摘要
科里鹱（Calonectris borealis）是一种属于鹱科（Procellariidae）的候鸟，广泛分布于大西洋海域。它在亚速尔群岛、马德拉群岛、加那利群岛和贝尔伦加斯群岛繁殖，冬季则迁徙至南美洲和非洲的沿海地区。这种鸟类广泛的栖息地范围促进了病原体在全球范围内的传播。Plasmodium是一种引起禽疟疾的顶复门（Apicomplexa）寄生虫，影响着全球许多野生鸟类。尽管在海洋鸟类中较为罕见，但Plasmodium感染仍可能对它们造成严重影响。在巴西圣保罗北部海岸，研究人员通过桑托斯盆地海滩监测项目（PMP-BS）的日常监测活动，发现并鉴定了一种新的Plasmodium物种。该鸟类被救助并接受了61天的康复治疗，但由于病情恶化最终被实施安乐死。血液涂片显示寄生虫感染率在0.04%至2.09%之间。研究人员使用针对细胞色素b（cytb）基因片段的PCR技术对血液和组织样本进行了检测，所得序列与Plasmodium的plK06谱系100%相同。系统发育分析表明该寄生虫属于Novyella分支，其形态特征与P. vaughani密切相关。尸检结果显示肝脏和脾脏肿大，组织病理学检查证实存在肝炎和肺出血。这些发现，加上尽管接受了抗疟疾治疗但仍出现临床症状复发的情况，表明该寄生虫对科里鹱具有致病性。这是首次在科里鹱中发现血孢子虫感染，也是首次在鹱形目（Procellariiformes）中鉴定出plK06谱系，因此首次描述了Plasmodium borealis新种。这些发现扩展了人们对海洋鸟类寄生虫多样性的认识，并强调了继续监测这些研究不足的鸟类群体的必要性。
引言
科里鹱（Calonectris borealis）是一种属于鹱科（Procellariidae）的候鸟，广泛分布于大西洋海域。它在亚速尔群岛、马德拉群岛、加那利群岛和贝尔伦加斯群岛繁殖，冬季则迁徙至南美洲和非洲的沿海地区。这种鸟类广泛的栖息地范围促进了病原体在全球范围内的传播。Plasmodium是一种引起禽疟疾的顶复门（Apicomplexa）寄生虫，影响着全球许多野生鸟类。尽管在海洋鸟类中较为罕见，但Plasmodium感染仍可能对它们造成严重影响。在巴西圣保罗北部海岸，研究人员通过桑托斯盆地海滩监测项目（PMP-BS）的日常监测活动，发现并鉴定了一种新的Plasmodium物种。该鸟类被救助并接受了61天的康复治疗，但由于病情恶化最终被实施安乐死。血液涂片显示寄生虫感染率在0.04%至2.09%之间。研究人员使用针对细胞色素b（cytb）基因片段的PCR技术对血液和组织样本进行了检测，所得序列与Plasmodium的plK06谱系100%相同。系统发育分析表明该寄生虫属于Novyella分支，其形态特征与P. vaughani密切相关。尸检结果显示肝脏和脾脏肿大，组织病理学检查证实存在肝炎和肺出血。这些发现，加上尽管接受了抗疟疾治疗但仍出现临床症状复发的情况，表明该寄生虫对科里鹱具有致病性。这是首次在科里鹱中发现血孢子虫感染，也是首次在鹱形目（Procellariiformes）中鉴定出plK06谱系，因此首次描述了Plasmodium borealis新种。这些发现扩展了人们对海洋鸟类寄生虫多样性的认识，并强调了继续监测这些研究不足的鸟类群体的必要性。
科里鹱（Calonectris borealis）是一种属于鹱科（Procellariidae）的候鸟，广泛分布于大西洋海域。它在亚速尔群岛、马德拉群岛、加那利群岛和贝尔伦加斯群岛繁殖，冬季则迁徙至南美洲和非洲的沿海地区。这种鸟类广泛的栖息地范围促进了病原体在全球范围内的传播。Plasmodium是一种引起禽疟疾的顶复门（Apicomplexa）寄生虫，影响着全球许多野生鸟类。尽管在海洋鸟类中较为罕见，但Plasmodium感染仍可能对它们造成严重影响。在巴西圣保罗北部海岸，研究人员通过桑托斯盆地海滩监测项目（PMP-BS）的日常监测活动，发现并鉴定了一种新的Plasmodium物种。该鸟类被救助并接受了61天的康复治疗，但由于病情恶化最终被实施安乐死。血液涂片显示寄生虫感染率在0.04%至2.09%之间。研究人员使用针对细胞色素b（cytb）基因片段的PCR技术对血液和组织样本进行了检测，所得序列与Plasmodium的plK06谱系100%相同。系统发育分析表明该寄生虫属于Novyella分支，其形态特征与P. vaughani密切相关。尸检结果显示肝脏和脾脏肿大，组织病理学检查证实存在肝炎和肺出血。这些发现，加上尽管接受了抗疟疾治疗但仍出现临床症状复发的情况，表明该寄生虫对科里鹱具有致病性。这是首次在科里鹱中发现血孢子虫感染，也是首次在鹱形目（Procellariiformes）中鉴定出plK06谱系，因此首次描述了Plasmodium borealis新种。这些发现扩展了人们对海洋鸟类寄生虫多样性的认识，并强调了继续监测这些研究不足的鸟类群体的必要性。
