摘要
在微生物生物电化学系统中，选择氧化还原介质是一个关键的设计因素。然而，在外部添加的（外源性）和代谢合成的（内源性）介质之间进行选择仍然具有挑战性，并且缺乏直接的体内比较。在这项工作中，我们选择了铁氰化物和吩嗪-1-羧酸（PCA）作为外源性和内源性介质的代表，评估了它们在Pseudomonas putida KT2440生物电化学系统（BES）中的电化学性能和生理效应。在相似的条件下，铁氰化物实现了大约6倍的电子转移速率，而PCA则产生了较低但长期稳定的电流输出信号。PCA的生物合成对微生物细胞没有可检测到的代谢负担，并支持细胞适应缺氧生长条件。这些结果表明，对于需要更快电子转移和代谢通量的应用（如生物发酵），外源性介质具有优势；而内源性介质可能更适合调节细胞内代谢并实现稳定的电化学信号传导，例如在生物传感中。尽管介质的效果可能会随着环境条件或宿主的变化而变化，但我们的结果提供了在相似BES条件下内源性和外源性介质的首次直接比较，并建立了基于电子转移动力学、代谢耦合和操作氧化还原条件的介质选择框架。
图解摘要
进行了一项关于生物电化学系统中内源性和外源性介质的比较研究。选择了铁氰化物和吩嗪-1-羧酸作为代表性化合物，并系统地评估了它们在相似生物电化学条件下对Pseudomonas putida的影响。观察到它们之间存在不同的行为，这表明在设计用于不同应用目的（如生物合成和生物传感）的电生物技术时，介质之间存在特定的权衡。
1 引言
将电化学整合到微生物生物技术中，即微生物电化学技术（MET），是一种实现微生物与电极之间电子转移的有前景的策略[1-3]。这种方法在生物技术中提供了许多新的机会，包括能源生产[4-6]、生物修复[7, 8]、资源回收[9, 10]和电合成[11, 12]。在这样的系统中，通常需要氧化还原介质作为电子穿梭载体，以实现或增强微生物的细胞内氧化还原代谢与给定电极之间的电子转移。最佳氧化还原介质系统的选择强烈影响整体效率、选择性和经济可行性[13]。氧化还原介质可以分为两大类：由系统内的微生物合成的内源性介质和外部添加的外源性介质。常见的内源性介质包括来自Shewanella的核黄素[14]和最初来自Pseudomonas aeruginosa的吩嗪[15]，而甲苯蓝、中性红、铁氰化物和其他过渡金属复合物等化学物质在MET研究中被广泛用作外源性介质[16-19]。这两种类型的介质都被证明可以显著增加细胞外电子转移（EET）速率，并且更有趣的是，它们可以促进非产电微生物的电化学活性[20, 21]。人工介质可以在氧化还原电位、添加量和添加时间上进行调节。然而，它们的使用可能会引发关于成本、过程复杂性、毒性和与其合成相关的环境足迹的担忧[13]。相比之下，天然介质可以在现场生产，从而可能降低运营成本并消除对外部补充的需求。然而，它们的浓度和稳定性通常较低，而且生物合成可能会对细胞造成代谢负担[13]。此外，天然介质的选择是有限的。尽管这两种介质类别在中心作用上很重要，但在相同条件下直接进行体内比较仍然很少。专性需氧菌Pseudomonas putida KT2440（以下简称P. putida）已成为基于介质的BES的有希望的底盘。它具有多样的代谢能力和强大的耐受性[22]，在提供适当的电子受体时能够在缺氧甚至无氧条件下生存[23]。先前的工作已经证明，P. putida可以使用铁氰化物（E° = +436 mV，pH 7）释放电子，在厌氧条件下驱动阳极电流和部分葡萄糖氧化[24, 25]。此外，经过工程改造的P. putida菌株可以合成吩嗪-1-羧酸（PCA，E° = -240 mV，pH 7），这是一种最初由P. aeruginosa产生的天然介质[26]，并通过PCA将代谢电子释放到阳极上[20]，以在严重缺氧条件下支持代谢活动。这种双重能力提供了一个独特的平台，可以在相同的遗传背景下研究这两种类型的介质。此外，还可以通过评估相应介质的生理影响来评估P. putida的非发酵代谢是否以及在多大程度上能够实现仅由氧化还原介质驱动的厌氧代谢。从机制上讲，铁氰化物作为单电子穿梭载体，可能从周质中的细胞色素C还原酶接受电子并将其转移到阳极表面[27]。铁氰化物通过TonB依赖的运输系统进入周质[28]，并且不会进入细胞质。相比之下，PCA是一种双电子介质，通过孔蛋白被动扩散进入细胞质，并可以从周质葡萄糖脱氢酶中提取电子。此外，PCA在生产后被泵出后也可以重新进入细胞质[29]。因此，预计这两种介质将参与不同的电子转移途径，并对代谢产生不同的影响。本研究旨在阐明P. putida在相同BES条件下对人工介质和天然介质的反应。我们结合了电化学监测和代谢物分析来评估每种介质对P. putida的电化学和代谢行为的影响。这种比较提供了关于介质性质如何决定EET和细胞内代谢的见解，为阳极电发酵系统的合理设计策略提供了信息。
