摘要
背景
诸如裂谷（RV）这样的地貌特征可能会限制疟疾病媒的基因流动，并影响抗性模式。在此，我们评估了肯尼亚疟疾流行区域中由裂谷分隔的Anopheles funestus s.s.种群中的疟原虫感染率、抗性等位基因及其分布情况。
方法
使用聚合酶链反应（PCR）对西肯尼亚、沿海地区以及位于裂谷内的Kerio Valley（KV）中的Anopheles funestus s.s.种群进行了关键抗性标记的基因分型。TaqMan检测结合嵌套PCR用于筛查疟原虫孢子虫感染，并通过与抗性等位基因的关联以及Fisher精确检验或Pearson卡方检验来评估基因型频率。根据世界卫生组织（WHO）的指南，还使用F1后代进行了表型抗性检测，包括诊断性检测、强度检测和吡酮醇-butoxide（PBO）协同作用检测。
结果
4.3kb-SV（n = 336）和G454A-Cyp9k1（n = 445）等位基因在西肯尼亚几乎固定不变，但向裂谷和沿海地区逐渐减少；而L119F-GSTe2（n = 392）在从西肯尼亚到沿海的梯度上增加，其新单倍型与在沿海地区检测到的已知非洲变异体不同。携带L119F-GSTe2-RR基因型的蚊子感染疟原虫的概率低于RS基因型（OR 0.2，P = 0.046）。同样，携带4.3 kb标记R等位基因的蚊子比携带S等位基因的蚊子具有更高的疟原虫感染率（OR 5.7，P = 0.049）。An. funestus种群表现出高度的拟除虫菊酯抗性，在KV地区的抗性强度高于传统的疟疾高发区西肯尼亚。预先暴露于PBO会提高对II型（德尔塔马拉硫磷、阿尔法-氰氯氰菊酯）拟除虫菊酯的死亡率，但在KV地区的死亡率仍然较低，这表明抗性不是由P450酶介导的。来自沿海地区的An. funestus蚊子对氯氟氰菊酯表现出极强的抗性（在10×剂量下死亡率<10%）。对二氯二苯三氯乙烷的抗性普遍存在，而所有种群对苯迪卡巴、吡虫啉-甲基、噻虫啉和氯氟氰菊酯均完全敏感。
结论
地区特定的选择可能驱动裂谷分隔的肯尼亚疟疾流行区域中An. funestus种群的抗性谱型差异，这对疟疾传播和杀虫剂抗性管理具有重要意义。
背景
诸如裂谷（RV）这样的地貌特征可能会限制疟疾病媒的基因流动，并影响抗性模式。在此，我们评估了肯尼亚疟疾流行区域中由裂谷分隔的Anopheles funestus s.s.种群中的疟原虫感染率、抗性等位基因及其分布情况。
方法
使用聚合酶链反应（PCR）对西肯尼亚、沿海地区以及位于裂谷内的Kerio Valley（KV）中的Anopheles funestus s.s.种群进行了关键抗性标记的基因分型。TaqMan检测结合嵌套PCR用于筛查疟原虫孢子虫感染，并通过与抗性等位基因的关联以及Fisher精确检验或Pearson卡方检验来评估基因型频率。根据世界卫生组织（WHO）的指南，还使用F1后代进行了表型抗性检测，包括诊断性检测、强度检测和吡酮醇-butoxide（PBO）协同作用检测。
结果
4.3kb-SV（n = 336）和G454A-Cyp9k1（n = 445）等位基因在西肯尼亚几乎固定不变，但向裂谷和沿海地区逐渐减少；而L119F-GSTe2（n = 392）在从西肯尼亚到沿海的梯度上增加，其新单倍型与在沿海地区检测到的已知非洲变异体不同。携带L119F-GSTe2-RR基因型的蚊子感染疟原虫的概率低于RS基因型（OR 0.2，P = 0.046）。同样，携带4.3 kb标记R等位基因的蚊子比携带S等位基因的蚊子具有更高的疟原虫感染率（OR 5.7，P = 0.049）。An. funestus种群表现出高度的拟除虫菊酯抗性，在KV地区的抗性强度高于传统的疟疾高发区西肯尼亚。预先暴露于PBO会提高对II型（德尔塔马拉硫磷、阿尔法-氰氯氰菊酯）拟除虫菊酯的死亡率，但在KV地区的死亡率仍然较低，这表明抗性不是由P450酶介导的。来自沿海地区的An. funestus蚊子对氯氟氰菊酯表现出极强的抗性（在10×剂量下死亡率<10%）。对二氯二苯三氯乙烷的抗性普遍存在，而所有种群对苯迪卡巴、吡虫啉-甲基、噻虫啉和氯氟氰菊酯均完全敏感。
结论
地区特定的选择可能驱动裂谷分隔的肯尼亚疟疾流行区域中An. funestus种群的抗性谱型差异，这对疟疾传播和杀虫剂抗性管理具有重要意义。
背景
