完全防止再灌注引发的细胞内氧化和炎症级联反应。
这些限制突显了需要简单、廉价且广泛适用的药物治疗策略来减轻DCD心脏移植中的IRI。胆绿素（BV）是一种内源性血红素代谢物，具有强大的抗氧化和抗炎特性，并能迅速转化为胆红素（BR），后者是一种强效的自由基清除剂。通过BV-BR氧化还原循环，细胞保护能力得到增强，同时BV本身还能抑制促炎细胞因子的表达和白细胞浸润。先前的实验研究表明，胆绿素在多种移植模型中具有保护作用：在肠道移植中，胆绿素提高了存活率并减少了黏膜损伤；在肺移植中，它减轻了氧化应激并保持了功能；在肾IRI模型中，外源性胆红素抑制了组织损伤。在心脏移植中，胆绿素和胆红素已被证明主要在以冷缺血为主的模型中抑制丝裂原活化蛋白激酶的激活和细胞凋亡。然而，胆绿素是否能够减轻DCD心脏中的温缺血损伤尚不清楚。我们假设胆绿素的补充可以减轻这种以温缺血损伤为特征的情况。为了验证这一假设，我们在循环死亡后的大鼠心脏移植模型中评估了早期移植功能和组织学损伤。
**动物和实验设计**
使用近交系雄性Lewis大鼠（200–250克；日本SLC，滨松市），它们被饲养在冈山大学的层流设施中，可以自由获取食物和水。所有程序均获得了冈山大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号：OKU-2023655），并按照其动物实验指南进行。
**循环死亡和移植获取**
在异氟醚麻醉（2%–3%）下，通过下腔静脉给予300 IU肝素进行全身抗凝。通过膈肌切开诱导循环死亡，导致呼吸停止和心脏停止。确认没有自发性心脏收缩和可触及的脉搏。无收缩温缺血时间（aWIT）定义为从确认循环停止到开始冲洗移植心脏的时间间隔，其中包括5分钟的等待期以确认不可逆的循环停止。为了模拟临床相关的较高风险温缺血暴露（根据临床数据，较长的aWIT与更严重的原发性移植功能障碍相关），我们将aWIT设定为18分钟，代表临床报告值的上限。
在完成预定的18分钟温缺血时间（包括5分钟的等待期）后，通过下腔静脉给予10毫升含有胆绿素的京都溶液（ETK）进行灌注冲洗。这种血管内冲洗旨在使缺血心肌在移植前暴露于胆绿素。灌注后，结扎下腔静脉、上腔静脉和肺静脉，保留升主动脉和肺动脉以备后续吻合。然后将供体心脏取出，在4°C下用相同的溶液（含或不含胆绿素）冷藏保存120分钟，直至移植。因此，胆绿素处理组的心脏在血管内冲洗和随后的冷藏过程中都暴露于胆绿素，而对照组的心脏在移植前两个阶段都使用不含胆绿素的ETK溶液（图1）。选择10 μM的浓度是基于先前的实验研究，这些研究表明胆绿素在移植和缺血-再灌注模型中具有可重复的抗氧化和抗炎作用。
**异位心脏移植**
按照先前描述的方法进行异位腹部心脏移植。受体大鼠接受异氟醚（2–3%）麻醉并维持在37°C。供体升主动脉与受体腹主动脉端对端吻合，供体肺动脉与受体下腔静脉端对端吻合，使用10-0尼龙缝线。这种配置建立了逆向冠状动脉灌注，形成了一个非工作的异位心脏模型。
**实验组和时间点**
根据术前生成的随机数序列，将动物随机分配到以下实验组：假手术组（n=6）、DCD组（n=6）和DCD + 胆绿素组（n=6）。假手术组动物被麻醉后立即安乐死，随后快速获取心脏，不诱导循环死亡、等待期或移植。在2个再灌注时间点（3小时和24小时）评估移植效果：3小时（早期阶段）和24小时（急性阶段），以捕捉时间变化。3小时和24小时的评估使用不同的动物组。