2 实验部分
2.1 细菌菌株和培养条件
本研究使用了两种之前构建的P. putida KT2440菌株（表1）。KT-control菌株与KT-PCA菌株的区别仅在于缺乏PCA基因，用于评估铁氰化物的性能。表1. 本研究中使用的细菌菌株。名称
基因型
描述
KT-PCA
P. putida KT2440 pBNT.14phz2
产生PCA的菌株，具有卡那霉素抗性
KT-control
P. putida KT2440 pBNT
空质粒对照，具有卡那霉素抗性
经过冷冻储存后，细胞被划线接种到LB-琼脂上，并在30°C下培养24-36小时。单个菌落用于接种含有3.6 g L^-1葡萄糖和50 µg mL^-1卡那霉素的Delft培养基预培养物。Delft培养基的配方为：K2HPO4 3.88 g L^-1，NaH2PO4 1.63 g L^-1，MgCl2·6H2O 0.1 g L^-1，(NH4)2SO4 2 g L^-1，微量元素溶液1 mL L^-1。微量元素溶液包括：EDTA 10 g L^-1，ZnSO4·7H2O 2 g L^-1，CaCl2·7H2O 1 g L^-1，Na2MoO4·2H2O 0.2 g L^-1，FeSO4·7H2O 5 g L^-1，CuSO4·5H2O 0.2 g L^-1，MnCl2·2H2O 1 g L^-1，CoCl2·6H2O 0.4 g L^-1。培养物在30°C和200 rpm下培养过夜。使用分光光度法测量600 nm处的光密度（OD600），并使用以下公式转换为细胞干重（CDW）：CDW (g L^-1) = 0.487 × OD600 [31]。
2.2 生物电化学系统（BES）设置
实验在定制的350 mL三电极BES反应器中进行；详细配置在其他地方报告[32]。简而言之，该设置包含一个用溴化鲸蜡醇预处理的碳布（25 cm^2，1071HCB，FuelCellStore，美国德克萨斯州）作为阳极，一个不锈钢网（FE621018，Advent Research Materials，英国牛津）作为阴极，以及一个Ag/AgCl/KClsat（RE-1 CP，Als，日本东京，目录号：013691）作为参比电极。工作室使用水加热循环器保持在30°C，并使用磁力搅拌器以400 rpm的速度搅拌。比较研究的实验方案包括两个阶段：
2.2.1 阶段I-有氧生长
反应器中含有300 mL Delft培养基，其中含有约16 mmol L^-1的葡萄糖和50 µg mL^-1的卡那霉素，并用压缩空气（约50 mL min^-1，相当于约0.17 vvm）进行鼓泡。接种3小时后，通过向含有KT-PCA菌株的BES反应器中添加1 mM水杨酸钠作为诱导剂来诱导PCA的产生。所有反应器的工作电极电位保持在0 V相对于Ag/AgCl/KClsat，以记录背景电流。这一阶段持续过夜，直到OD600约为1。在第一阶段结束时，使用HPLC测量PCA、剩余的葡萄糖和产生的有机酸。还使用pH计外部测量pH值。
2.2.2 阶段II-阳极电发酵
在过渡阶段，所有BES反应器中的葡萄糖浓度和pH值分别手动调整到6 mmol L^-1和7.0–7.1。用N2冲洗代替通气（20–30 mL min^-1）以实现无氧条件。对于KT-control反应器，添加铁氰化物以匹配PCA介导的反应器中测量的PCA浓度（约0.2 mmM）。然后将工作电极电位设置为+0.5 V（对于铁氰化物）或+0.2 V（对于PCA）相对于Ag/AgCl/KClsat，以确保介质的有效氧化[24, 26]。使用电位计（VMP3，Bio-Logic，法国）连续记录电流输出。
