Swapnil Mundhe | Saborni Maiti | Aritri Sanyal | Anirban Majumder | Narendra Y. Kadoo | Dhiraj Dhotre | Vitthal T. Barvkar | Shamim A. Shaikh | Runa Antony | Dhiraj Paul
国家细胞科学中心，浦那 411008，印度
**摘要**
南极洲及其他冰川中的冰穴（Cryoconite holes）是动态的生物栖息地，具有较高的生物地球化学周转率，对气候敏感的冰川生态系统中的碳和氮循环有显著影响。这些冰穴在全球范围内普遍存在，凸显了其全球重要性，并且随着冰川持续退缩，它们的分布可能会更加广泛。尽管它们在全球范围内存在且对气候变暖敏感，但由于生物量极低、样品基质恶劣以及缺乏优化的提取方法，针对其溶解有机物（DOM）的代谢组学研究仍然很少。
**背景**
冰穴是南极洲及其他冰川中的生物热点区域，具有较高的生物地球化学周转率，对气候敏感的冰川生态系统中的碳和氮循环有重要影响。它们在全球各地的冰川上都有发现，这表明了它们的全球重要性。随着冰川的持续退缩，这些冰穴可能会变得更加普遍。尽管如此，由于生物量低、样品基质复杂以及缺乏优化的提取方法，对其溶解有机物的代谢组学研究仍然十分有限。
**方法**
我们评估了水、甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）的不同组合，以优化从冰穴中提取化学多样性强的极性和非极性代谢物的过程。单独使用富含有机物的甲醇：水（70:30 v/v）进行提取，以及同时使用甲醇：水（70:30 v/v）和乙腈：甲醇：水（40:40:20 v/v）进行双溶剂提取，能够获得最多的代谢物种类和多样性。将反相色谱（RP）与高效液相色谱-离子迁移谱（HILIC）结合使用，可以检测到最多的独特代谢物。与单独使用反相色谱相比，这种双色谱和离子极性组合分别使代谢特征的检测数量增加了46.9%和25.5%。
**意义**
本研究首次为冰穴这种极端环境专门优化了一套全面的非靶向代谢组学工作流程。通过捕获适应寒冷环境的微生物群落中的细胞外DOM和细胞内代谢物，该方法揭示了这些寒冷生态系统中复杂的代谢景观。通过对这些代谢特征的表征，为未来研究极地及冰川环境中的代谢相互作用奠定了基础。
**引言**
微生物是陆地生物圈的关键组成部分，通过合成和分解微生物代谢产物来驱动溶解有机物（DOM）的循环[1]。低分子量（LMW，50-1500 Da）分子，如小肽、碳水化合物、核酸、有机酸、脂质和其他代谢物，在DOM组分中容易被微生物利用[2]。因此，对这些LMW分子进行鉴定可以提供微生物消耗或产生的具体有机分子的详细信息。这对于因气候变化而快速变化的南极生态系统尤为重要。除了气候变化外，最近的研究还指出，来自长距离大气传输（LRAT）和当地来源的污染物（如微粒和纳米颗粒）沉积在南极冰川表面[3]，最终影响这些极端生态系统中的微生物过程。然而，这些污染物的异质性加上浓度始终较低，给在南极及其他类似极端生态系统中检测和量化这些分子带来了重大挑战。
**冰穴**
冰穴是自封闭的、充满水的圆柱形凹陷，底部沉积着深色沉积物（冰穴物质），形成于冰盖和冰川上[4][5]，覆盖了全球1-20%的冰面[6]。这些特征在全球各地的冰川上都有发现，表明了它们的全球重要性。它们影响冰川冰的消融过程，并为冰川微生物提供栖息地[7][8]。当有机或无机颗粒沉积在冰川表面时，就会形成冰穴。由于冰穴物质颜色较深，它们比周围冰吸收更多的太阳能量，导致融化并形成充满水的圆柱形凹陷[9][10]。由于底部覆盖着冰融水的深色矿物、无机物和有机物（冰穴物质），冰穴的生物地球化学周转率远高于其他冰川表面区域[7][8][11][12]。尽管单个冰穴的体积很小，但它们中的微生物介导的生物地球化学过程可以显著促进冰川的营养循环和净通量[13][14]。冰穴中丰富的有机物为复杂的微生物群落提供了营养丰富的栖息地，使它们能够在极端环境中繁衍生息[15][16]。虽然已有许多研究报道了冰穴生态系统中的微生物多样性和组成，但只有少数研究应用代谢组学方法揭示了格陵兰冰盖和北极冰盖上本地微生物群落的代谢潜力[17][18][19]。尽管微生物代谢物在营养循环和生态系统动态中起着重要作用，但针对冰穴系统的优化非靶向代谢组学工作流程仍然很少。