**统计分析**
未进行正式的先验功效计算。样本量是根据先前发表的关于胆绿素介导的IRI保护的实验移植研究确定的，这些研究认为每组约6只动物足以检测出功能和组织学结果的生物学差异。分析的参数包括：（1）功能恢复（复苏时间和左心室分数收缩率 [LVFS]，（2）生化标志物（心肌肌钙蛋白I [cTnI]），（3）组织病理学损伤（苏木精和伊红 [H&E] 染色、髓过氧化物酶 [MPO] 和CD68 免疫染色），（4）超微结构完整性（透射电子显微镜 [TEM]），以及（5）炎症反应（通过定量PCR [qPCR] 检测白细胞介素-6 [IL-6]、诱导型一氧化氮合酶 [iNOS]、C-C基序趋化因子配体-2 [CCL-2] 和血红素加氧酶-1 [HO-1]）。
**功能评估**
在3小时和24小时进行功能评估；3小时进行cTnI的生化分析；24小时进行qPCR分子分析；24小时进行组织病理学评估（H&E和免疫组化）和超微结构评估（TEM）。由于干预的性质，外科医生不知道动物的分组情况。然而，所有功能和组织学评估均由两名未参与手术程序的独立研究者以盲法进行。
**功能恢复**
主要在再灌注后24小时评估功能恢复情况，这是评估非工作状态下收缩性能的临床相关时间点。3小时的功能测量是为了了解再灌注的即时动态，作为探索性测量，因为该研究在早期阶段无法检测组间差异。复苏时间定义为从再灌注开始到首次自发性收缩的时间间隔。使用高分辨率超声系统（Vivid i，GE Healthcare，芝加哥，IL）通过腹部途径进行3小时和24小时的超声心动图检查。LVFS的计算公式为：（舒张末期直径 - 收缩末期直径）/ 舒张末期直径 × 100%。
**血清生物标志物**
在再灌注后3小时，在异氟醚麻醉下从下腔静脉采集血液样本。使用高灵敏度大鼠ELISA试剂盒（Life Diagnostics，West Chester，PA；目录编号：CTNI-2-HS）根据制造商说明测量血清cTnI浓度。所有检测均由不知道分组情况的独立研究者重复进行。在这种非工作模型中，血清cTnI通常用作心肌损伤的标志物，受血流动力学负荷的影响较小。
**组织病理学和免疫组化**
在再灌注后24小时，将移植心脏固定在4%甲醛中，包埋在石蜡中，并切成5微米厚的切片。使用先前描述的半定量0–4评分系统（0 = 正常，1 = 轻微水肿，2 = 局灶性变性，3 = 广泛坏死，4 = 大范围坏死伴出血）对心肌损伤进行量化。由盲法观察者从这些分析区域中选择代表性图像。每个心脏切片在光学显微镜下选择5个随机且不重叠的视野，计算5个不同视野的平均得分。
**免疫组化**
在柠檬酸缓冲液（pH 6.0，95°C，20分钟）中进行抗原回收，然后进行过氧化物酶阻断（3% H2O2）。切片在4°C下过夜孵育，使用一级抗体：抗-MPO（Abcam，英国；1:200稀释）、抗-rat CD68（ED1；Serotec；1:200稀释）和抗-rat CD3（CD3-12；Serotec；1:200稀释）。使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物方法和3,3′-二氨基联苯胺进行检测。在每个移植心脏的10个随机选择的高倍视野中计数阳性细胞，并表示为平均值 ± 标准差（SD）。
**透射电子显微镜**
在再灌注后24小时，从左心室游离壁采集约1立方毫米的心肌样本，固定在2.5%戊二醛（0.1 M磷酸盐缓冲液，4°C，2小时）中，然后用1%锇四氧化物（1小时）后固定，脱水后嵌入环氧树脂，切成超薄切片，用尿酰乙酸和铅柠檬酸染色，并在透射电子显微镜（HITACHI H-7650，东京，日本）下观察（×5,000–20,000倍）。
**超微结构损伤**
使用基于先前描述的半定量评分系统（0–4分）评估线粒体损伤。每个移植心脏随机选择5个高倍视野（×5,000倍）进行评估。根据肿胀程度、嵴破坏和膜破裂情况对线粒体损伤进行分级（0 = 正常；4 = 严重结构破坏）。每个动物的平均得分由盲法研究者计算。