疟疾仍然是撒哈拉以南非洲（SSA）大部分地区的重要媒介传播疾病，具有重大的医学和公共卫生意义。2024年，该地区报告了2.82亿例疟疾病例中的88%[1]。尽管广泛实施了综合控制措施，包括使用杀虫剂处理过的蚊帐（ITNs）和适当的诊断与治疗（如基于青蒿素的联合疗法[2]），但大多数非洲国家的疟疾发病率仍然很高[1]。仅在肯尼亚，2024年就报告了超过400万例病例，比2023年的329万例增加了27%[1]。这种持续的高负担突显了人们对疟疾持续传播驱动因素理解的不足。媒介行为的变化和生态异质性可能是导致持续传播动态的因素，并削弱了当前控制措施的有效性。
人类通过被感染了疟原虫的雌性按蚊叮咬而感染疟疾。在这些按蚊中，Anopheles funestus s.s.的媒介能力各不相同——它们传播病原体的潜力不同。在SSA的主要疟疾病媒中，Anopheles funestus s.s.的特点是对疟原虫高度易感、强烈的人嗜性（偏好叮咬人类）以及成年期寿命较长[3, 4]。由于ITNs的大规模使用，An. gambiae种群数量下降，An. funestus已成为东非大部分地区的主导疟疾病媒，包括肯尼亚的几个地区[3,4,5]。此外，An. funestus具有行为改变的倾向，适应性极强——全年都能繁殖，并能迅速对杀虫剂产生抗性[6,7,8]。
杀虫剂抗性对当前媒介控制和疟疾控制策略的长期有效性构成了重大挑战[9]。在非洲大部分地区，An. funestus种群已对拟除虫菊酯产生抗性，而拟除虫菊酯是公共卫生中使用的主要杀虫剂类别[10,11,12]。此外，越来越多的证据表明抗性已扩展到世界卫生组织（WHO）推荐的其他杀虫剂类别[13]。杀虫剂抗性的恶化情况进一步加剧，表现为蚊子种群能够存活于非常高剂量的杀虫剂中，从而降低了控制措施的效果[10,11,12]。在An. funestus中，抗性主要由关键代谢基因的过表达介导，特别是编码细胞色素P450酶（CYPs）的基因，包括CYP6P9a/b、CYP6P4a/b和CYP9K1，以及谷胱甘肽转移酶epsilon 2（GSTe2）[14,15,16]。此外，关键代谢基因内的遗传变异体（SVs）如6.5kb-SV和4.3kb-SV也与抗性有关[17, 18]。最近的研究还发现了赋予局部击倒抗性（kdr）的靶点突变[19]和非编码RNA[20]在抗性机制中的作用。
在肯尼亚，疟疾流行地区（如沿海和西部地区）已记录到An. funestus对拟除虫菊酯的敏感性降低[5, 21, 22]。然而，其背后的分子机制仍不甚明了，这凸显了对在不同生态环境中An. funestus种群杀虫剂抗性进化与传播进行全面研究的必要性。
在非洲，Anopheles funestus种群分布广泛，表现出显著的局部遗传变异性，这可能是其高度适应性的原因[23]。气候和人为因素（包括杀虫剂的广泛使用）可能是这种适应性的促成因素[24]。此外，地理和生态因素（如物理屏障和空间距离）可能限制蚊子的扩散，导致不同的种群结构，从而影响对媒介控制干预的反应。
先前的研究表明，东非裂谷可能作为地理屏障，影响疟疾病媒（如An. gambiae和An. funestus）的基因流动和遗传分化[25, 26, 27]。这种地貌特征可能同样影响抗性等位基因的空间动态，从而限制其在各个地区的传播[28]。因此，这些屏障可能影响基于杀虫剂的干预措施的效果、局部疟疾传播模式和整体控制结果。本研究调查了裂谷作为已知的地理屏障是否影响肯尼亚An. funestus种群的基因流动以及抗性基因型和表型的变化。具体而言，我们描述了裂谷主要疟疾流行区域内An. funestus种群中与已知代谢抗性基因相关的生物特性和遗传变异。
方法
研究地点
在裂谷（RV）内的选定地点收集了成年按蚊：Kerio Valley（KV），包括Baringo县的Kapluk和Kapnarok；裂谷西侧的Ahero（Kisumu县）、Busia（Busia县）、Bungoma（Bungoma县）；以及裂谷东侧的沿海地区Taveta、Marigiza（Kwale县）和Sihu/Jaribuni（Kilifi县）。这些地点涵盖了肯尼亚的主要疟疾风险区（图1）。西肯尼亚的湖泊疟疾流行区的疟疾患病率最高，其次是沿海疟疾流行区[2]。例如，Busia、Bungoma和Kisumu是疟疾负担最重的县（患病率10-30%），而Kwale县的患病率较低（<5%）。西肯尼亚和沿海地区全年都存在疟疾传播，高峰出现在短雨季（10月至12月）和长雨季（3月至5月）。相比之下，被归类为季节性疟疾流行区的Baringo县通常风险较低，但在雨季传播 intensidad 较高[29]。该县部分地区报告的疟疾患病率高达16%，主要是由于恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）引起的[30]。
