摘要
瘟病毒是一类宿主范围广泛的病原体，能够感染家养动物和野生动物，其中一些病毒具有抗原相似性和交叉中和能力。然而，其背后的分子机制仍不清楚。在本研究中，使用杂交瘤技术，用经典猪瘟病毒（CSFV）LPC株的纯化E2蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，以生成单克隆抗体（mAbs）。通过免疫荧光测定（IFA）和Western blot方法检测mAbs与瘟病毒及E2蛋白的反应性。结果产生了31种针对CSFV E2蛋白的mAbs，其中两种mAbs TCH034和TCH052对不同基因型的CSFV、BVDV1和BVDV2以及8种瘟病毒（CSFV、BVDV1、BVDV2、HobiPeV、BDV、AydinPeV、TSV和ovIT PeV）的E2蛋白表现出广谱反应性。这些广谱瘟病毒mAbs对现有的CSFV、BVDV1和BVDV2菌株具有中和活性。通过对截短和点突变的E2蛋白进行表位分析，发现TCH034和TCH052识别出8种瘟病毒E2蛋白中高度保守的抗原表位，包括残基G113、K114、W133和G135；这一发现进一步得到证实，因为TCH034和TCH052无法与含有K114M、K114N、K114R和K114T突变的CSFV JL23菌株发生反应或中和它们。综上所述，本研究的结果阐明了瘟病毒之间抗原保守性和交叉中和的分子基础，为开发针对重要经济害虫病毒的诊断检测方法提供了宝贵支持。
引言
瘟病毒具有广泛的宿主范围，不仅能感染家养和野生偶蹄类动物，还能感染多种野生动物，如瞪羚、长颈鹿、穿山甲、蝙蝠和竹鼠，以及海洋哺乳动物如港湾鼠海豚[1,2,3,4,5]。根据国际病毒分类委员会（ICTV）发布的最新分类报告[6]，瘟病毒属目前包含多达19种不同的病毒，包括Pestivirus bovis（牛病毒性腹泻病毒1型，BVDV1）、Pestivirus tauri（牛病毒性腹泻病毒2型，BVDV2）、Pestivirus suis（猪瘟病毒，CSFV）、Pestivirus ovis（边界病病毒，BDV）、Pestivirus brazilense（类似HoBi的瘟病毒，HoBiPeV或BVDV3）、Pestivirus aydinense（AydinPeV）、Pestivirus N（突尼斯羊瘟病毒，TSV）和Pestivirus O（羊/IT瘟病毒，ovIT PeV）。其中，CSFV、BVDV1、BVDV2、BVDV3（HoBiPeV）和BDV在畜牧业中造成重大经济损失。由CSFV引起的经典猪瘟（CSF）是全球最具破坏性的猪病之一，其特征是高烧、出血和生殖障碍[7]。BVDV1和BVDV2可感染多种家养和野生动物，包括牛、山羊、绵羊、猪、鹿、水牛和羊驼，导致腹泻、呼吸系统和生殖系统障碍以及持续感染[8]。HoBiPeV（也称为BVDV3）首次在巴西受污染的牛血清中被发现[9]，在南美洲、欧洲和亚洲广泛存在，引起呼吸窘迫、流产、黏膜疾病（MD）和胃肠道障碍[10]。BDV感染绵羊会导致流产、死产和免疫抑制[11]。此外，BVDV1、BVDV2和BVDV3及其相应的中和抗体经常存在于牛血清中。牛血清中的BVDV中和抗体可以降低与BVDV具有抗原同源性的瘟病毒的感染滴度，从而干扰瘟病毒疫苗的生产及相关病毒感染研究。当培养基中含有被瘟病毒污染的牛血清时，易感细胞的体外感染也会受到抑制。总体而言，被瘟病毒及其中和抗体污染的牛血清对生命科学研究和瘟病毒疫苗生产构成了重大障碍，这突显了通过全瘟病毒检测方法进行严格检疫的必要性。
对于最初定义的瘟病毒，观察到了显著的遗传多样性，每种CSFV、BVDV和BDV都可以进一步分为多个基因型[12,13,14]。此外，不同瘟病毒物种之间也存在抗原交叉反应性[15,16,17]，但这种现象的分子基础尚不清楚。迄今为止，只有少数几种广谱瘟病毒mAb被报道，包括m912和4-9D4（针对E2蛋白）[18, 19]、15C5（Erns特异性）[20]和C16（NS3结合）[21]。中和mAb m912仅能与BDV、GPeV和某些CSFV菌株反应，识别关键氨基酸残基P/L709和E713[18]。mAb 4-9D4识别的表位995YYEP998在CSFV、BVDV1、BVDV2、BVDV3和BDV的E2蛋白中高度保守，但只有在使用1% NP-40洗涤剂处理病毒颗粒后才能有效识别该表位，因为该表位位于蛋白质C末端且靠近病毒包膜，导致无法充分暴露以有效刺激体液免疫并与其抗体相互作用，从而限制了mAb 4-9D4在抗原和抗体检测中的广谱应用[19]。Erns蛋白mAb 15C5对大多数BVDV1、BVDV2、BVDV3、BDV和Bungowannah病毒具有反应性[20]。同样，NS3蛋白mAb C16也表现出对瘟病毒的广谱识别[21]。然而，这些非中和mAb 15C5和C16识别的表位尚未明确。
在这里，我们生成了两种广谱中和mAb（TCH034和TCH052），它们针对CSFV、BVDV1、BVDV2、BVDV3、BDV及其他3种瘟病毒菌株中保守的E2表位，为重要经济害虫病毒之间的交叉中和提供了新的结构基础。我们的发现还将有助于开发通用的瘟病毒抗体和抗原诊断工具。
材料与方法
细胞和病毒
我们实验室维持的猪肾细胞（PK-15）在添加了8%胎牛血清（FBS）的最小必需培养基（MEM）中培养。Madin-Darby牛肾（MDBK）细胞在添加了8% FBS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养。Spodoptera frugiperda细胞（Sf9）在添加了4% FBS的Grace昆虫培养基中培养。PK-15细胞和MDBK细胞在37℃、5% CO2条件下培养，而Sf9细胞在27℃下培养。我们实验室保存了79株属于亚型1.1、2.1、2.2和2.3的CSFV菌株，4株属于亚型1a、1b、1c和1m的BVDV1菌株，以及1株BVDV2a菌株。
分泌E2 mAb的杂交瘤制备