**定量实时PCR**
在3小时组中，动物在功能评估后立即安乐死，收获左心室组织进行分子分析。使用Trizol试剂（Invitrogen）从组织中提取总RNA。通过A260/A280比率确认RNA浓度和纯度。一微克的RNA使用PrimeScript RT Master Mix（Takara，日本）进行了逆转录。qPCR使用SYBR Green Master Mix（Toyobo，大阪，日本）在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行。评估了IL-6、iNOS、CCL-2和HO-1的信使RNA（mRNA）水平，以β-actin（Actb）作为参考基因。扩增条件为95°C 1分钟，随后是40个循环：95°C 15秒和60°C 30秒。确认了引物效率（90–110%）。相对表达水平使用ΔΔCt方法计算，并以相对于对照组（对照组平均值=1.0）的倍数增加表示。参考基因β-actin在所有组中的表达均稳定（平均Ct 22.3 ± 0.9）。
统计分析
数据以平均值±标准差（SD）表示。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。由于大多数数据集不显示正态分布，因此适当应用了非参数检验。两组之间的比较使用Mann-Whitney U检验进行，多组之间的比较使用Kruskal-Wallis检验，并在每个预定义的实验领域内进行Bonferroni校正。没有对独立结果领域进行全局校正，因为这些终点是预先定义的并且在机制上是不同的。所有分析均使用STATA 18（StataCorp LLC，College Station，TX）进行。
结果
再灌注后的功能评估
在再灌注后3小时和24小时分别分析了不同的队列（每个时间点每组n=6）。
与未接受BV处理的移植物相比，接受BV处理的移植物自发收缩活动的恢复更快。BV处理组的平均复苏时间为79.0 ± 14.2秒，而非BV处理组为186.3 ± 41.9秒（P= .002）。
在3小时时，两组之间的左心室分数缩短（LVFS）没有显著差异（BV处理组：21.5 ± 2.6% 对比 非BV处理组：17.9 ± 2.5%；P= .065）。在24小时时，两组的LVFS都有所改善，且BV处理组的LVFS显著更高（30.1 ± 1.8% 对比 24.3 ± 1.8%；P= .002）（图2）。
下载：下载高分辨率图像（586KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. DCD大鼠心脏移植模型的实验设计。在全身麻醉下诱导循环死亡，并维持18分钟的温缺血，包括强制的5分钟等待期。然后通过下腔静脉用含10 μM胆绿素的ETK溶液冲洗供体心脏，切除后在同一溶液中冷存120分钟，再进行异位移植。在再灌注后3小时或24小时使用不同的队列评估移植物。DCD表示循环死亡后的捐赠；ETK表示含有细胞外型海藻糖的京都溶液。
下载：下载高分辨率图像（196KB）
下载：下载全尺寸图像
图2. 再灌注后的早期移植物功能恢复和急性心肌损伤。(A) 复苏时间，定义为从再灌注开始到第一次自发收缩的时间间隔。BV处理的移植物比非BV处理的移植物具有更短的复苏时间（每组n = 6）。(B) 再灌注后3小时和24小时的左心室分数缩短（LVFS）。3小时时两组之间的LVFS没有差异，但在24小时时BV处理组的LVFS更高（每组n = 6）。(C) 再灌注后3小时的血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）浓度。BV处理组的cTnI水平低于非BV处理组（每组n = 6）。对照组值低于检测限（LOD），并假设为LOD的一半进行计算。数据以平均值±标准差（SD）表示。***BV处理组与非BV处理组，P< .01；*BV处理组与非BV处理组，P< .05。BV，胆绿素；cTnI，心肌肌钙蛋白I；LVFS，左心室分数缩短。