图1
肯尼亚地图显示了沿裂谷分界线的研究地点。地图由Juliet Onditi@icipe, Nairobi设计。
肯尼亚的主要疟疾病媒包括Anopheles gambiae s.l.和An. funestus物种复合体，尽管这些物种在疟疾传播中的相对重要性因流行病学风险区、地点和季节而异[31]。在包括肯尼亚主要疟疾风险区的研究地点中，An. funestus是主要的疟疾病媒[3, 29]。
蚊子采集
在每个地点，使用CDC光陷阱（Model 512，John W. Hock Co，美国佛罗里达州盖恩斯维尔）同时监测夜间活动的成虫按蚊在随机同意的家庭内外。考虑的重要家庭特征包括房屋设计、屋顶类型（茅草屋顶或波纹铁皮屋顶）以及是否有屋檐。2021年2月至2022年9月期间，在每个家庭内放置了一个陷阱，在户外放置了另一个陷阱，并额外添加了干冰作为诱饵。每天18:00至6:00在每个地点设置十个光陷阱，连续35个夜晚，针对不同的家庭。每个家庭内的陷阱放置在床边。收集到的蚊子用液态氮气运输到内罗毕icipe Duduville校区的实验室，并随后保存在-80°C的冷冻库中直至处理。
随后，在具有代表性的生态区域的房屋墙壁和屋顶上使用电池驱动的prokopack吸虫器收集静息的、吸血后的雌性An. funestus：西肯尼亚（Busia）、沿海地区（Kilifi和Kwale）和KV（Kapnarok/Kapluk）。收集工作在得到地区负责人和家庭主人的口头同意后，于2024年6月至10月期间进行，每天3:00至6:00进行。收集到的蚊子被放在笼子中，然后根据[32]的鉴定键进行形态学鉴定，并区分An. funestus s.l.与其他按蚊或库蠓，提供10%的蔗糖溶液，保存3-5天直至怀孕。
蚊子饲养
使用强制产卵方法获得的卵（即单独放置在1.5 ml Microcentrifuge管中，Biologix，中国山东）被汇集到饲养托盘中（每个地点）。孵化出的幼虫可以自由摄取Tetramin（Tetramin1，德国Melle），并在内罗毕icipe Duduville校区饲养至F1成虫世代，用于杀虫剂暴露实验。所有蚊子在标准昆虫饲养条件下饲养，温度为26±2°C，相对湿度为65-85%，光照周期为12:12的自然光。幼虫用水（Mount Kenya Ltd生产）每三天更换一次，直到化蛹。羽化的成虫被保存在Bugdorm笼子（MegaView Science Co., Ltd，中国台湾台中）中，在生物测定前给予10%的糖溶液。
杀虫剂敏感性测试
为了全面了解An. funestus种群的抗性，使用2-5日龄未吸血的An. funestus s.s. F1成虫（WHO管或瓶子测定方案[32]）进行了一系列杀虫剂敏感性测试（附件1：表S1）。这包括I型（氯菊酯）和II型拟除虫菊酯（德尔塔马拉硫磷和阿尔法-氰氯氰菊酯）、氨基甲酸酯类杀虫剂苯迪卡巴、有机氯类杀虫剂二氯二苯三氯乙烷（DDT）、有机磷类杀虫剂fenitrothion和吡虫啉-甲基，以及新批准的WHO新烟碱类杀虫剂噻虫啉和氯氟氰菊酯。本文不仅考察了杀虫剂对标准诊断浓度的抗性，还专门针对拟除虫菊酯类杀虫剂进行了抗性强度测试。每个试管中大约有15-25只蚊子，重复2-5次实验，这些蚊子被暴露在浸有杀虫剂的滤纸上1小时，随后转移到含有10%糖分的清洁容器中。暴露后24小时测定死亡率。此外，通过使用PBO（哌扑宁）（P450酶的抑制剂）来评估参与代谢抗性的细胞色素P450基因。未暴露于杀虫剂滤纸的蚊子被用作对照组。这些生物测定实验在26±2°C和70±10%的相对湿度条件下进行。