TECON Biopharmaceutical Co., Ltd提供的CSFV减毒疫苗株LPC的纯化E2蛋白与等体积的Seppic 201佐剂混合以实现完全乳化。随后，6–8周龄的雌性BALB/c小鼠通过皮下多点注射进行免疫，每次注射50 μg蛋白。第三次免疫后一周收集血清样本，通过IFA检测稀释血清与LPC感染细胞的反应性，从而确定免疫小鼠血清中的抗体滴度。对于免疫反应最好的小鼠，腹腔注射100 μg未加佐剂的纯化蛋白。一周后，收集脾细胞并通过电融合方法与骨髓瘤细胞SP2/0融合。在半固体培养基ClonaCell™-HY Cloning-Medium D（STEMCELL Technologies, Canada）中培养10天后，选择独立的细胞克隆并在96孔板中于37℃和5% CO2条件下培养72小时。通过IFA验证分泌E2蛋白的杂交瘤细胞，阳性细胞通过半固体培养基进行亚克隆。杂交瘤细胞通过IFA验证后扩增并冷冻保存。动物实验获得了吉林大学动物护理和使用委员会（编号KT202003064）的批准。
从腹水中纯化mAb
6–8周龄的雌性BALB/c小鼠每只腹腔注射300 μL专用佐剂，并饲养12天。通过温和分散后以1000×g离心5分钟制备杂交瘤细胞。去除培养上清液后，将细胞重新悬浮在生理盐水中，使最终细胞密度达到2×10^6细胞/mL。然后将500 μL重新悬浮的杂交瘤细胞注射到每只小鼠的腹腔中。当小鼠腹部周长显著增加时，用注射器抽取腹水，然后以12000×g离心10分钟。最后，使用Protein A/G 4FF色谱柱从腹水中纯化mAb，并测定抗体浓度。
确定E2 mAb与瘟病毒之间的反应模式
1990年至2019年间从中国不同地区收集了79株代表不同亚型的CSFV菌株，用于分析E2 mAb与CSFV之间的反应模式。这些菌株包括5株亚型1.1菌株（包括疫苗株HCLV、LPC和高毒力Shimen菌株）、42株亚型2.1菌株、22株亚型2.2菌株和10株亚型2.3菌株。这些病毒以0.1的感染复数（MOI）接种到PK-15细胞中。另外，4株BVDV-1菌株（1a、1b、1c和1m）和1株BVDV-2a菌株以0.1的MOI接种到MDBK细胞中，以分析BVDV与E2 mAb之间的反应模式。在37℃和5% CO2条件下培养72小时后，用80%冷丙酮固定感染细胞1小时。随后，将浓度为1 mg/mL的纯化mAb以1:1000稀释于PBS中，每孔加入100 μL作为一抗。在37℃下培养1小时后，用PBS洗涤3次，然后加入Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG二抗（稀释至1:500）到感染细胞上。在荧光显微镜下观察CSFV和BVDV与mAb的反应性。
为了进一步确定其他国家和地区流行的CSFV菌株与E2 mAb之间的反应模式，使用了来自18株代表10个亚型的CSFV菌株的E2蛋白（这些菌株在我们之前的研究中使用杆状病毒表达系统表达[22]），每种蛋白加入20 μg进行检测。此外，还从17种不同BVDV亚型的代表菌株以及9种其他瘟病毒物种的代表菌株中真核表达了E2蛋白（BVDV1-3和CSFV除外，菌株信息见附加文件1）。BVDV和其他瘟病毒菌株的E2蛋白（1–331个氨基酸）由Comate Biotechology公司（吉林）合成并连接到pFastBac1质粒中，然后转化到DH10Bac感受态细胞中以生成重组杆状病毒质粒。随后，利用昆虫杆状病毒表达系统表达E2蛋白，每种蛋白使用20–50 μg通过Western blot检测mAb的病毒反应谱，方法如前所述[22]。一抗（杂交瘤细胞培养上清液）以1:100稀释后与转移到PVDF膜上的E2蛋白在4℃下过夜孵育，然后与1:500稀释的Alexa Fluor 680驴抗小鼠IgG二抗在室温下孵育1小时。通过使用Odyssey成像系统进行膜扫描，确定了单克隆抗体（mAbs）与E2蛋白之间的反应模式。中和试验：选取了7种CSFV株和5种BVDV株，每种代表不同的亚基因型，并且之前已经确认它们能与mAbs TCH034和TCH052发生反应，将这些病毒株用MEM（针对CSFV）或DMEM（针对BVDV）稀释至2000 TCID50/mL的滴度。随后，将每种稀释后的病毒悬浮液50 μL分配到96孔板中的各个孔中。纯化的mAbs TCH034和TCH052被调整至2 mg/mL的浓度，然后在MEM（针对CSFV）或DMEM（针对BVDV）中进行了两倍系列稀释。接下来，将每种抗体稀释液50 μL与相应的病毒溶液混合，并在37°C下孵育1小时。之后，在每个孔中加入100 μL的PK-15细胞（针对CSFV）或MDBK细胞（针对BVDV），并将板子在37°C和5% CO2条件下孵育3天。然后进行IFA（免疫荧光分析）以评估mAbs对CSFV和BVDV的中和活性。mAbs对各种CSFV和BVDV株的中和滴度定义为使50%的重复孔无病毒感染的最高稀释倍数（ND50）。所有生成的ND₅₀数据均使用OriginPro 2025软件进行编译和统计分析。
为了识别TCH034和TCH052所识别的抗原表位，首先用含有或不含有二硫苏糖醇（DTT）的加载缓冲液处理LPC E2蛋白（20 μg），随后进行Western blot分析，以表征mAbs TCH034和TCH052对不同处理蛋白的反应模式，从而区分这两种mAb是针对线性表位还是构象表位。接着，通过mAbs与在我们实验室中真核表达的CSFV E2蛋白截短变体之间的相互作用，定位了TCH034和TCH052的目标表位区域[22]。Western blot分析使用20 μg的每种截短E2蛋白与mAbs孵育，以绘制包含表位的区域。在确定目标区域后，使用CLC Sequence Viewer 8.0对来自50种代表性虫媒病毒株的E2蛋白进行多序列比对，这些病毒株涵盖了11个物种，包括那些与mAbs有反应或无反应的物种，以识别可能负责差异识别的候选残基。随后，使用PyMOL对E2蛋白进行结构建模，以识别这些候选残基空间上相邻的氨基酸残基。之后，通过定点突变（SDM）技术使用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit（Vazyme，中国）引入可能负责与mAbs结合的E2蛋白中的突变残基，模板为质粒pFastBac1-LPC-E2[22]，引物详见附件2（LPC-G113H-F至LPC-W133A-R）。如前所述，使用昆虫杆状病毒表达系统真核表达突变后的E2蛋白[22]。然后进行Western blot分析，以评估mAbs TCH034和TCH052对这些突变E2蛋白的结合能力，从而精确识别这两种mAb所识别的表位。为了进一步验证所绘制表位的准确性，从TCH034和TCH052的杂交瘤细胞中提取总RNA，并作为使用5’ RACE方法进行逆转录的模板，然后通过PCR扩增重链和轻链基因的可变区域，所得扩增子由Sangon Biotech（上海）有限公司进行测序。将得到的抗体序列与CSFV E2蛋白序列使用AlphaFold2进行比对，以预测表位。