心肌损伤的生化分析
在再灌注后3小时（每组n=6），BV处理组的cTnI浓度较低（0.33 ± 0.11 ng/mL 对比 0.49 ± 0.10 ng/mL；P= .041）（图2）。
组织病理学和免疫组化发现
在再灌注后24小时（每组n=6），组织学检查显示BV处理组的心肌损伤比非BV处理组减轻。非BV处理组表现出明显的间质水肿、广泛的出血和心肌细胞变性，特征是条纹消失和细胞质空泡化。相比之下，BV处理组显示出轻微到中度的改变，心肌结构基本保持完整，水肿减少（图3，A–C）。BV处理组的平均组织损伤评分显著较低（1.1 ± 0.37 对比 2.2 ± 0.50；P= .004）（图3，G）。
下载：下载高分辨率图像（1MB）
下载：下载全尺寸图像
图3. 再灌注后24小时的结构性心肌损伤。代表性的苏木精和伊红（H&E）染色切片显示：(A) 对照组（n = 6），(B) 非BV处理组（n = 6）和(C) BV处理组（n = 6）。这些切片显示非BV处理组的明显水肿、出血和心肌细胞变性，而BV处理组显示出减轻的结构损伤和保持的心肌结构。透射电子显微镜（TEM）图像显示：(D) 对照组（n = 3），(E) 非BV处理组（n = 3）和(F) BV处理组（n = 3）。TEM分析显示非BV处理组的线粒体肿胀和嵴结构破坏，而BV处理组的线粒体形态保持完整，肿胀最小。(G) 基于水肿、出血、炎症浸润和心肌细胞变性的半定量评估的定量组织损伤评分（0–4）（每组n = 6）。(H) 基于线粒体肿胀、嵴结构破坏和膜破裂的半定量分级의 정량적 초미세 구조적 손상 점수（0–4）（每组n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示。***BV处理组与非BV处理组，P< .01。BV，胆绿素；SD，标准偏差；TEM，透射电子显微镜。
免疫组化分析显示BV处理组的MPO阳性中性粒细胞和CD68阳性巨噬细胞明显少于非BV处理组（图4，A–C）。定量分析确认BV处理组的MPO阳性细胞（P= .004）和CD68阳性细胞（P= .004）显著减少（图4，D和E）。相比之下，在再灌注后24小时，两组中都很少检测到CD3阳性T淋巴细胞。
下载：下载高分辨率图像（877KB）
下载：下载全尺寸图像
图4. 再灌注后24小时的心肌中性粒细胞和巨噬细胞浸润。代表性的免疫组化发现显示：(A) 对照组（n = 6），(B) 非BV处理组（n = 6）和(C) BV处理组（n = 6）。上图：MPO染色显示非BV处理组的中性粒细胞浸润明显，而BV处理组的中性粒细胞积聚减少。下图：CD68染色显示非BV处理组的巨噬细胞浸润明显，而BV处理组的巨噬细胞浸润减轻。(D) 每高倍视野（HPF）中的MPO阳性细胞平均数量（n = 6）。(E) 每HPF中的CD68阳性细胞平均数量（n = 6）。定量分析（D和E）表明BV处理组的中性粒细胞和巨噬细胞浸润比非BV处理组减少。数据以平均值±标准差（SD）表示。***BV处理组与非BV处理组，P< .01。BV，胆绿素；HPF，高倍视野；MPO，髓过氧化物酶；SD，标准偏差。
超微结构发现
在再灌注后24小时（每组n=3），对一部分移植物进行了TEM分析。非BV处理组显示出频繁的线粒体肿胀和明显的嵴结构破坏和紊乱，这与较高的心肌损伤评分一致。相比之下，BV处理组的嵴结构基本保持完整，肿胀最小（图3，D–F）。线粒体损伤的半定量分析（0–4评分）显示BV处理组为1.3 ± 0.23，非BV处理组为2.1 ± 0.64（P= .077）（图3，H）。由于超微结构评估是在一部分样本（每组n=3）中进行的，因此这些发现应被视为支持性而非决定性的。