**蚊子鉴定**：
从野外捕获的蚊子中筛选出宿主寻找型蚊子，并使用鉴定钥匙[33]进行形态学鉴定，确定它们属于Anopheles funestus s.l.。使用Livak协议[34]分别从每只处理过的An. funestus s.l.蚊子的头部/胸部和腹部提取基因组DNA（gDNA）。从腹部提取的gDNA用于通过物种特异性聚合酶链反应（PCR）[35]鉴定An. funestus群体的姐妹物种。同样地，从静止采集的An. funestus s.l.雌蚊中也进行了鉴定。
**疟原虫感染检测**：
仅从头部/胸部提取的gDNA（F0 An. funestus）通过实时TaqMan PCR检测方法[36]来检测疟原虫感染的存在，然后使用Snounou等人[37]描述的嵌套PCR方法以及Fonkou等人[38]的协议进一步确认阳性样本。阳性蚊子被认为是含有疟原虫孢子体的。
**An. funestus s.s.的抗性标记基因分型和GSTe2基因测序**：
从陷阱收集的第一代（F0）An. funestus s.s.样本（n=139-445）中，对四个选定的验证标记进行了基因分型：细胞色素P450 CYP6P9a基因（Cyp6P9a）、谷胱甘肽S转移酶epsilon 2（GSTe2）基因中的L119F突变（L119F-GSTe2）、含有4.3kb转座子的结构变异（4.3kb-SV）以及细胞色素P450 CYP9K1基因中的G454A突变（G454A-Cyp9K1）。这是通过等位基因特异性PCR（AS-PCR）方法和/或限制性片段长度多态性[14, 16, 18, 35]实现的。仅L119F-GSTe2的PCR产物根据不同的基因型进行纯化，使用ExoSAP-IT（Thermo Fisher Scientific Inc，美国卡尔斯巴德）处理，并使用正向引物进行Sanger测序。获得的序列（GSTe-2）使用MEGA v7 [39]进行清洗和对齐。这些序列与GenBank中存储的参考GSTe2序列[14]进行比较。使用最佳拟合模型推断最大似然树，并通过1000次自助法复制评估不同分组的节点支持度。
**肯尼亚An. funestus中GSTe2基因的多态性分析**：
我们将肯尼亚获得的GSTe2等位基因与其他非洲地区的GSTe2基因进行了比较，纳入了GenBank中的已发布GSTe2基因序列[14]（登录号KC800340–KC800421）。这些序列包含在附加文件2：表S2中。这些序列被用于全非洲范围的比较遗传分析。使用BioEdit版本7.2.3.0 [40]手动检查GSTe2编码序列，确定遗传多态性，并使用BioEdit软件中的ClustalW序列分析器在默认参数下进行多序列比对。使用MEGA v7 [39]构建系统发育最大似然树。基于贝叶斯信息准则测试了最佳拟合替换模型，该模型最佳描述了序列数据集。然后使用1000次自助法复制生成最大似然树，并使用Templeton Crandall Singleton（TCS）和TCS beautifier绘制单倍型网络以美化生成的单倍型网络[41]。
**数据分析**：
数据被输入Excel表格以绘制计数、比例和频率。通过确定等位基因和基因型频率来评估每个标记的突变分布。使用Fisher’s Exact Test/Pearson’s Chi-square测试比较每种标记的基因型/等位基因间的疟原虫感染率。数据分析使用GraphPad Prism（版本10.6.1；GraphPad Inc.，美国拉霍亚）和/或R v 4.5.1软件（The R Foundation for Statistical Computing），置信限为95%。
**物种分布**：
共有1967只An. funestus s.l.样本通过PCR处理，其中An. funestus是主要的姐妹物种，占总数的66.6%（1310/1967）。相比之下，An. rivulorum、An. leesoni、An. parensis和An. longipalpis C的捕获数量较少。值得注意的是，An. longipalpis C仅在Kapluk地区被检测到。在Taveta（沿海地区）捕获的蚊子中有相当大比例（23.7%）在分子分析中未能扩增。有趣的是，An. funestus是西部地区（Ahero、Busia和Bungoma）以及Kerio Valley地区（Kapluk和Kapnarok）室内捕获的主要物种（图2）。在Kwale、Kilifi和Taveta（沿海地区），该物种在室外占主导地位（图2）。