为了进一步验证这些mAb（TCH034和TCH052）与E2蛋白结合的关键抗原表位的保守性，使用来自1335种被mAbs TCH034和TCH052识别的8种虫媒病毒株的E2蛋白序列进行了多序列比对，包括265种BVDV1株、162种BVDV2株、828种CSFV株、43种BDV株、30种HobiPeV株、2种AydinPeV株、2种TSV株和3种ovIT PeV株。此外，还包括了三种与mAb TCH034和TCH052无反应的虫媒病毒株（GPeV、PAPeV和PPeV）作为序列参考。对于差异位点，基于在我们实验室构建的表达质粒pcDNA3.1-JL23-E2，对CSFV亚基因型2.1b株JL23的E2蛋白中的相应氨基酸进行SDM突变，并在GPeV E2蛋白中引入了N114K突变，突变引物（JL23-G113V-F至H138-N114K-R）列在附件2中。随后，如上所述，将突变蛋白真核表达。然后进行Western blot分析，以评估mAbs TCH034和TCH052对这些突变E2蛋白的结合能力，从而精确识别这两种mAb所识别的表位。为了进一步验证所绘制表位的准确性，从TCH034和TCH052的杂交瘤细胞中提取总RNA，并作为使用5’ RACE方法进行逆转录的模板，然后通过PCR扩增重链和轻链基因的可变区域，所得扩增子由Sangon Biotech（上海）有限公司进行测序。将得到的抗体序列与CSFV E2蛋白序列使用AlphaFold2进行比对，以预测表位。
为了进一步验证这些mAb（TCH034和TCH052）与E2蛋白结合的关键抗原表位的保守性，使用来自1335种被mAb TCH034和TCH052识别的8种虫媒病毒株的E2蛋白序列进行了多序列比对，包括265种BVDV1株、162种BVDV2株、828种CSFV株、43种BDV株、30种HobiPeV株、2种AydinPeV株、2种AydinPeV株、2种TSV株和3种ovIT PeV株。此外，还包括了三种与mAb TCH034和TCH052无反应的虫媒病毒株（GPeV、PAPeV和PPeV）作为序列参考。对于差异位点，基于在我们实验室构建的表达质粒pcDNA3.1-JL23-E2，对CSFV亚基因型2.1b株JL23的E2蛋白中的相应氨基酸进行SDM突变，并在GPeV E2蛋白中引入了N114K突变，突变引物（JL23-G113V-F至H138-N114K-R）列在附件2中。随后，如上所述，将突变蛋白真核表达，含有位点突变的质粒使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，美国）转染到HEK-293 T细胞中。转染后72小时收获表达的蛋白，并通过Western blot分析，以确定抗原表位内的氨基酸替换是否影响mAb与E2蛋白的结合。
从CSFV株JL23中使用HiPure Viral RNA/DNA Kit（Magen，中国）提取病毒RNA，随后使用M-MLV逆转录酶（TaKaRa，中国）合成cDNA。全长病毒基因组被分成六个重叠片段（分别标记为S1至S6），使用特定引物（附件3：JL23-F1-F至JL23-F6-R）和Vazyme P516高保真DNA聚合酶（Vazyme，中国）通过PCR分别扩增这些片段。为了构建携带E2替换K114M、K114N、K114R或K114T的JL23突变株，首先将野生型片段S3克隆到pFastBac1载体中，然后使用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit（Vazyme，中国）进行SDM，以在E2基因中引入所需的点突变。突变引物列在附件3中（JL23-K114M-F至JL23-K114T-R）。通过Sanger测序验证突变后的E2基因后，使用重组质粒作为模板，分别通过PCR扩增含有K114M、K114N、K114R或K114T替换的突变S3片段。为了实现病毒基因组的环化，需要一个连接片段，该片段基于之前报道的协议进行了少量修改，参考了Tomokazu Tamura等人开发的用于BVDV的环状聚合酶延伸反应（CPER）方法[23]。这个1131-bp的连接片段由以下顺序片段组成：对应于JL23株基因组3’-UTR末端的20-bp序列（AGGCAATTTCCTAACGGCCC）、丙型肝炎病毒核酶、SV40多聚腺苷酸化（SV40 polyA）信号、165-bp间隔序列、巨细胞病毒（CMV）启动子以及对应于JL23株基因组5’-UTR末端的36-bp序列（GTATACGAGATTAGCTCATCCTCGTGTACAATATTG）。该连接片段被人工合成并插入到质粒pFastBac1的BamH I和EcoR I限制位点之间。随后，使用该重组质粒作为模板扩增连接片段。之后，将扩增的连接片段与六个重叠的病毒基因组片段组装成环状DNA，组装反应使用Vazyme P516高保真DNA聚合酶进行。