2.3 采样和分析
定期从BES反应器中收集液体样本，以测量OD600、pH值、介质浓度、葡萄糖和有机酸。除了测量生物量密度外，样本还进行离心（13,000 g，10 min，4°C），并将上清液储存在-20°C直到分析。使用Hi-Plex H柱（PL1170-6830，300 × 7.7 mm，Agilent Technologies）和UV及RI检测方法，通过HPLC定量葡萄糖和有机酸（葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、乙酸、琥珀酸、乳酸、丙酮酸、甲酸、富马酸），遵循其他地方描述的详细协议[33]。铁氰化物及其还原形式铁氰化物通过测量上清液在420 nm和320 nm处的光吸收来比色测定[21, 24]。使用Acclaim 120 C-18柱（Thermo Fisher Scientific）和UV检测在363 nm处通过HPLC定量PCA浓度[26]。简要来说，样品与纯乙腈（HPLC级）按1:1稀释。柱温设置为20°C，进样体积为10 µL。流速设置为1 mL min^-1，并使用以下流动相A（0.1% v/v三氟乙酸在MilliQ水中）和B（0.1% v/v三氟乙酸在乙腈中）的梯度进行梯度洗脱：0 min，90% A；2 min，90% A；12 min 50% A；20 min 30% A；21 min 0% A；26 min 0% A；27 min 90% A。运行时间为28 min。
3 结果和讨论
3.1 P. putida在BES反应器中的生长
在阶段I期间，P. putida在BES反应器中实现了生长（图1）。所有反应器都用来自摇瓶的液体预培养物接种，起始CDW约为0.05–0.1 g L^-1。经过约26小时的有氧生长后，细胞密度达到约0.35–0.46 g L^-1（相当于OD600为0.74–0.96），平均生长速率分别为KT-PCA的0.073 h^-1和KT-control的0.056 h^-1。这些速率远低于文献中报告的摇瓶或搅拌罐生物反应器的速率，主要是由于BES反应器中的氧气供应限制（气体流量仅为约0.17 vvm）。在有氧阶段，相应的平均葡萄糖摄取速率分别为KT-PCA的2.60 ± 0.57 mmol gCDW^-1 h^-1和KT-control的2.35 ± 0.97 mmol gCDW^-1。考虑到总体葡萄糖消耗，KT-PCA菌株的平均生物量产率为约27 mgCDW mmolglucose^-1，与KT-control菌株相似，即约22 mgCDW mmolglucose^-1。然而，需要注意的是，KT-PCA菌株将大量葡萄糖转化为2-酮葡萄糖酸（图3），如果仅基于进入细胞质的碳来计算生物量产量，KT-PCA菌株的平均生物量产量约为41 mgCDW mmolglucose^-1，几乎是KT-control菌株的两倍。所有反应器中的pH变化相当相似，从接种时的7.0降至有氧阶段结束时的约6.5。图1显示了两个阶段中BES反应器中的生物量（A）、pH（B）和葡萄糖（C）曲线。在有氧阶段，反应器用空气（约50 mL/min）通气以维持有氧条件下的生物量生长。在无氧BES阶段，反应器用氮气（20–30 mL/min）冲洗，并对工作电极施加相应的电位。KT-control反应器中添加了铁氰化物以匹配PCA介导的反应器中测量的PCA浓度（约0.2 mmM）。然后将工作电极电位设置为+0.5 V（对于铁氰化物）或+0.2 V（对于PCA）相对于Ag/AgCl/KClsat，以确保介质的有效氧化[24, 26]。使用电位计（VMP3，Bio-Logic，法国）连续记录电流输出。
3.1 P. putida在BES反应器中的生长