**疟原虫寄生虫感染率和关键抗性标记的关联**：
分析了一部分An. funestus（n=463）是否感染疟原虫孢子体，并对其代谢抗性基因标记L119F-GSTe2和G454A-Cyp9K1以及结构变异4.3kb-SV进行了基因分型。其中，8.2%（范围3.3–44.4%）的样本检测出疟原虫孢子体感染（95%为P. falciparum；5%为P. ovale），不同地点之间存在差异（表1）。西部地区的累计疟原虫感染率最高（12.7%；21/165；范围5.7–44.4%），其次是KV地区（7.1%；7/99；范围5.5–9.1），然后是沿海地区（5.1%；10/196；范围3.3–9.5%）。
**三大关键代谢抗性标记的基因型频率**：
在西部、裂谷和沿海地区的An. funestus种群中评估了三个关键代谢抗性标记L119F-GSTe2、G454A-Cyp9K1和4.3kb-SV转座子的基因型频率（图3），结果显示出显著的地区差异。L119F-GSTe2在392个样本中成功检测到，其总等位基因频率为0.33（范围0.16–0.74）。在沿海地区，抗性119F-GSTe2等位基因的频率最高（55/138；39.9%），在KV地区频率较低（7/95；7.4%），而在肯尼亚西部频率最低（7/159；4.4%）（图3）。对于G454A-Cyp9K1（n=445）和4.3kb-SV（n=336），RR基因型的频率显著更高，接近固定值，在肯尼亚西部约为98.8%，其次是裂谷地区（约91%），然后是Kwale和Kilifi沿海地区（约82%）（图3）。对于CYP6P9a标记（n=139），SS基因型在KV地区（24/139）、西部地区（85/129）和沿海地区（30/139）中以不同比例检测到。
**抗性基因型在肯尼亚不同地区之间的分布**：
接下来，我们比较了感染疟原虫的样本和未感染样本在不同抗性标记之间的基因型分布。对于G454A-Cyp9K1和4.3kb-SV，携带RR基因型的个体中感染频率更高（图4A；附加文件3：图S1）。按标记划分的详细情况如下：G454A-Cyp9K1（RR=26/355；RS=4/58；SS=1/32）和4.3kb-SV（RR=26/301；RS=1/9；SS=0/26）。关联测试显示4.3kb-SV（χ2=2.53，df=2，P=0.28）和G454A-Cyp9K1（χ2=0.80，df=2，P=0.67）的基因型间感染率没有显著差异（图4B）。进一步在等位基因水平上的分析显示，通过结合来自不同地区的所有样本从而增加样本量，仅携带4.3kb-SV的R个体的感染率显著高于S个体（OR 5.7，P=0.049）（附加文件4：图S2，附加文件5：图S3）。然而，对于L119F-GSTe2标记，观察到相反的趋势，携带SS（21/221）或RS（12/102）基因型的个体感染率高于RR（2/69）基因型（图4A）。尽管不具有统计显著性（P=0.18），但观察到的趋势表明抗性119F-GSte2等位基因可能与寄生虫感染存在潜在的负相关。
**抗性标记与疟原虫孢子体感染的关联**：
A显示了每个标记的基因型中疟原虫孢子体阴性及阳性结果的分布；RR表示纯合抗性；RS表示杂合抗性；SS表示纯合易感性。B显示了2×2列联表，用以评估抗性等位基因R（抗性）和S（易感性）与计数得到的疟原虫孢子体阳性样本之间的关联，并显示出每个标记的抗性等位基因与疟原虫感染之间的关联p值，然后跨所有样本进行合并。
**GSTe2基因的序列分析**：
对选定的肯尼亚基因型进行了GSTe2基因（666 bp）的测序，以推断其与非洲其他地区参考序列的进化关系。分析显示肯尼亚沿海群体与其他非洲地区之间存在明显的遗传分化（图5）。分析确定了两个主要分支，一个主要分支包括来自多个非洲国家的序列，包括贝宁、乌干达、马拉维、莫桑比克、加纳和肯尼亚裂谷地区的序列（图5A）。第二个分支仅包含来自肯尼亚沿海地区的序列。此外，通过单倍型网络分析进一步证明了遗传分化，该分析揭示了两个不同的网络，其中一个网络包含两个主要单倍型（H1和H2），这些单倍型来自非洲的不同地理区域，包括西非（加纳和贝宁）、南部非洲（马拉维和莫桑比克）和中部非洲（喀麦隆）以及东部非洲（乌干达和肯尼亚裂谷地区）（图5B）。相反，第二个单倍型网络仅包含来自肯尼亚沿海地区的序列，包含两个特定于该地区的单倍型（H3和H4）。总体而言，分析显示肯尼亚沿海地区的An. funestus种群与肯尼亚其他地区的GSTe2序列存在高度遗传差异。