共培养的PK-15和HEK-293 T细胞使用Lipofectamine LTX（Invitrogen，美国）转染环状DNA，然后在37°C和5% CO2条件下孵育3天后再进行传代。在传代过程中，由于HEK-293 T细胞相对于PK-15细胞具有不同的胰蛋白酶敏感性，因此选择性地消除了HEK-293 T细胞，从而使CSFV在PK-15细胞中独家繁殖。为了评估重组CSFV株在PK-15细胞中的稳定繁殖潜力，进行了连续传代。随后，使用附件3中列出的引物组（外引物：CSFV-E2-WF和CSFV-E2-WR；内引物：CSFV-E2-NF和CSFV-E2-NR）通过RT-PCR扩增第6代的病毒全长E2基因，扩增产物由Sangon Biotech（上海）有限公司进行测序。确认病毒复制稳定后，构建了重组病毒的生长曲线，以评估E2蛋白中的K114突变对病毒复制动力学的影响。分别用MOI为0.1的突变病毒和野生型病毒接种PK-15细胞，感染后12、24、48和72小时收获细胞培养上清液进行病毒滴度测定，每个样本重复三次。基于三次独立实验的数据计算平均值和标准差，并使用OriginPro 2025生成图表。为了确定K114突变对mAb与重组病毒结合反应性的影响，通过IFA分析了mAbs TCH034/TCH052与 rescued突变或野生型CSFV株之间的相互作用。为了评估mAb对突变CSFV株的中和活性，将10 μg从腹水中纯化的TCH034和TCH052与100 TCID50的亲本或重组CSFV JL23株混合孵育。杂交瘤细胞SP2/0腹水和CSFV E2中和mAb HCL-001腹水分别作为阴性和阳性对照[24]。
为了表征与mAbs TCH034和TCH052有反应或无反应的虫媒病毒株的系统发育关系，从GenBank中检索了来自30种代表性菌株的E2蛋白基因，这些菌株涵盖了所有19种虫媒病毒。选定的菌株包括4种BVDV1株、3种BVDV2株、5种CSFV株以及15种其他虫媒病毒的单个菌株：PAPeV、PPeV、GPeV、HoBiPeV、AydinPeV、RPeV、APPeV、LindaV、PhoPeV、TSV、ovIT PeV、DYPV、RtNn-PeV、RtAp-PeV和BtSk-PeV。使用MEGA 7.0软件中的最大似然（ML）方法进行了系统发育分析[25, 26]，并通过1000次自助法复制评估了推断出的系统发育树的稳健性，以确保统计可靠性。随后使用tvBOT对系统发育树进行了后处理和可视化优化，以更清晰地展示进化关系[27]。
TCH034和TCH052对虫媒病毒表现出广谱反应性：使用杂交瘤技术，从2,700个杂交瘤细胞克隆中通过IFA使用LPC感染的PK-15细胞分离出总共31个分泌特异性针对CSFV LPC株抗体的杂交瘤克隆。随后，进行IFA以验证所得mAb对79种涵盖四个亚基因型（1.1、2.1、2.2和2.3）的CSFV株的反应性。在这些mAb中，TCH034和TCH052与所有测试的CSFV株都发生了反应，它们对四个亚基因型的代表性菌株的反应性在图1A中展示。出乎意料的是，TCH034和TCH052还与我们实验室中的BVDV株发生了交叉反应，包括BVDV-1a（NADL）、BVDV-1b（HY-9）、BVDV-1c（Oregon）、BVDV-1 m（NM-HDNFY）和BVDV2a（890）（图1B），表明它们对多种虫媒病毒具有广泛的反应性。此外，TCH034对所有CSFV和BVDV株的反应强度显著强于TCH052（图1A和B）。
图1：TCH034和TCH052与虫媒病毒的反应模式。A. TCH034和TCH052与CSFV的反应性。使用79种涵盖亚基因型1.1、2.1、2.2、2.3的CSFV株进行IFA，以评估mAb与CSFV的反应性，结果显示mAb与所有测试的CSFV株均呈阳性结合。B. TCH034和TCH052与BVDV1株NADL-1a、HY-9-1b、Oregon-1c、NM-HDNFY-1 m和BVDV-2a株890的交叉反应性。IFA结果显示TCH034和TCH052与所有测试的BVDV株均呈阳性反应。C. TCH034和TCH052与来自18种不同亚基因型的18种CSFV E2蛋白的反应性。使用20 μg的每种蛋白进行Western blot分析，显示TCH034和TCH052与所有测试的E2蛋白均表现出强结合。D. TCH034和TCH052与17种代表独特亚基因型的17种BVDV E2蛋白的交叉反应性。Western blot使用20 μg的每种蛋白进行，除了BJ1201-1d、UM/111/06-1 g和SD1301-2b株（30 μg）。结果确认了mAb对BVDV株的广谱反应性。E. TCH034和TCH052与代表13种不同物种的13种虫媒病毒E2蛋白的反应性。Western blot使用20 μg的每种蛋白进行（BDV-X818和APPeV-515为30 μg，PAPeV-AY781152和PPeV-Bungowannah及RPeV-NrPV/NYC-D23为50 μg），表明这两种mAb与8种不同虫媒病毒的E2蛋白发生了交叉反应。F. 基于30种代表19种物种的虫媒病毒的全长E2基因序列的虫媒病毒系统发育树。使用MEGA 7.0和JTT矩阵模型进行系统发育分析[25, 26]，并使用tvBOT对系统发育树进行了可视化和优化[27]。被TCH034和TCH052识别的瘟病毒株用红色星号标记。为了进一步确认TCH034和TCH052对CSFV的广谱反应性，将来自其他国家和地区流行的六个亚型（1.2、1.3、1.4、3.1、3.2和3.4）的CSFV代表株的E2蛋白以及在中国大陆流行的CSFV株（亚型1.1、2.1、2.2和2.3）的E2蛋白进行真核表达（后者包括上述IFA中使用的大多数CSFV株，见图1A）。Western blot分析显示，TCH034和TCH052与所有10个CSFV亚型的E2蛋白的结合亲和力相当。观察到了明显的E2二聚体条带，同时也检测到了较弱的E2单体条带（见图1C）。此外，还进行了Western blot分析，以确定TCH034和TCH052对BVDV1（15个亚型）和BVDV2（2个亚型）的E2蛋白的反应性（排除了IFA中使用的5个BVDV株，见图1B）。如图1D所示，与TCH034和TCH052孵育后，所有测试的BVDV E2蛋白都检测到了E2二聚体条带。值得注意的是，TCH052对BVDV E2蛋白的结合活性比TCH034弱。上述结果表明，TCH034和TCH052可能具有泛瘟病毒反应性，这一点通过使用13种瘟病毒株的E2蛋白进行的Western blot得到了进一步验证。如图1E所示，除了BVDV1、BVDV2和CSFV外，这两种单克隆抗体还与感染家畜（猪、牛和羊）的瘟病毒的E2蛋白结合，包括BDV（Pestivirus ovis）、AydinPeV（Pestivirus aydinense）、HobiPeV（Pestivirus brazilense）、TSV（Pestivirus N）和ovIT PeV（Pestivirus O）（见图1F）。相比之下，没有检测到对主要在野生动物中流行的瘟病毒株的反应性，包括PAPeV（Pestivirus antilocaprae）、PPeV（Pestivirus australiaense）、GPeV（Pestivirus giraffae）、RPeV（Pestivirus ratti）或APPeV（Pestivirus scrofae）——这是这一野生动物相关组中唯一的与猪相关的瘟病毒（见图1F）。此外，这两种单克隆抗体识别的瘟病毒对畜牧业具有重要的经济价值，而未被检测到的瘟病毒在全球的流行病学分布极为有限。