在阶段I期间，P. putida在BES反应器中实现了生长（图1）。所有反应器都用来自摇瓶的液体预培养物接种，起始CDW约为0.05–0.1 g L^-1。经过约26小时的有氧生长后，细胞密度达到约0.35–0.46 g L^-1（相当于OD600为0.74–0.96），平均生长速率分别为KT-PCA的0.073 h^-1和KT-control的0.056 h^-1。这些速率远低于文献中报告的摇瓶或搅拌罐生物反应器的速率，主要是由于BES反应器中的氧气供应限制（气体流量仅为约0.17 vvm）。在有氧阶段，相应的平均葡萄糖摄取速率分别为KT-PCA的2.60 ± 0.57 mmol gCDW^-1 h^-1和KT-control的2.35 ± 0.97 mmol gCDW^-1。考虑到总体葡萄糖消耗，KT-PCA菌株的平均生物量产率为约27 mgCDW mmolglucose^-1，与KT-control菌株相似，即约22 mgCDW mmolglucose^-1。然而，需要注意的是，KT-PCA菌株将大量葡萄糖转化为2-酮葡萄糖酸（图3），如果仅基于进入细胞质的碳来计算生物量产量，KT-PCA菌株的平均生物量产量约为41 mgCDW mmolglucose^-1，几乎是KT-control菌株的两倍。所有反应器中的pH变化相当相似，从接种时的7.0降至有氧阶段结束时的约6.5。图1显示了两个阶段中BES反应器中的生物量（A）、pH（B）和葡萄糖（C）曲线。在有氧阶段，反应器用空气（约50 mL/min）通气以维持有氧条件下的生物量生长。在无氧BES阶段，反应器用氮气（20–30 mL/min）冲洗，并对工作电极施加相应的电位。反应器内的细菌悬浮液起始体积为300 mL。在无氧阶段开始时，手动向含有KT-control菌株的BES反应器中添加铁氰化物，并手动将pH和葡萄糖浓度调整到相同水平。显示了KT-PCA菌株的重复实验的平均值和标准差（n = 2）或KT-control菌株的三次实验的平均值（n = 3）。CDW：细胞干重；PCA：吩嗪-1-羧酸。图2显示了BES发酵的电流输出和氧化还原介质浓度。（A）介质浓度。PCA由KT-PCA菌株在现场合成。在无氧阶段开始时，手动向含有KT-control菌株的BES反应器中添加铁氰化物。反应器内的细菌悬浮液起始体积为300 mL。（B）BES反应器的电流输出。所有反应器的工作电极电位在有氧阶段保持在0 V相对于Ag/AgCl/KClsat。在BES发酵阶段，使用KT-PCA菌株的BES反应器的工作电极电位被控制在0.2 V（相对于Ag/AgCl/KClsat），而使用KT-control菌株的BES反应器的电位被控制在0.5 V（相对于Ag/AgCl/KClsat）。两个子图中的数据均来自KT-PCA菌株的两次重复测量（n=2）和KT-control菌株的三次重复测量（n=3），标准差以误差条或阴影形式显示。PCA：吩嗪-1-羧酸。图3在图形查看器中打开。
P. putida KT-PCA和KT-control菌株在BES反应器中的葡萄糖代谢产物谱。(A) 2-酮戊二酸的谱；(B) 葡萄糖酸的谱；(C) 乙酸的谱；(D) 乳酸的谱。反应器内的细菌悬浮液起始体积为300 mL。在厌氧阶段开始时，向含有KT-control菌株的BES反应器中手动添加了铁氰化物。数据来自KT-PCA菌株的两次重复测量（n=2）和KT-control菌株的三次重复测量（n=3）。葡萄糖谱显示在图1中。PCA：吩嗪-1-羧酸。内源性介质合成的代谢负担一直被认为是社区中的一个问题。然而，与Schmitz等人[20]的先前结果一致，我们的结果证实，至少对于在氧气限制生长条件下的P. putida来说，这可能不是一个问题。如上所述，与对照组相比，PCA的生物合成并未对P. putida的生长动力学产生负面影响；相反，由于PCA的生物合成，观察到了生长速率和生物量产量的提高，这一现象之前也有报道。这可能是由于PCA的电子汇效应，当氧气不足时，PCA可以提供额外的氧化还原和能量来促进细胞生长，如图2B中PCA菌株在好氧阶段的微弱电流所示。当氧气供应被切断时，细胞生长停止。在切换到厌氧BES条件之前，pH值和葡萄糖水平被手动调整到相似的值，以确保所有BES反应器之间的条件可比。两个反应器的pH值分别调整到大约7.0–7.1，葡萄糖含量分别重新填充到1.89 ± 0.22 mmol和1.68 ± 0.19 mmol。特别是，pH值可以影响P. putida在阳极发酵过程中的厌氧存活和代谢活性（未发表的数据）。对于KT-PCA菌株，pH值从大约7.0逐渐下降到6.4，而在含有KT-control菌株的BES反应器中，pH值在同一时期从大约7.1下降到4.9。