**非靶向代谢组学**
非靶向代谢组学是一种强大且快速发展的方法，可用于分析复杂的提取物，提供全面的、数据驱动的代谢分析[20][21][22]。多项研究利用非靶向代谢组学方法揭示了陆地和海洋生态系统中的多种化合物，提高了我们对DOM在微生物种群结构及其在全球气候变化中作用的理解。这类研究引起了广泛关注，并催生了一个新兴的研究领域[2][23][24][25][26][27]。像冰穴这样的冰川生态系统可以通过生化过程产生大量DOM，从而影响附近的水生环境[28][29]。尽管已知冰穴中含有高浓度的DOM和其他营养物质，但其中各种有机底物与微生物之间的相互作用仍不甚清楚[30][31]。虽然一些研究在各种陆地生态系统中探索了DOM的化合物水平特征[23][32][33][34][35][36][37][38]，但此类研究的数量仍然有限。这些研究使用了核磁共振（NMR）光谱、傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）、紫外-可见光或激发-发射矩阵荧光光谱以及气相色谱-质谱（GC-MS）等方法来应用非靶向代谢组学方法。尽管分析平台的选择因研究而异，但这些方法存在固有的局限性。例如，FTICR-MS可以提供最高的分辨率和质量精度，但由于数据采集速率较低，运行时间较长，因此不太适合高通量数据采集[39]。同样，紫外-可见光或激发矩阵光谱仪需要每个分析物都含有可检测的色素，而高度复杂的混合物（如代谢提取物）可能缺乏色素[40]。此外，NMR的灵敏度较低，检测到的代谢物数量较少。相比之下，基于GC-MS的实验需要挥发性分析物或预先的样品衍生化[2][41]。因此，近年来LC-ESI-MS已成为分析小分子混合物的强大工具。其广泛的检测范围、高通量能力和灵敏度使其成为传统DOM表征方法的理想替代方案[42][43][44]。虽然正离子模式的反相液相色谱（RP-LC）更受欢迎，但使用单一色谱相或极性模式的缺点也被报道过[45]。亲水相互作用液相色谱（HILIC）比RP-LC更适合保留和分离高极性分子，后者能有效保留和分离中极性和非极性分子[46][47]。因此，将RP-LC与HILIC-MS结合使用是一种有吸引力的互补方法，可用于识别广泛的代谢物[48]。这种非靶向的全球代谢物分析方法将填补我们对微生物群落中DOM组成和代谢途径理解的空白[2][23][24][25]。尽管已经广泛研究了不同基质中的代谢组学提取方法[2][23][41][49][50][51][52]，但这种优化方法尚未应用于南极冰穴。尽管越来越多的人认识到冰穴是冰川表面的生物地球化学热点，但由于生物量低和化学基质复杂，对其溶解有机物的非靶向代谢组学研究仍然很少。通过系统评估不同溶剂系统（水、甲醇、乙腈）的提取效率，本研究为极地冰川环境中的代谢组学研究建立了方法框架，为未来旨在解码这些极端生态系统中复杂微生物代谢网络的研究奠定了基础。
**结论**
本研究评估了多种单溶剂、双溶剂和三溶剂组合在基于RPLC-MS/MS的非靶向代谢组学中的应用。我们使用了正离子和负离子模式ESI，比较了这些组合，以优化从南极拉塞曼山（Larsemann Hills）收集的冰穴样本中提取和检测细胞内和细胞外代谢物的过程。为了最大化代谢物的覆盖范围，我们将HILIC-MS/MS的结果整合到了正离子和负离子模式ESI中。据我们所知，这是首次系统优化基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学工作流程，用于表征冰穴中的DOM组成。本研究为未来对这些生态系统的全球代谢组学评估建立了技术框架，使LMW DOM数据能够整合到基于过程的生态模型中。
**作者贡献声明**
Shamim A. Shaikh：撰写、审稿与编辑、监督、资源管理。
Runa Antony：撰写、审稿与编辑、验证、项目管理、数据管理。
Dhiraj Paul：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、软件开发、项目管理、方法学研究、资金获取、数据分析、数据管理、概念化。
Saborni Maiti：撰写、审稿与编辑、软件开发、数据分析。
**未引用的参考文献**
[61]; [62]; [85]; [86]; [87]; [88]; [89]; [90]; [91]
**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
**数据可用性**
研究链接：NCCS_DOM_LCMS_Cryoconite holes_2021（原始数据）（GNPS-MassIVE）
**资助**
本研究得到了印度地球科学部（MoES）的支持，属于中央部门计划“极地科学与冰冻圈研究（PACER）”（批准号：NCPOR/2019/PACER-POP/BS-01）的资助。
**致谢**
我们衷心感谢印度果阿的国家极地与海洋研究中心（NCPOR）主任对这项研究的支持，以及Dr. B Santhakumari提供浦那CSIR-国家化学实验室的质谱设施。
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