TCH034和TCH052能够中和CSFV、BVDV1和BVDV2。为了评估广谱瘟病毒单克隆抗体TCH034和TCH052的中和活性，首先使用蛋白质A/G亲和层析法从腹水中纯化了这两种单克隆抗体，并随后对其浓度进行了定量。然后使用纯化的TCH034和TCH052进行了中和试验，以评估它们对图1A和B中详细列出的CSFV和BVDV株的中和能力。简而言之，每种单克隆抗体2 μg被连续稀释两倍，并与100 TCID50的相应稀释病毒孵育。如图2A所示，TCH034和TCH052都能中和CSFV，但效率明显不同。值得注意的是，TCH034对减毒疫苗株HCLV/LPC（ND50 = 4–8）的中和作用较弱，而其他CSFV株的ND50为32–512。相比之下，TCH052对LPC和HCLV的中和ND50分别为512–1024和128–256。如图2B所示，这两种单克隆抗体也能中和BVDV，它们对不同BVDV株的最大ND50范围为16至32。对比分析它们的中和能力发现，TCH034和TCH052对CSFV的中和作用显著强于对BVDV的中和作用，唯一的例外是TCH034对CSFV疫苗株HCLV和LPC的中和作用较弱。有趣的是，尽管在IFA中TCH034对所有测试的CSFV和BVDV株的反应性都高于TCH052（见图1A和B），但TCH052对特定的CSFV和BVDV株表现出更强的中和活性。
图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
确定单克隆抗体TCH034和TCH052对多种CSFV（A）和BVDV（B）株的中和效力。简而言之，2 μg的纯化单克隆抗体被连续稀释两倍，每种稀释液100 μL与100 TCID50的CSFV或BVDV株在37℃下孵育1小时。随后将混合物接种到96孔板中的PK-15细胞（用于CSFV）或MDBK细胞（用于BVDV）上。孵育72小时后，进行IFA以确定单克隆抗体对每种病毒株的ND50。结果表明，TCH034和TCH052对CSFV和BVDV分离株都表现出强大的中和活性。条形图的高度表示平均ND₅₀值，误差条表示从三个独立实验重复中计算的标准偏差（SD）。
TCH034和TCH052识别的保守表位。为了确定广谱单克隆抗体识别的是线性表位还是构象表位，将CSFV-LPC E2蛋白用加载缓冲液处理，有的加还原剂DTT，有的不加，然后进行Western blot分析。如图3A所示，DTT处理后单克隆抗体与E2蛋白的反应消失，证实单克隆抗体特异性识别构象表位。接下来，将缺少主要抗原区域[22]的截短CSFV E2蛋白（其示意图见图3B）分别与TCH034和TCH052反应。Western blot显示，TCH034和TCH052都不与缺少D/A抗原区域的截短E2蛋白结合，这表明这两种单克隆抗体识别位于D/A区域内的表位（见图3C）。
图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
鉴定单克隆抗体TCH034和TCH052识别的抗原区域。在不同缓冲条件下单克隆抗体TCH034和TCH052与E2蛋白的反应性：第1泳道，未经DTT处理的E2蛋白；第2泳道，经过DTT处理的还原E2蛋白。B 野生型和截短E2蛋白的示意图：WT，全长E2蛋白；∆B/C-E2，缺少B/C抗原结构的E2蛋白；∆D/A-E2，缺少D/A抗原结构的E2蛋白；∆B/C/D/A-E2，缺少B/C/D/A抗原结构的E2蛋白；B/C/D/A-E2，E2蛋白的B/C/D/A抗原结构。C TCH034和TCH052与截短E2蛋白的结合反应性。野生型和四种截短E2变体在真核细胞中表达，并使用这两种单克隆抗体进行Western blot分析，每条泳道加载20 μg的总蛋白。结果清楚地表明，TCH034和TCH052的结合表位位于E2蛋白的D/A抗原结构上。
不同菌株的E2蛋白D/A区域的序列比对显示，与TCH034和TCH052反应的菌株在E2蛋白的第114位含有赖氨酸残基（K），而未被单克隆抗体检测到的瘟病毒株在该位置含有天冬酰胺（N）或谷氨酰胺（Q）（见图4）。E2蛋白的结构建模进一步表明，氨基酸残基113、116、118、132、133、134和135与K114空间相邻。为了进一步研究广谱单克隆抗体的结合位点，使用昆虫杆状病毒系统表达了带有定点突变（G113H、K114N、N116G、T118N、G132L、W133A、T134H和G135H）的LPC-E2蛋白。Western blot显示，G113H、K114N、W133A和G135H的突变消除了E2蛋白与TCH034和TCH052的反应性（见图5A）。作为对照，另一种针对CSFV E2蛋白D/A区域的单克隆抗体WH303[28]也对W133A和G135突变体的结合减弱，表明这两个残基可能影响D/A区域的整体抗原结构。值得注意的是，该区域内其他保守位点的突变不影响抗体结合。因此，TCH034和TCH052识别的表位包括E2蛋白中的G113K114、W133和G135残基，其中G113和K114对直接抗原-抗体结合至关重要，而W133和G135可能维持表位呈现所需的结构完整性，这一点通过基于PyMOL的表位建模（见图5B）和使用AlphaFold2进行的TCH034与E2蛋白的结构模拟（见图5C）得到了进一步验证，在后者中K114位于抗体结合界面内，与单克隆抗体形成氢键。先前已确定W133和G135残基位于融合肽1（FP1）内，该肽在病毒包膜与细胞膜的融合过程中起关键作用[29, 30]。
图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