**全非洲范围内的glutathione S转移酶epsilon 2（GSTe2）基因编码区的遗传分析**：
A显示了最大似然系统发育树。B显示了单倍型网络。本研究生成的肯尼亚单倍型已存储在NCBI GenBank中（登录号：PX686378-PX686415）。
**肯尼亚An. funestus中GSTe2基因的核苷酸多态性分析**：
进行了核苷酸多态性分析，以研究非洲各地GSTe2基因不同单倍型所包含的核苷酸变化。分析显示，所有非洲样本共有的主要优势单倍型（H1）在GSTe2开放阅读框（ORF）中没有单个核苷酸多态性（SNP）（图6A，B）。在98个序列中，有23个序列携带此单倍型。次要优势单倍型（H2）在贝宁（15个序列）中频率较高，在喀麦隆（4个序列）和加纳（5个序列）中频率中等，其特征是在第355位有一处核苷酸变化：胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），导致第119位的氨基酸从亮氨酸（L）变为苯丙氨酸（F）。第三和第四单倍型（H3和H4）仅出现在肯尼亚沿海地区，具有多个SNP，产生独特的蛋白质序列。这种蛋白质序列在多个位置有10个氨基酸变化：第33位的天冬酰胺（N）突变为胸腺嘧啶（T），第80位的甘氨酸（G）突变为丙氨酸（A），第146位的赖氨酸（K）突变为缬氨酸（V），第147位的天冬氨酸（D）突变为天冬酰胺（N），第153位的丝氨酸（S）突变为丙氨酸（A），第176位的谷氨酸（E）突变为天冬氨酸（D），第180位的组氨酸（H）突变为酪氨酸（Y），第182位的精氨酸（R）突变为谷氨酰胺（Q），第185位的谷氨酸（E）突变为甘氨酸（G），第188位的天冬氨酸（D）突变为天冬酰胺（N）（T33 A80 V146 N147 A153 D176 Y180 Q182 G185 N188）。这个肯尼亚沿海单倍型在30个序列中有10个序列携带。
**全非洲范围内的GSTe2编码序列的核苷酸多样性分析**：
A显示了核酸序列。B显示了氨基酸序列，其中L119F-GSTe2标记用黄色突出显示，肯尼亚沿海样本中的变化用蓝色突出显示。肯尼亚（KEN）的单倍型代码与贝宁（BEN）、乌干达（UGA）、喀麦隆（CAM）、马拉维（MAL）和莫桑比克（MOZ）的代码相似。杀虫剂抗性概况显示：对于1型（氯菊酯；各站点的平均死亡率为3.2%），其抗性强度高于2型（溴氰菊酯、α-氰戊菊酯，各自的平均死亡率为35.5%和41.3%）。在裂谷地区（RV），这种抗性在An. funestus蚊子中比在肯尼亚西部更为明显，后者是传统的疟疾高发区（见图7A、B）。增加剂量对氯菊酯的死亡率仅有轻微影响（KV地区：1倍剂量=3%，5倍剂量=7.1%，10倍剂量=11.2%；Busia地区：1倍剂量=0%，5倍剂量=5.4%，10倍剂量=24%）。对于α-氰戊菊酯，Busia地区的死亡率随着剂量增加而显著上升（平均值分别为1倍剂量=20.4%，5倍剂量=87.4%，10倍剂量=100%），而KV地区则没有明显变化（平均值分别为1倍剂量=3.2%，5倍剂量=5.2%，10倍剂量=23.2%）。在Busia地区，随着溴氰菊酯浓度的增加，死亡率也显著上升（平均值分别为1倍剂量=68.3%，5倍剂量=84.6%，10倍剂量=86.5%；KV地区分别为1倍剂量=2.7%，5倍剂量=64.5%，10倍剂量=71.5%）（见图7a–c）。
图7：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。完整尺寸图像显示了Busia、Kerio Valley和Coast地区的Anopheles funestus种群对不同杀虫剂剂量的抗性模式（a），抗性强度测试（b）以及PBO与拟除虫菊酯的协同作用测试（c）。Per代表氯菊酯；α-cyp代表α-氰戊菊酯；delta代表溴氰菊酯；PBO代表哌丙醚。在Busia和KV地区测试的An. funestus蚊子包括An. funestus s.s.，而Coast地区的蚊子可能不完全是An. funestus s.s.。预先接触PBO显著提高了α-氰戊菊酯的死亡率（KV和Busia地区分别为39.5%和65.3%；溴氰菊酯分别为64.2%和89.6%）。然而，在KV地区，接触PBO仅使氯菊酯的死亡率略有上升（平均值=5%），低于Busia地区的10.8%。Coast地区的蚊子仅对氯菊酯表现出强烈抗性（1倍剂量=6.7%，5倍剂量=7.5%，10倍剂量=9.1%），而在PBO协同作用测试中的死亡率也较低（平均值为30.8%）。Busia和KV地区的蚊子都对DDT具有抗性（平均值分别为36.8%和68.3%），而Coast地区的蚊子则易感（平均值为98.4%）。相比之下，这三个地区的蚊子都完全对苯硫环己烷、嘧啶磷-甲基、噻虫啉和氯氟氰菊酯敏感（死亡率均为100%）。