炎症介质的表达
在再灌注后3小时（每组n=6），定量实时PCR分析显示BV处理组的炎症介质早期转录激活减弱。BV处理组的IL-6（P= .017）、iNOS（P= .030）和CCL-2（P= .022）的mRNA表达显著低于非BV处理组，而HO-1的表达在两组之间没有显著差异（P= .126）（图5）。
讨论
本研究表明，在DCD特有的温缺血条件下，通过灌注液和保存液中添加BV可以减轻缺血再灌注损伤（IRI），并促进早期移植物功能恢复。这种效应的一个合理解释是温缺血是DCD移植中移植物损伤的主要决定因素。BV处理的移植物在心肌损伤的功能、结构和分子标志物方面表现出一致性的改善，支持BV在以温缺血为主导的损伤环境中的保护作用。
BV还显著缩短了复苏时间，反映了早期再灌注期间基线电机械活动的更快恢复。这一发现具有潜在的临床相关性，因为延迟的内在节律和长时间的心室停搏与DCD移植中的早期移植物功能障碍有关。虽然复苏时间反映了电活动的恢复，但在无负荷的异位模型中，LVFS代表的是心肌壁的运动，而不是真正的泵功能。在3小时时，两组之间的LVFS没有显著差异，这可能反映了再灌注后的早期缺血性休克和高生物变异性。到24小时时，BV处理组的LVFS更高；然而，在非工作的异位模型中，LVFS反映了无负荷条件下的区域收缩功能，而不是生理前负荷和后负荷下的真实泵性能。
先前的实验研究表明，当BR或BV在确保足够心肌暴露的条件下给药时，可以实现强大的心脏保护，包括全身高胆红素血症或通过主动脉根部的直接冠状动脉灌注。这些方法一致地显示出对氧化和炎症损伤的强保护作用，特别是在以冷缺血为主的模型中。因此，通过主动脉根部直接冠状动脉给药仍然是实现均匀心肌药物暴露的最可靠策略，也是最强的实验范例。
然而，主动脉根部给药需要手术途径和专业知识，这大大限制了其在实际DCD环境中的可扩展性和常规应用。在临床实践中，侵入性冠状动脉给药通常只有在能够进行常温区域灌注或直接采集和灌注的高度专业环境中才可行，当这些先进策略可用时，它们通常优先于单独的药物治疗。这些实际限制促使本研究探索基于静脉灌注的更具有临床可行性的方法。
缺血预处理包括在缺血前、期间或之后应用短暂刺激来调节心肌对再灌注的反应。在这个框架内，预处理指的是在缺血期间进行的干预。经典预处理通常定义为远程缺血刺激，但一些报告将概念扩展到包括在缺血期间进行的药物干预，表明时间而非方式可能定义了预处理窗口。
在我们的DCD模型中，BV在等待期后立即给予，在持续的温缺血期间，在移植物采集之前。尽管这种静脉途径不能提供均匀的顺行冠状动脉灌注，但干预发生在缺血窗口内。这在概念上与预处理的一个中心原则一致：通过在缺血期间作用来改变心肌对随后再灌注的反应。先前的缺血和远程预处理研究表明，在缺血期间短暂或有限的心肌暴露可能足以触发保护性信号传导，而不需要完全或均匀的心肌给药。
在受损的顺行血流下，静脉输注可能会增加右心房和冠状静脉压力，可能允许通过冠状静脉系统实现有限的心肌暴露。这一可能性得到了描述冠状窦反流和已建立的逆行心肌通路的生理和外科文献的支持；然而，这应被视为推测性的，因为心肌中的BV分布并未直接量化。
这些发现表明心肌暴露于BV，尽管其组织分布和分子机制尚未直接评估。该干预措施可被视为一种药理性的缺血期调节策略，在概念上与预处理（perconditioning）相一致，但与传统的远端缺血预处理有所不同。从药理学角度来看，BV（一种化合物）是水溶性的，比疏水性的BR更容易处理，并通过BV-BR氧化还原循环发挥抗氧化和抗炎作用。大多数先前的研究集中在BV在冷缺血主导的移植模型中的保护作用上，而内源性BR也被证明可以减轻异位心脏移植中的缺血再灌注损伤（IRI）。本研究进一步表明，急性外源性BV也能在温缺血主导的条件下减轻心肌损伤，这种条件是心脏死亡后（DCD）移植的特征，在这种条件下，氧化应激和炎症激活比单纯冷储存时更早且更强烈。