引言
科里鹱（Calonectris borealis）是一种属于鹱科（Procellariidae）的候鸟，广泛分布于大西洋海域，主要在亚速尔群岛、马德拉群岛、加那利群岛和贝尔伦加斯群岛繁殖。冬季时，它们会迁徙到南大西洋地区，特别是巴西、乌拉圭和阿根廷的沿海地带，以及非洲西部的一些地区（Camphuysen & Van Der Meer, 2001; González-Solís et al., 2007; Somenzari et al., 2018; Pacheco et al., 2021; del Hoyo et al., 2024）。与不迁徙或短距离迁徙的鸟类相比，长距离迁徙的海洋鸟类更有可能促进病原体（如细菌、病毒和真核寄生虫）的全球传播（Dietrich et al., 2011; McCoy et al., 2016; Boulinier et al., 2016），因此它们成为研究病原体分布的理想模型生物。
一般来说，像科里鹱这样的长距离迁徙鸟类对某些寄生虫具有抵抗力；然而，它们的健康状况受到生态压力（如捕食和污染）的影响。此外，大约90%的海洋鸟类会吞食塑料，这进一步损害了它们的健康，并成为影响寄生虫动态的环境压力因素（Rodríguez et al., 2024）。Plasmodium属（顶复门：血孢子虫目）寄生虫通过蚊子（双翅目：库蚊科）传播，是导致禽类、哺乳动物和爬行动物疟疾的病原体（Garnham, 1966; Valkiūnas, 2005; Santiago-Alarcon et al., 2012）。这类寄生虫是全球分布的异宿主原生生物，影响着多种野生鸟类（Clark et al., 2014）。迄今为止已描述了近60种禽类Plasmodium物种，它们在地理分布、致病性和宿主特异性方面存在显著差异（Valkiūnas & Iezhova, 2018; Platonova et al., 2021; Vieira et al., 2025; Alves et al., 2026）。由于气候变化，Plasmodium向更高纬度地区的扩散（如北极）对未受感染的鸟类种群构成了威胁。这种扩散可能导致以前没有禽疟疾的地区出现新的疫情（Loiseau et al., 2012），同时也可能在新宿主体内发现不同的寄生虫谱系。
虽然这些寄生虫对家禽、圈养鸟类和陆地鸟类的影响已得到较为充分的研究（Khan et al., 2019），但对海洋鸟类的研究仍然有限（Khan et al., 2019）。大多数研究集中在欧洲和非洲，仅提供了关于这些鸟类群体中血孢子虫感染的有限证据（Quillfeldt et al., 2010; Hervías et al., 2013; Campioni et al., 2018）。在鹱形目中，关于血孢子虫的研究很少（Warner, 1968; Quillfeldt et al., 2010; Campioni et al., 2018; Vanstreels et al., 2020; Ilahiane et al., 2022; Bennett et al., 2024; Machado et al., 2025），且迄今为止仅报道了Plasmodium寄生虫（Sgarioni et al., 2024）。此外，MalAvi数据库（目前可访问地址：https://tavimalara.shinyapps.io/malavi_tables/，访问日期：2025年3月31日）中尚未记录任何与C. borealis相关的血孢子虫谱系，这凸显了对该鸟类研究存在的全球性空白。总体而言，关于海洋鸟类中血孢子虫感染率的数据仍然十分匮乏（Warner, 1968; Quillfeldt et al., 2010; Vanstreels et al., 2014; Campioni et al., 2018; Kleinschmidt et al., 2022; Sgarioni et al., 2024）。