对50种来自11个物种的瘟病毒株的E2蛋白进行多序列比对，使用CLC Sequence Viewer 8.0进行比对，以BVDV-1a-SD1的E2蛋白作为参考序列。与参考序列相同的残基用点表示。位于实线以上的瘟病毒E2蛋白被单克隆抗体TCH034和TCH052识别，而位于实线以下的残基与这两种单克隆抗体无结合反应。突变后影响单克隆抗体-蛋白结合的残基用黄色框突出显示，而对单克隆抗体结合非必需的残基用红色框标记。
图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
TCH034和TCH052识别的抗原表位。鉴定单克隆抗体TCH034和TCH052与E2蛋白的反应性。在不同缓冲条件下单克隆抗体TCH034和TCH052与E2蛋白的反应性：第1泳道，未经DTT处理的E2蛋白；第2泳道，经过DTT处理的还原E2蛋白。B 野生型和截短E2蛋白的示意图：WT，全长E2蛋白；∆B/C-E2，缺少B/C抗原结构的E2蛋白；∆D/A-E2，缺少D/A抗原结构的E2蛋白；∆B/C/D/A-E2，缺少B/C/D/A抗原结构的E2蛋白；B/C/D/A-E2，E2蛋白的B/C/D/A抗原结构。C TCH034和TCH052与截短E2蛋白的结合反应性。野生型和四种截短E2变体在真核细胞中表达，并使用这两种单克隆抗体进行Western blot分析，每条泳道加载20 μg的总蛋白。结果清楚地表明，TCH034和TCH052的结合表位位于E2蛋白的D/A抗原结构上。
不同菌株的E2蛋白D/A区域的序列比对显示，与TCH034和TCH052反应的菌株在E2蛋白的第114位含有赖氨酸残基（K），而未被单克隆抗体检测到的瘟病毒株在该位置含有天冬酰胺（N）或谷氨酰胺（Q）（见图4）。E2蛋白的结构建模进一步表明，氨基酸残基113、116、118、132、133、134和135与K114空间相邻。为了进一步研究广谱单克隆抗体的结合位点，使用昆虫杆状病毒系统表达了带有定点突变（G113H、K114N、N116G、T118N、G132L、W133A、T134H和G135H）的LPC-E2蛋白。Western blot显示，G113H、K114N、W133A和G135H的突变消除了E2蛋白与TCH034和TCH052的反应性（见图5A）。作为对照，另一种针对CSFV E2蛋白D/A区域的单克隆抗体WH303[28]也对W133A和G135突变体的结合减弱，表明这两个残基可能影响D/A区域的整体抗原结构。值得注意的是，该区域内其他保守位点的突变不影响抗体结合。因此，TCH034和TCH052识别的表位包括E2蛋白中的G113K114、W133和G135残基，其中G113和K114对直接抗原-抗体结合至关重要，而W133和G135可能维持表位呈现所需的结构完整性，这一点通过基于PyMOL的表位建模（见图5B）和TCH034与E2蛋白之间的结构模拟（见图5C）得到了进一步验证，在后者中K114位于抗体结合界面内，与单克隆抗体形成氢键。先前已确定W133和G135残基影响广谱单克隆抗体与E2蛋白的结合，这些残基位于融合肽1（FP1）内，该肽在病毒包膜与细胞膜的融合过程中起关键作用[29, 30]。
图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
对50种瘟病毒株的E2蛋白进行多序列比对，使用CLC Sequence Viewer 8.0进行比对，以BVDV-1a-SD1的E2蛋白作为参考序列。与参考序列相同的残基用点表示。位于实线以上的瘟病毒E2蛋白被单克隆抗体TCH034和TCH052识别，而位于实线以下的残基与这两种单克隆抗体无结合反应。突变后影响单克隆抗体-蛋白结合的残基用黄色框突出显示，而对单克隆抗体结合非必需的残基用红色框标记。
图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。
TCH034和TCH052识别的抗原表位。鉴定单克隆抗体TCH034和TCH052靶向的氨基酸残基。携带定点突变（G113H、K114N、N116G、T118N、G132L、W133A、T134H和G135H）的LPC-E2蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中表达。从培养上清液中收获20微克的每种突变蛋白，进行SDS-PAGE和Western blot分析，以评估其与TCH034和TCH052的结合反应性，同时使用E2特异性单克隆抗体WH303和抗-His单克隆抗体作为对照。结果表明，G113H、K114N、W133A和G135的替换消除了TCH034和TCH052与E2蛋白的结合，表明G113、K114、W133和G135形成了这两种单克隆抗体识别的核心抗原表位。B 使用PyMOL软件生成的抗原表位（G113、K114、W133和G135）的结构模拟。C TCH034和TCH034与CSFV E2蛋白之间的AlphaFold预测结合界面。颜色编码：黄色（单克隆抗体），橙色（表位），绿色（融合肽段）。
为了进一步验证TCH034和TCH052结合E2蛋白的关键抗原表位的保守性，对来自1,335种瘟病毒株的E2蛋白进行了多序列比对，这些瘟病毒株跨越8个不同的物种（CSFV、BVDV1、BVDV2、HobiPeV、BDV、AydinPeV、TSV和ovIT PeV），所有这些病毒株都与这两种单克隆抗体有反应。结果表明，TCH034和TCH052识别的抗原表位内的残基在这些单克隆抗体反应的瘟病毒物种中高度保守（98.6%，1316/1335），除了19个菌株中的113和114位点的氨基酸替换（1.4%，19/1335）。具体来说，在113位点，一个BDV菌株表现出G113V替换。在114位点，7个BDV菌株表现出K114R替换，3个BVDV1菌株，3个BVDV1菌株表现出K114T替换，3个BVDV2菌株表现出K114M替换，3个BVDV2菌株表现出K114N替换。值得注意的是，这些氨基酸替换（G113V、K114R、K114T、K114M和K114N）消除了CSFV JL23 E2蛋白与TCH034/TCH052之间的结合相互作用（附加文件4）。此外，我们观察到携带N114K替换的GPeV菌株H138 E2蛋白与这些单克隆抗体产生了反应性（附加文件4），进一步验证了K114残基对这些单克隆抗体结合瘟病毒E2蛋白的重要性。