在分子水平上，HO-1酶催化血红素转化为BV，而BV-BR氧化还原循环是一种已确立的细胞保护机制。在本研究中，各组之间的HO-1表达没有显著差异。因此，尽管这一途径在生物学上是合理的，但其对观察到的保护作用的贡献仍有待直接证明。尽管机器灌注技术提高了供体心脏的保存和代谢评估能力，但再灌注损伤仍然是一个主要限制。已经研究了几种辅助药物（包括硝酸甘油、促红细胞生成素和线粒体通透性转换孔抑制剂）来减轻IRI。虽然这些疗法针对特定的信号通路或线粒体途径，但BV主要调节氧化应激和炎症反应，表明其作用机制具有互补性。BV的简单性、低成本以及与静态和灌注保存策略的兼容性可能进一步促进其临床应用。BV值得进一步的转化研究；然而，将其纳入临床DCD方案需要在现有的监管和伦理框架内逐步验证。尽管人类数据有限，但在移植和休克模型中的实验研究表明，在生理浓度下（包括本研究中使用的10 μM浓度）BV没有毒性。将静脉给药技术转化为人类DCD方案时，需要仔细考虑强制性的“无接触”期，在此期间通常禁止对器官进行干预。从小动物模型推导出人体剂量需要药代动力学验证，并且采购前的全身暴露可能会影响非目标器官。合理的转化途径可能涉及将BV纳入常温灌注方案中，这样可以在植入前实现可控给药、清洗和代谢监测。
本研究存在一些局限性。首先，该DCD模型仅包含移植过程中的单次缺血-再灌注事件。然而，在临床环境中，IRI通常会发生两次：第一次是在供体心脏采集过程中，通过常温区域灌注或直接采集和灌注；第二次是在移植到受体体内时。尽管在小动物中重现直接采集和灌注模型在技术上具有挑战性，但未来结合小动物常温区域灌注的研究可能更好地模拟临床DCD心脏移植中的双重缺血-再灌注损伤。其次，BV激活的心肌分布和细胞内信号通路尚未直接评估。第三，仅评估了单一剂量的BV及其给药时间，而且异位非工作模型不能反映生理负荷条件或长期移植结果。需要在原位DCD模型和大动物研究中进行验证，以评估其全身安全性、功能持久性和临床转化性。
总之，在大鼠DCD心脏移植模型中，将BV添加到灌注液和冷保存液中显著减轻了温缺血再灌注损伤，并改善了早期移植物的恢复情况。鉴于其简单性、经济性和在早期功能、结构和分子层面的细胞保护作用，BV可能成为实验性DCD方案中的可行辅助手段，补充机器灌注策略并增强心肌保护效果。未来应采用原位DCD模型和大动物实验来验证其有效性，确定全身安全性，并优化临床应用的剂量策略。
**资助/支持**
本研究得到了日本学术振兴会（KAKENHI）的资助（资助编号：23K15631）。资金仅用于与研究相关的费用，包括实验室分析和实验材料，不用于支付人员工资。资助机构未参与研究的设计、实施或报告过程。
**作者贡献声明**
Kohei Tokioka：撰写——初稿、可视化、方法学、实验设计、数据分析、概念化。
Tsuyoshi Nojima：撰写——审稿与编辑、方法学、实验设计、资金获取、概念化。
Takahiro Hirayama：实验设计。
Takashi Hongo：实验设计。
Takafumi Obara：实验设计。
Kohei Ageta：实验设计。
Takuro Igawa：实验设计。
Toshiyuki Aokage：实验设计。
Kohei Tsukahara：撰写——审稿与编辑。
Tetsuya Yumoto：撰写——审稿与编辑。
Hiromichi Naito：撰写——审稿与编辑。
Atsunori Nakao：撰写——审稿与编辑、项目管理、方法学、实验设计、概念化。