因此，本研究旨在对在巴西圣保罗北部海岸发现的感染科里鹱（C. borealis）的新Plasmodium物种进行分子和形态学鉴定，并阐述与此感染相关的临床病理学发现。通过系统发育重建确定了该新物种与先前描述的Plasmodium寄生虫之间的进化关系。在每次PCR实验中，同时进行了阳性对照实验，这些对照实验使用了Plasmodium (Novyella) nucleophilum（谱系DENPET03）、Haemoproteus (Parahaemoproteus) nucleocentralis（谱系TANDES01）或Leucocytozoon sp.（谱系ELAALB05）的DNA作为模板，超纯水作为阴性对照。此外，所有在第一次PCR中呈阳性的样本都被提交给第二次PCR实验，以扩增更长的cytb片段（1131 bp）。第一轮PCR使用引物DW2和DW4进行，以2 µL（50 ng）的gDNA作为模板。对于第二轮嵌套反应，使用1 µL的第一轮PCR产物作为模板，并使用引物DW1和DW6进行反应。为了测序，还使用了一对内部引物（DW3和DW8）（Perkins & Schall, 2002）。考虑到入院时发现的球虫阳性结果，还进行了一项针对Conoidasida类寄生虫的PCR实验，以扩增约1035 bp的18S rRNA基因片段。第一次PCR使用引物Cocc18S_n1F和Cocc18S_n1R进行，以2 µL（50 ng）的gDNA作为模板。对于嵌套PCR反应，使用每个样本的第一轮PCR产物1 µL作为DNA模板，并使用引物Cocc18S_n2F和Cocc18S_n2R进行反应。测序时使用的是嵌套反应中的引物（Chagas et al., 2021b）。在每次PCR实验中，还同时进行了含有Isospora sp.或Hepatozoon caimani DNA的阳性对照实验，超纯水作为阴性对照。
PCR扩增产物通过在1%琼脂糖凝胶（Invitrogen®）上使用分子标记（1 Kb Plus DNA Ladder™, Invitrogen®）进行电泳来可视化，电泳条件为90 V，时间为40分钟。DNA条带用GelRed™（Biotium®）标记，并在紫外透射光下观察。
阳性PCR产物使用Sanger方法进行测序，使用的试剂盒为BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems®, Carlsbad, CA, USA）。测序是在ABI PRISM® 3500 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, USA）上进行的，该仪器是热带医学研究所的多用户设备。热循环条件包括一个96 °C的初始步骤，持续1分钟，随后是30个循环：96 °C 15秒、50 °C 15秒和60 °C 4秒。两条链都被测序，序列使用SeqMan软件（DNASTAR Lasergene，版本7.0.0）进行校正和对齐，以生成共识序列。通过使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）算法和MalAvi（Bensch et al., 2009）及GenBank数据库将共识序列与参考序列进行比对，从而鉴定寄生虫的谱系。
系统发育分析使用来自MalAvi数据库的一组血孢子虫cytb序列进行（目前可访问地址为https://tavimalara.shinyapps.io/malavi_tables/，访问日期为2024年4月11日）。我们包括了GenBank中存储的29个Plasmodium谱系，以及本研究中获得的序列（GenBank PX712888，479 bp）。系统发育树以Haemoproteus属的四个谱系和Leucocytozoon sp.谱系ISIKIN2作为根节点构建。比对使用MEGA 12：Molecular Evolutionary Genetics Analysis程序（Kumar et al., 2018）进行。贝叶斯推断使用MrBayes软件v.3.2（Ronquist et al., 2012）进行，模型采用MrModeltest 2.2（Nylander, 2004）推荐的GTR+G+I模型（软件可从https://github.com/nylander/MrModeltest2获取）。分析过程中运行了两个马尔可夫链，每个链运行200万代。前25%的树被丢弃作为燃烧期，剩余的树用于计算后验概率。所有分析得到的系统发育树使用FigTree v. 1.4.0（Rambaut, 2006）和Inkscape v1.3.2进行可视化和编辑。
**显微镜检查和PCR结果**
2024年1月至3月期间收集的C. borealis血液涂片检查显示，在九个采样日期中有五个日期存在形态上类似于Plasmodium spp.的红细胞内寄生虫。而在PCR分析中，九个样本中有三个呈阳性（见表2）。在1月27日的入院血液检查中，血液涂片分析显示所有Plasmodium spp.的发育阶段，寄生虫载量为1.16%。