为了进一步验证单克隆抗体靶向的表位并探索其对病毒复制的影响，通过CPER[23]恢复了野生型CSFV菌株JL23（亚型2.1b）和携带单个氨基酸替换（K114M、K114N、K114R和K114T）的突变病毒。按照图6A所示的策略，将JL23菌株的全长基因组扩增为六个重叠片段。扩增这些基因组片段后（见图6B），将片段S3亚克隆到pFastBac1载体中，然后使用该载体作为PCR模板将K114M、K114N、K114R和K114T突变引入E2基因。通过Sanger测序验证后，使用序列确认的突变质粒作为模板通过PCR生成了携带目标突变的突变版本片段S3。病毒基因组片段和连接子通过CPER环化，然后将环化产物转染到PK-15和HEK-293 T细胞中。重组病毒感染的细胞连续传代五次，并通过IFA确认了成功的病毒恢复。如图6C所示，在感染了野生型和突变型JL23菌株的细胞中检测到了强烈的荧光信号，这验证了重组病毒re-JL23（野生型）、re-JL23-K114M、re-JL23-K114N、re-JL23-K114R和re-JL23-K114T的成功拯救。对第6代病毒培养物中的E2基因进行Sanger测序后发现，所有重组突变病毒均未携带额外的突变，仅检测到了E2蛋白第114位点上的设计氨基酸替换。这一结果证实了这些重组病毒在PK-15细胞中连续传代过程中的遗传稳定性。为了评估表位突变对病毒复制的影响，将每种重组病毒以0.1的MOI（感染复数）接种到PK-15细胞中。如图6D所示，结果表明，抗原表位中K114残基的突变对病毒复制没有显著影响。值得注意的是，所有突变菌株的病毒传播能力与亲本野生型JL23菌株相当。
图6
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重组表位突变病毒的恢复和表征。一种从CSFV菌株JL23构建全长cDNA克隆的策略。病毒基因组被分割成六个重叠片段（分别标记为S1-S6），以便于分子克隆。B琼脂糖凝胶电泳分析了对应于片段S1-S6、合成连接子和携带K114M、K114N、K114R、K114T替换的个别突变S3片段的PCR扩增产物。C 重组亲本和突变JL23病毒的鉴定。所有重组JL23菌株均通过CPER方法成功拯救，如先前所述[23]。将每种重组病毒的第6代培养物接种到PK-15细胞中，随后通过IFA检测病毒感染。IFA染色中，mAb WH303作为一抗，而Donkey anti-Mouse IgG (H+L) 高度交叉吸附的二抗使用Alexa Fluor™ 488。结果证实了重组亲本病毒和所有突变病毒的成功拯救。D 野生型和突变CSFV JL23菌株的生长动力学。将每种重组JL23菌株以0.1的MOI接种到PK-15细胞中。在12、24、48和72小时时间点收集病毒培养物进行病毒滴度测定。值得注意的是，所有突变JL23菌株的复制动力学与亲本菌株相当，未观察到病毒复制能力的显著差异。
表位突变消除了mAb与表位突变CSFV菌株之间的反应
进行IFA以评估TCH034和TCH052与这些重组突变病毒的反应性，亲本菌株JL23和mAb WH303作为对照。如图7A所示，无论感染亲本病毒还是重组病毒，PK-15细胞在与mAb WH303孵育后均显示绿色荧光，证实所有病毒株均成功感染了PK-15细胞。正如预期的那样，mAb TCH034和TCH052可以与亲本JL23菌株及其非突变重组衍生物发生反应；相比之下，在这些mAb孵育后，感染任何突变病毒的细胞中均未检测到明显的绿色荧光。这些发现表明，E2蛋白中K114残基的突变消除了TCH034和TCH052与复制病毒的反应性。进一步进行了中和试验，以评估TCH034和TCH052中和亲本及重组病毒的能力，使用广谱中和mAb HCL-001（针对CSFV E2蛋白）作为阳性对照[24]。如图7B所示，在用TCH034和TCH052处理后，感染K114突变病毒的PK-15细胞中持续显示出强烈的绿色荧光信号。总体而言，这些结果表明K114突变消除了这两种mAb对突变病毒的中和活性，从而进一步证实K114残基是TCH034和TCH052识别的抗原表位的关键组成部分。
图7
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表位突变消除了mAb TCH034和TCH052与重组突变病毒之间的结合。K114残基的突变消除了TCH034和TCH052与亲本和突变JL23菌株的反应性。将亲本或突变JL23菌株接种到PK-15细胞中并孵育72小时，随后使用mAb TCH034和TCH052作为一抗，通过IFA检测病毒感染，WH303作为阳性对照。IFA结果显示，K114M、K114N、K114R、K114T替换消除了这两种mAb对复制病毒的反应性。B K114残基的突变消除了TCH034和TCH052对重组突变病毒的中和活性。纯化的TCH034或TCH052（每种10 μg）与100 TCID50的亲本或突变JL23菌株孵育1小时，HCL-001作为阳性对照。然后将混合物接种到PK-15细胞中。孵育72小时后，通过IFA评估病毒中和情况。结果表明，携带E2蛋白中K114M、K114N、K114R、K114T突变的重组JL23菌株不能被mAb TCH034和TCH052中和。
讨论