葡萄糖消耗也观察到了类似的模式。KT-PCA菌株在260小时内消耗了约0.7 mmol/L的葡萄糖，而KT-control菌株在大约137小时内消耗了约3.1 mmol/L的葡萄糖（图1）。平均葡萄糖消耗率分别为KT-PCA菌株0.017 ± 0.003 mmol gCDW−1 h−1和KT-control菌株0.089 ± 0.019 mmol gCDW−1 h−1。这些结果表明，尽管没有生长，但在厌氧BES阶段，KT-PCA和KT-control菌株在代谢上都是活跃的，其中氧化还原能力应来自阳极的平衡。
3.2 介质稳定性和电流输出
KT-PCA菌株的PCA生物合成仅发生在好氧阶段（图2A）。该菌株在第一阶段产生了约0.2 mmol/L的PCA，并伴随着好氧生物量的增长，而在切换到厌氧条件后浓度没有进一步变化。虽然氧气不是PCA生物合成的必需反应物[34]，但在厌氧阶段PCA浓度的恒定可能是由于氧化还原和能量的限制，因为P. putida细胞是专性好氧的，并且作为生物合成过程基础的呼吸ATP合成在厌氧BES反应器的能量匮乏状态下停止[21, 31]。PCA在测试条件下的化学稳定性很高。在260小时的厌氧BES培养期间，没有观察到PCA的降解，因为KT-PCA菌株不包含PCA转化的基因。向含有KT-control菌株的BES反应器中添加了铁氰化物。我们旨在提供与PCA相同的浓度，以最小化由浓度依赖的介质质量传递动力学引起的系统偏差。两种介质观察到不同的电流输出谱（图2B）。在切换到厌氧条件后，KT-PCA菌株的电流增加到约0.2 mA，并在大约100小时内保持稳定，然后缓慢下降到约0.1 mA。对于KT-control菌株，在厌氧BES发酵阶段立即添加铁氰化物时，电流达到约1 mA，并在最初的约70小时内略微下降到0.6 mA。然后它逐渐增加到约1.3 mA，然后在一天内急剧下降到基线值。值得注意的是，尽管反应器中仍有残留的葡萄糖，电流的突然下降表明底物耗尽并不是电子转移到阳极的原因。这很可能是由于介质的逐渐酸化，因为含有KT-control菌株的反应器的最终pH值达到了4.9。在我们之前使用Pseudomonas putida F1的工作中也观察到了类似的现象，其中厌氧葡萄糖消耗随着pH值的降低而显著下降，在pH值为5.1时几乎没有葡萄糖被代谢[35]。由于微生物细胞在生物电化学系统中将葡萄糖氧化为有机酸，阳极室的pH值会随时间降低。由此产生的酸化可能会抑制细胞代谢和介质的还原，当pH值低于某个阈值时，即使仍有底物存在，也会导致电流生成的迅速丧失。除了这些不同的电流谱外，含有铁氰化物的反应器在电流输出上显示出更高的变异性，包括更明显的波动和瞬态峰值（图2B）。相比之下，PCA介导的系统显示出更稳定但较低的电流输出信号。尽管生物重复次数有限（KT-PCA使用PCA时n=2，KT-control使用铁氰化物作为介质时n=3），但两个系统之间的观察到的差异在重复实验中是一致的，并且显著超过了观察到的变异性。此外，BES实验的独立重复一致地再现了电流谱、产物谱和介质性能的相同定量趋势，尽管时间和系统动态的差异阻止了将这些数据集直接合并成一个表示。铁氰化物实现的峰值电流密度是在相同浓度下PCA的6倍以上。在BES发酵过程中，阳极电位被设置为铁氰化物介导的反应器为0.5 V（相对于Ag/AgCl/KClsat），PCA介导的反应器为0.2 V（相对于Ag/AgCl/KClsat），这是根据先前的研究确定的，这些研究表明在较高的阳极电位（≥0.3 V相对于Ag/AgCl/KClsat）下，P. aeruginosa的生长减少和吩嗪产量降低[36]。然而，这并不会对铁氰化物产生有利的偏差。据报道，PCA的正式氧化还原电位约为−0.24 V相对于Ag/AgCl/KClsat[36]，而铁氰化物的电位约为0.22 V相对于Ag/AgCl/KClsat[21]。因此，在各自的施加阳极电位条件下，PCA的表观阳极过电位约为0.44 V，铁氰化物为0.28 V。尽管施加的电位较低，PCA在阳极氧化方面的热力学驱动力实际上比铁氰化物高。