通过 koktail PCR 方法鉴定出的F0代的An. funestus蚊子（用于抗性测试的F1代后代来自这些蚊子）中，99%（129/130）来自KV地区，99%（125/126）来自Busia地区。相比之下，来自Coast地区的An. funestus蚊子中仅有少数是An. funestus（5%），大部分是An. rivulorum（80%，72/90）。
研究抗性标记的传播对于监测疟疾媒介中的杀虫剂抗性、了解相关机制以及制定控制策略至关重要。本研究调查了裂谷分界线沿线An. funestus种群对多种杀虫剂的代谢抗性标记和抗性谱型，这些区域涵盖了肯尼亚的主要疟疾风险区。空间分布分析揭示了两种不同的模式：在KV和西部地区，An. funestus是Funestus组中的主要物种，并且主要在室内被发现。Coast地区也在某些地点以An. funestus为主，这些地点的蚊子主要在室外活动，这与之前的研究结果一致[3, 43, 44]。这可能表明该蚊子在Coast地区的叮咬和休息行为与西部/KV地区有所不同。疟疾媒介在室外的高叮咬行为可能导致它们对抗虫剂的表达方式不同。这种差异可能归因于多种因素的综合作用，包括媒介对人类行为的适应、气候以及遗传因素[43]。先前的研究发现，Coast地区的An. funestus种群与肯尼亚其他地区的种群存在遗传差异[27, 45]，但需要进一步研究室内和室外习性及叮咬时间背后的遗传异质性。研究还发现An. funestus中的Plasmodium孢子虫感染率很高，与中非[46]和东非[3, 10, 12, 47, 48]的观察结果相当甚至更高。值得注意的是，肯尼亚西部的研究地点显示了最高的Plasmodium感染率，其次是KV地区，然后是Coast地区。这些结果表明媒介种群在能力上的差异，或者可能是由于蚊帐和/或室内滞留喷洒（IRS）的使用和保护程度不同。尽管自2006年以来疟疾控制措施加强，肯尼亚西部仍持续存在高水平的Plasmodium传播和感染[49]，这需要进一步研究。这些媒介感染结果证实了这种蚊子在当前和持续疟疾传播中的重要作用[3, 4]。其他蚊种或未知物种在Coast地区更为普遍。由于这些其他物种，包括隐存物种[3, 29, 44, 50, 51]在传播中同样重要，因此对其抗性谱型的研究也非常重要。进一步的纵向调查将揭示这些物种的季节性动态及其在疟疾传播中的作用。
我们的研究揭示了肯尼亚An. funestus种群中代谢抗性标记等位基因频率的显著空间梯度：G454A-Cyp9K1和4.3kb-SV的频率从西部地区向裂谷再到Coast地区逐渐增加，而L199F-GSTe2的频率则下降，表明存在地区特定的选择压力。CYP6P9a突变在西方和裂谷地区仅限于纯合易感基因型，这与南部非洲CYP6P9突变体变异体向东非的有限地理扩散一致[15, 52]（除了中西部和坦桑尼亚东北部[19]）。尽管GSTe2 RR基因型在Coast地区占主导地位，但在裂谷东部的蚊子中携带易感GSTe2 SS基因型的蚊子感染Plasmodium的频率更高，这与中非研究中报道的抵抗基因型中的较高寄生虫流行率相反[38, 42]。在Coast地区发现的独特GSTe2单倍型进一步解释了这种差异，并支持了可能影响媒介-寄生虫相互作用的局部选择压力。有趣的是，我们观察到4.3kb-SV突变等位基因与寄生虫感染之间存在强烈的正相关，与之前的研究相反，后者报告称具有这种变异体的蚊子感染率较低[18]。这种差异可能反映了该标记对基因表达、媒介能力或杀虫剂选择的不同区域影响。Cyp9K1中的G454A突变是东非和中非2型拟除虫菊酯抗性的主要驱动因素[16]，其与4.3kb-SV一起接近固定状态，这与乌干达东部的观察结果一致[10, 12]。