迄今为止，已在pestivirus属中鉴定出19个物种，其中一些感染猪、牛、羊和山羊，并造成重大经济损失，例如CSFV、BVDV1、BVDV2、BVDV3和BDV[7,8,9,10,11]，而其他物种主要来源于野生动物，对家畜的损害较小[1,2,3,4,5]。序列比较表明，CSFV以及感染牛、羊和山羊的pestiviruses在系统发育树中彼此密切相关[图1F]，例如，CSFV菌株与BVDV1、BVDV2、BVDV3、BDV、TSV和ovIT PeV的E2基因具有56.5%-72.8%/54.2%-76.1%的核苷酸和氨基酸序列同源性，而与其他物种的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为37.4%-59.7%/22.7%-57.4%，反映了CSFV和感染牛和羊的pestiviruses在病毒主要抗原E2蛋白上的遗传和抗原相似性，并且这些pestiviruses之间也观察到了交叉中和反应性。然而，家畜致病pestiviruses之间交叉中和反应性的分子基础尚未完全阐明。迄今为止，仅报道了两种针对pestiviruses E2蛋白的广谱中和mAb，它们识别表位P/L709和E713[18, 31]。然而，这两种mAb特异性地识别BDV、GPeV和某些CSFV菌株，但对BVDV（一种广泛存在且高度致病的偶蹄类动物病毒）没有反应性。此外，尽管mAb 4-9D4可以识别多种能够感染偶蹄类动物的Pestivirus属成员，但由于4-9D4识别的表位995YYEP998位于E2蛋白的C末端且靠近病毒包膜，因此未报告其中和能力[19]。在这项研究中，生成了两种针对E2蛋白的广谱pestivirus mAb TCH034和TCH052，发现它们能与感染猪和分蹄反刍动物的8种pestivirus物种发生反应，并且还对各种CSFV、BVDV1和BVDV2菌株具有中和能力。虽然我们的实验室以及中国其他地方都没有BVDV3的细胞适应菌株或羊pestiviruses菌株，但理论上可以从国外实验室获取这些菌株。然而，从国外进口病毒病原体的检疫要求非常严格，使得无法对这些反刍动物pestiviruses进行中和试验。尽管如此，TCH034和TCH052识别的抗原表位在所有CSFV和其他mAb反应的pestiviruses中高度保守。此外，E2蛋白的比较分析显示，CSFV与BVDV3和四种羊pestivirus物种（包括BDV、AydinPeV、TSV和ovIT PeV）具有更密切的进化关系[10, 14,15,16,17]，氨基酸序列同源性范围为61.4%至76.1%，明显高于CSFV与BVDV1-2之间的同源性（53.9%-61.7%）。基于这些发现，我们提出这些mAb也可能能够中和其他感染偶蹄类动物的pestiviruses。因此，本研究的结果首次揭示了CSFV与经济上重要的反刍动物pestiviruses之间的抗原交叉反应性的分子基础，这将有助于阐明pestivirus疫苗的交叉免疫反应机制。
不断有新的反刍动物pestiviruses被发现[32]，因此开发针对所有反刍动物的pestivirus诊断检测方法对于监测、预防和控制pestivirus相关疾病非常重要。此外，商业牛血清的质量因含有各种BVDV及其抗体而显著下降，后者通常被认为是血清中的“污染物”[33]，这严重影响了生命科学研究和疫苗生产的发展，因为CSFV和BVDV在细胞中的复制可能受到pestiviruses及其中和抗体的影响。在这种情况下，使用泛pestivirus检测试剂盒对牛血清产品进行检疫是必要的，但目前市场上没有这样的试剂盒，特别是那些能够检测pestivirus中和抗体的试剂盒。使用泛pestivirus中和mAb TCH034和TCH052，可以开发阻断ELISA和双抗体夹心ELISA分别用于检测pestivirus抗体和抗原。这些检测方法适用于牛血清的检疫和pestivirus的流行病学监测。如果在牛血清中检测到pestivirus抗体，可以使用针对BVDV1、BVDV2甚至BDV的特异性抗体检测 kit或方法进行后续准确诊断。泛pestivirus抗原检测kit能够筛查与TCH034和TCH052识别的相关的重要和新兴pestivirus。然后可以使用pestivirus特异性检测方法或kit进行后续测试，以确定具体的病毒种类，从而避免对每个样本进行单独检测。这种策略显著减少了与pestivirus检测相关的时间和经济成本。此外，广谱mAb识别的保守中和抗原表位被认为是开发泛pestivirus疫苗的潜在目标。因此，本研究中获得的pestivirus广谱mAb具有广泛的应用潜力。
根据IFA结果，TCH034与pestiviruses结合的荧光强度高于TCH052。然而，TCH034和TCH052对pestiviruses（CSFV和BVDV）的中和效力与其各自的荧光强度无关。在某些情况下，TCH052表现出更强的中和活性，表明这些mAb的结合亲和力与其中和能力并不一致。此前也有报道指出，针对SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体也存在类似的情况[34]。此外，尽管对这些mAb有反应的pestiviruses之间的抗原表位高度保守，但TCH034和TCH052对不同的CSFV和BVDV菌株的中和能力各不相同。这两种mAb的显著不同的结合亲和力和中和效力可能归因于它们氨基酸序列的显著差异。序列比对分析显示，TCH034和TCH052在轻链的互补决定区1、2和3（CDR1、CDR2、CDR3）的8/11、1/3和5/10位置，以及重链的CDR1、CDR2和CDR3的5/8、2/8和9/15位置存在氨基酸变异。值得注意的是，我们观察到一种无法解释的现象：TCH034对E2蛋白衍生的CSFV减毒疫苗株LPC的中和效力极低，但它能有效中和其他CSFV野外分离株，包括与LPC密切相关的SM株。相比之下，TCH052能够中和所有测试的CSFV菌株，包括疫苗株LPC和HCLV以及所有分析的野外分离株。为了解决上述问题，未来应全面研究TCH034和TCH052的生物学特性以及这些mAb与pestiviruses之间相互作用的分子机制。
据报道，CSFV E2蛋白包含两个融合肽（FPs），它们对病毒复制至关重要，这两个FP分别位于E2蛋白的129CPIGWTGVIEC139和180CKWGGNWTCV189位置[29, 30]。通过AlphaFold2对接发现，抗体结合E2蛋白后这两个FP无法完全显示，这可能干扰了病毒-细胞膜融合，这种机制可能是这两种广谱pestivirus mAb的中和活性的基础，应通过阐明mAb-E2蛋白复合物的结构来验证这一点。此外，通过观察抗体（mAbs）与病毒表面蛋白（FPs）上的特定残基结合后病毒被中和的现象，可以进一步证实病毒表面蛋白在介导病毒进入宿主细胞过程中的关键作用。这种观察结果为相关理论提供了独立的验证依据。