这表明观察到的铁氰化物的较高电流输出不能归因于较高的施加阳极电位，而是反映了整体介质性能的差异。进一步考虑反应化学计量（铁氰化物是一电子氧化还原反应，PCA是两电子氧化还原反应），铁氰化物在介导EET途径方面的电化学优势比PCA高一个数量级。这表明，当EET速率和代谢周转率至关重要时，外源性介质铁氰化物是BES的更好选择。然而，PCA另一方面可以在厌氧条件下使BES反应器的电流输出相对稳定数百小时。在好氧生长阶段合成的PCA在厌氧培养下稳定超过200小时，介质中的PCA浓度没有明显下降（图2）。PCA的长期活性和稳定性为BES应用提供了优势，这些应用更倾向于稳定的信号而不是高周转率，例如生物传感。在厌氧BES阶段，PCA介导的反应器和铁氰化物介导的反应器的总电子输出分别为1.45 ± 0.05和3.21 ± 0.25 mmol电子。考虑到在厌氧阶段两种情况下消耗了大约0.42 ± 0.10和0.76 ± 0.21 mmol的葡萄糖（图1），因此可以估计PCA介导的BES反应器的电子分配到阳极放电的比例分别为14.7% ± 2.9%和18.6% ± 5.3%。然而，应该注意的是，这个计算包括很强的系统不确定性。尽管电流测量非常准确，但由于长时间批次过程中代谢物（例如葡萄糖、有机酸）的测量可能存在误差，HPLC测量的系统误差显著增加。尽管如此，总体较高的电子输出再次表明铁氰化物可能更有利于向细胞外电子汇的电子转移，这可能与下一节将讨论的代谢产物谱有关。这两种介质的不同电化学性能的机制尚不清楚。已知这两种化学物质对P. putida细胞介导不同的EET途径，这可能（部分）解释了这一现象。铁氰化物是一种亲水性的一电子穿梭剂，先前的研究发现它与内膜结合的呼吸复合体III细胞色素c还原酶相互作用[27]，并通过TonB依赖的运输系统穿过外膜[28]。关于PCA和其他吩嗪，如PYO，研究[29]发现它们也可以在周质中相互作用，其中葡萄糖脱氢酶在EET效率中起重要作用。此外，通过细胞质中的NADH依赖酶进行电子转移也是可能的，但似乎是无方向的，具体反应尚未解决。这些差异导致铁氰化物在促进EET速率方面有两个潜在的优势：（1）它在原生电子转移网络的更下游位置提取电子；（2）它只需要穿过外膜，外膜比内膜更具渗透性，对质量传递的阻力更小。需要更多的基础研究来澄清这一机制。
3.3 葡萄糖代谢和产物谱
PCA似乎对好氧葡萄糖代谢有很强的影响，尽管它对好氧生长速率的影响不大（图3）。在好氧生长（第一阶段）期间，KT-PCA菌株分泌了超过1.7 mmol的2-酮戊二酸，而KT-control菌株分泌了约0.5 mmol。其他代谢产物（即葡萄糖酸、乙酸、乳酸）的谱在两种菌株之间相似。PCA引起的2-酮戊二酸积累的增加可能是由于PCA的电子汇效应。研究表明葡萄糖脱氢酶可以与PCA相互作用进行电子转移[29]，这种相互作用可能刺激周质中的葡萄糖氧化，从而导致2-酮戊二酸的积累增加，这与先前的报告一致[20]。在电极驱动的厌氧葡萄糖代谢中观察到了更大的差异。两种菌株在厌氧BES模式下都缓慢消耗葡萄糖（图1）。平均特定葡萄糖消耗率大致与电流密度相关，KT-control菌株消耗葡萄糖并产生电流，大约是KT-PCA菌株的5-6倍。这表明P. putida细胞的厌氧葡萄糖代谢受到电化学氧化还原能力的影响。与先前的报告类似，使用铁氰化物作为氧化还原介质的KT-control菌株主要通过膜氧化途径催化葡萄糖，2-酮戊二酸是主要产物，乙酸是次要产物（图3）。相比之下，在第一阶段观察到的KT-PCA菌株的周质葡萄糖氧化活性很高，而在完全厌氧的第二阶段，PCA似乎主要影响细胞质中的葡萄糖代谢。在这个阶段，含有KT-PCA菌株的BES反应器中没有进一步的2-酮戊二酸积累；相反，发酵液中的数量减少了，这表明在厌氧条件下它可能成为主要底物。这与之前在氧气限制条件下的培养结果形成对比，在那种情况下，据报道在基于吩嗪的电子释放过程中，细胞周质和细胞质途径同时处于活跃状态[参考文献]。在第二阶段，葡萄糖酸的浓度保持不变，这与KT对照菌株的行为相似。KT-PCA菌株的主要代谢产物是乙酸和乳酸，其中乳酸的积累量是使用铁氰化物条件下的两倍。此外，这种在厌氧条件下向乳酸转变的代谢物变化与之前在氧气限制条件下的研究结果不同，因为在之前的研究中没有观察到乳酸的产生。代谢谱的差异表明，在完全厌氧条件下，PCA似乎更倾向于影响细胞质中的糖酵解过程，而铁氰化物则与细胞周质的氧化途径相关。如上所述，铁氰化物可能在细胞周质空间中接受电子[27, 28]，而PCA也可能与细胞质中的氧化还原过程相互作用[26, 29, 34]，尽管其确切的细胞内定位和机制尚未明确。