L119F-GSTe2、G454A-Cyp9K1和4.3kb-SV多基因位点组合的存在与感染状态无关。结合使用其他寄生虫检测方法可以提高Plasmodium孢子虫感染的估计精度，或者采用校正潜在高估的方法[53]，可以更好地推断基因型-表型之间的关系。已知的CYP6P9a/b与4.3-kb SV之间的拮抗作用[18]以及多种抗性因素对极端拟除虫菊酯抗性的累积影响（>1000倍）突显了复杂的适应性景观。这些发现共同揭示了肯尼亚An. funestus种群中关键抗性基因受到的不同选择压力，这些压力受到生态变异和局部杀虫剂暴露的影响，并强调了开展基因组研究以阐明适应性特征、潜在适应成本及其对疟疾传播影响的必要性。
本研究首次提供了肯尼亚Anopheles funestus中拟除虫菊酯抗性升级的证据，使用了5倍和10倍的区分剂量。抗性强度在不同地区存在显著差异，Coast地区的死亡率高于Kerio Valley（裂谷）和Busia（肯尼亚西部）地区的蚊子。物种组成可能是造成这种差异的原因之一：Coast地区的样本主要由An. rivulorum组成（<5%的An. funestus），而KV和Busia地区的种群几乎全部为An. funestus（>99%）。这些不同物种之间的抗性机制是否有差异尚不清楚，但这可能部分解释了Coast地区较低的抗性。在10倍剂量下氯菊酯的低死亡率令人担忧，并与最近关于Coast地区An. funestus拟除虫菊酯抗性的报告一致[54]。值得注意的是，KV地区的抗性强度高于Busia地区，这可能反映了农业活动（如棉花种植）中对杀虫剂的强烈选择，而这些活动主要依赖拟除虫菊酯，而公共卫生干预措施（如蚊帐和IRS）在Coast和肯尼亚西部更为普遍[55]。协同作用测试显示，在接触PBO后，尤其是氯菊酯，死亡率较低，这表明细胞色素P450介导的解毒是一个重要但非唯一的抗性驱动机制。尽管接触了PBO，高抗性仍然持续存在，表明其他代谢途径、表皮修饰或额外的遗传因素也可能起作用。此外，多基因位点抗性基因型的存在，包括Cyp9K1、4.3kb-SV和GSTe2的组合，表明可能存在复杂的相互作用，这些相互作用可能影响杀虫剂耐受性和媒介传播能力。这些发现强调了进行分子和基因组研究以揭示这些种群抗性升级的适应机制的必要性[56]。
令人鼓舞的是，所有种群都对苯硫环己烷完全敏感，这与乌干达之前的研究结果相反[10, 57]，表明这种拟除虫胺在这些地区仍然是有效的IRS选择。对有机磷类化合物和新型化学物质（包括嘧啶磷-甲基、噻虫啉和氯氟氰菊酯）的完全敏感性进一步扩展了拟除虫菊酯抗性管理的工具库[10, 58, 59]。这里记录的拟除虫菊酯抗性升级对于媒介控制效果具有明显影响，特别是对于蚊帐和IRS策略[11]，在邻国乌干达也观察到了类似的趋势[10, 12]。不同物种、地区和选择压力下的抗性异质性强调了需要根据当地情况制定干预措施并持续监测抗性动态，以便有效控制疟疾。本研究的局限性在于用于表型抗性分析的地点地理范围有限，我们假设这些地点能代表每个疟疾风险区。杀虫剂抗性可能随季节、地理和环境条件而变化[60, 61]；我们的横断面设计可能无法提供稳定的抗性谱型模式，因此需要通过进一步的纵向评估来验证时间一致性。此外，研究我们的抗性结果与农业中的杀虫剂使用情况（包括蚊帐的使用）之间的关系，可以揭示它们对抗性发展的相对贡献及其背后的驱动因素。尽管如此，我们的研究对于表征肯尼亚这一难以研究的物种的多个种群的抗性谱型取得了重要进展。进一步将遗传抗性标记与表型抗性之间的关联结合起来，可以通过评估存活样本及其基因转录本之间的相对分布来进一步研究[10, 11, 61]。目前正在对这些样本进行转录组分析，这应该能提供更多关于驱动蚊子种群抗性的潜在分子机制的见解。通过长期全国范围内的监测，结合抗性标记的频率和表型抗性的数据，以及疟疾传播指数，可以帮助国家疟疾控制计划制定有效的干预措施。
研究证实，在肯尼亚西部-RV-Coast梯度上，表现出拟除虫菊酯抗性的An. funestus种群中Plasmodium感染率很高，并且抗性基因（至少在GSTe2方面）的进化历史不同。在肯尼亚的杀虫剂抗性传播和有效管理中，应考虑裂谷地区的作用。需要进一步的工作来阐明抗性升级的分子基础以及观察到的抗性突变对疟疾传播的影响。
打赏