3.4 对BES设计的启示
PCA和铁氰化物在厌氧条件下作为氧化还原介质的不同行为表明需要重新考虑它们的应用领域。铁氰化物所介导的较高电子转移速率（仍需提高至少一个数量级）以及相关的增强代谢周转率，对于需要底物到产物快速转化的BES应用（如用于生物化学生产的电发酵）是有利的。从机制角度来看，铁氰化物可以被视为一个具有有利氧化还原电位的强效细胞外电子受体，其性能与增强的细胞周质底物氧化一致，尽管这只是从系统层面观察得出的结论。要在厌氧条件下实现与PCA相当的周转率，需要显著提高介质的浓度。到目前为止，已经在微氧条件下优化了内源性PCA的产生，其浓度可提高到约0.4 mmol L^-1，在完全有氧条件下甚至可达到1.3 mmol L^-1[26]，且对细胞的代谢负担没有明显影响。另一方面，由于铁氰化物是外部添加的，其浓度可以很容易地调整，但应根据所使用的微生物种类考虑其毒性效应。虽然1 mmol L^-1的铁氰化物已经能够抑制Synechocystis sp PCC6803的光自养生长[16]，但它对P. putida的生长影响不大（高达10 mmol L^-1[21]），甚至在100 mmol L^-1的浓度下还能促进Lactococcus的厌氧生长[37]。尽管铁氰化物是一种潜在的氰化物来源，但它被广泛用作欧洲食品工业中的安全抗结剂[38]。然而，外源性介质的细胞毒性效应取决于具体的微生物种类和化学性质，而铁氰化物（以及其他外源性介质）为促进工业生物技术中的完全厌氧BES提供了一种更高效且可调的方法。铁氰化物驱动系统的核心限制在于膜电子转移与细胞质生物合成途径的耦合。如前所述，基于铁氰化物的电子转移主要发生在细胞周质中，有效地支持了与膜相关的生物转化过程，例如将葡萄糖转化为2-酮葡萄糖酸[39, 40]。然而，大多数目标生化产物是在细胞质中合成的，而细胞质中的氧化还原和能量守恒是通过NAD(P)H依赖的途径严格调控的。因此，建立并改善电子转移与特定生物合成途径之间的连接至关重要，这需要通过控制电子在细胞周质氧化和细胞质辅因子调节之间的分配来实现。例如，可以使用蛋白质开关将细胞内代谢反应与电子转移过程联系起来[41]，以及人工合成的具有高途径选择性的非典型氧化还原辅因子[42]，以便更直接地将电子导向所需的受体，从而解决铁氰化物和其他亲水性内源性介质的技术问题。原则上，疏水性内源性介质由于膜的通透性可能更容易与细胞质代谢相互作用，但它们的有效性往往受到扩散速度慢和质量传递限制的制约，这一直是BES大规模应用的长期瓶颈。这里展示的实验是在严格厌氧条件下进行的，在这种条件下，电子流几乎完全指向外部电极，使用的专性需氧生物催化剂P. putida的代谢活性受到极大抑制。然而，在微氧条件下，电子在氧气呼吸和介质还原之间的分配以及随后向电极的转移将会发生显著变化。即使在BES阶段仅有少量氧气存在，也能维持内源性吩嗪的生物合成[26]，从而增加细胞内的介质池并可能提高氧化还原穿梭能力。同时，残留的氧气可以维持有限的呼吸活性，增加质子动力生成、ATP合成和辅因子循环[43]。这可能稳定代谢活性，并在仍允许电子重新定向到阳极的同时保持较高的碳代谢通量。因此，微氧条件可能实现呼吸和电化学电子受体之间的动态平衡，从而提高整体代谢的稳健性。然而，氧气也会直接与电极竞争作为最终电子受体，可能会降低库仑效率。因此，在微氧条件下外源性和内源性氧化还原介质的相对性能将取决于介质生物合成、呼吸电子流和电极还原动力学之间的相互作用，这仍有待深入分析。尽管内源性介质（如PCA）不太可能提供与外源性介质相同的整体电子接受能力，但即使在完全厌氧条件下，它们也能对细胞内氧化还原平衡施加强烈控制。吩嗪及相关氧化还原分子可以调节NADH/NAD+比率，影响氧化还原敏感的调控网络，并将碳流导向还原型发酵产物[44, 45]。正如本研究所示，PCA的生物合成在氧气限制条件下改善了P. putida的生物量形成（图1），并在厌氧阶段增强了乳酸的产生（图3）。因此，内源性介质可以通过作为额外的电子受体来支持电生物合成。一个尚未解决的问题是将氧化还原介质选择性地与特定的生物合成途径耦合。最近，有一种新的方法通过将基因表达与来自吩嗪等介质的氧化还原信号耦合来控制基因表达[46, 47]。在这里，吩嗪的氧化形式可以选择性激活感兴趣的基因表达。通过将这种氧化还原开关机制与特定的生物合成途径耦合，可以利用内源性介质的氧化还原状态来平衡代谢途径中的通量，从而可能提高BES系统中目标产物的产量。除了生物合成之外，这种电生成开关还为生物传感提供了基础，这是内源性介质的另一个关键应用领域。PCA的长期化学和电化学稳定性（图2）支持了这一点，这是生物传感应用的关键特性。这一应用可以通过所谓的“活体电子学”[48]来示例。电生成开关建立了一种可以选择性信号转导途径，可以通过例如蛋白质开关[41, 49]与目标传感分子耦合。氧化还原介质的有效性可能还取决于宿主的生理特性。虽然P. putida需要在厌氧、阳极驱动的条件下进行代谢适应，但天然电活性和兼性或专性厌氧微生物在其代谢和电子转移之间具有内在的耦合。例如，Shewanella oneidensis和Geobacter sulfurreducens具有高度优化的天然电子转移链，将它们的细胞质代谢与细胞外电子受体连接起来。因此，内源性或疏水性介质可以更容易地整合到现有网络中。同样，像Lactococcus lactis或某些Clostridium物种这样的发酵厌氧细菌可以从额外的电子受体中受益，以在电发酵过程中维持细胞内的氧化还原平衡。在这样的宿主中，内源性介质的产生、氧化还原循环和代谢流的分配可能更容易与厌氧生理特性相协调，而无需添加高浓度的外部介质。
4 结论
选择最佳的氧化还原介质对于成功的BES应用至关重要，因为它决定了电子转移动力学、氧化还原平衡以及细胞内代谢与电子转移（EET）的耦合。在这项工作中，我们比较评估了PCA和铁氰化物作为内源性和外源性介质在严格厌氧条件下使用P. putida KT2440时的性能。铁氰化物使得电子从P. putida细胞向阳极的转移更快，并支持更高的葡萄糖周转率和产量，这与它作为主要与细胞周质氧化相互作用的强效细胞外电子受体的角色一致。相比之下，PCA提供了较低但长期稳定的电流输出。此外，铁氰化物与增强的细胞周质代谢活性相关，而PCA似乎影响细胞质代谢途径，这是基于观察到的产物分布和电子分配模式得出的。内源性介质的生物合成没有对细胞造成明显的代谢负担，反而有助于细胞在氧气限制条件下的适应，表明介质的产生可以参与细胞内的氧化还原平衡。从应用角度来看，像铁氰化物这样的人工外源性介质对于需要快速代谢周转率的电发酵过程（如生物合成）是有利的。相比之下，内源性介质可能是调节细胞内代谢、建立氧化还原响应控制回路以及实现长期稳定信号生成（用于生物传感和调控应用）的有希望的解决方案。重要的是，这些结论是基于完全厌氧操作条件得出的。在微氧条件下，氧气呼吸、介质循环和电子转移之间的电子分配可能会发生变化，从而可能改变内源性和外源性介质系统的相对性能。此外，介质的性能可能取决于宿主，因为具有天然厌氧或电活性代谢的微生物可能更有效地整合介质驱动的电子流。总的来说，这项工作为厌氧BES过程中的介质选择提供了一个比较框架，并强调了最佳介质选择取决于电子转移动力学、代谢耦合、操作氧化还原条件和宿主生理特性。
致谢
作者感谢德国萨尔兰大学系统生物技术研究所的Christoph Wittmann教授对这项项目的建设性讨论。这项工作主要得到了德国研究基金会（SPP2240，授权号445908911）的支持。B. L. 感谢德国联邦研究、技术和空间部（授权号031B1273）的财政支持。M. A. R和A. F得到了欧盟Horizon 2020研究和创新计划下的欧洲研究委员会的支持（授权协议号864669）。
这项工作得到了德国研究基金会（445908911）和德国联邦教育和研究部（031B1273）的资助。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究发现的数据可以在合理请求下从相应作者处获得。
打赏