**后续的显微镜检查**
2月11日的检查显示寄生虫载量降至0.04%。这些寄生虫被鉴定为Plasmodium物种，其属通过PCR得到确认。2月21日、2月28日、3月5日和3月9日的后续检查显示血液涂片中没有寄生虫。3月25日观察到复发，平均寄生虫载量为2.09%。3月26日对动物实施了安乐死，并在死后制备了血液涂片，显示寄生虫载量较低（1.32%）。这些数据的总结见表2。
**PCR结果**
针对血孢子虫的PCR确认了Plasmodium spp.的存在，获得的序列与谱系pLK06的相似度为100%。同样的序列也在EDTA中的血液、FTA卡中的血液以及所有检测器官（脾脏、大脑、心脏、肝脏、骨髓、骨骼肌、胰腺、肺和肾脏）中被检测到。此外，针对球虫的PCR也确认了EDTA中的血液、FTA卡和肺中存在Plasmodium spp.。然而，由于该序列扩增的是18S基因的片段，而血孢子虫的条形码区域位于cytb上，因此无法确定具体的谱系。BLAST结果显示，cytb和18S序列与Plasmodium vaughani的相似度约为95%。
**治疗前后的形态特征**
在治疗期间制备的血液涂片进行详细形态学分析时发现，尽管这种寄生虫与P. vaughani关系密切，但它具有一些不同的特征，使我们能够描述一个新的Plasmodium物种，并将其归类为谱系pLK06。
**Plasmodium (Novyella) borealis sp. nov. 的描述**
**分类学概述**
超门：Alveolata Cavalier-Smith, 1991
门：Apicomplexa Levine, 1970
亚门：Sporozoa Leuckart, 1879
纲：Coccidea Leuckart, 1879
目：Haemosporida Danilewsky, 1885
科：Plasmodiidae Mesnil, 1903
属：Plasmodium Marchiafava & Celli, 1885
亚属：Novyella Corraetti, Garnham & Laird, 1963
宿主类型：Cory’s Shearwater Calonectris borealis（Cory）（Procellariiformes, Procellariidae）
模式产地：巴西圣保罗州Ubatuba的Toninhas海滩（23°28.902′ S, 45°04.343′ W）
模式标本：正模标本（编号IA16278，成年雄性Calonectris borealis，寄生虫载量2.09%，2024年3月25日，Giemsa染色血液涂片，Toninhas海滩，Ubatuba，巴西）存放在巴西Ubatuba的Instituto Argonauta para a Conservação Costeira e Marinha。副模标本（编号IA16278_1, IA16278_2，其他数据与正模标本相同）存放在Instituto Pasteur。
感染部位：成熟红细胞；无其他数据。
流行率：未知。一个被检查的Cory’s Shearwater（IA16278）被感染。
代表性DNA序列：线粒体cytb谱系pLK06（479 bp，GenBank编号PX712888；1131 bp，GenBank编号PZ273748）；小亚基核糖体RNA基因谱系pLK06（830 bp，GenBank编号PZ297969）。
分布：谱系pLK06已在欧洲和非洲的十个科和18个物种中的鸟类中发现，包括迁徙性和定居性的Falconiformes和Passeriformes目物种。这是首次在南美洲的Calonectris borealis（Procellariformes）中报告该谱系（表3）。
**ZooBank注册**：新物种P. borealis sp. nov.的生命周期标识符（LSID）为urn:lsid:zoobank.org:pub:C1B4F877-3AD0-42D8-96F7-D20D7231BFE1。
**词源**：物种名称指的是发现该寄生虫的宿主物种Cory’s Shearwater Calonectris borealis。
**描述**
**滋养体（图2a-e）**存在于成熟红细胞中；形状多样，但轮廓大多均匀（图2b, c）；含有丰富的细胞质（图2b, d, e）；通常位于感染红细胞的极部或亚极部（图2a-c, e），偶尔也位于侧面（图2d）；不附着在感染红细胞的核上；主要含有一个（图2b）或两个（图2a）小色素颗粒；滋养体对感染红细胞的影响不明显。
**图2**
该图像的替代文本可能是通过AI生成的。
**Plasmodium (Novyella) borealis sp. nov.（cytochrome b谱系pLK06）**来自Cory’s Shearwater Calonectris borealis（IA16278）的血液。滋养体（a-e）、红细胞内裂殖子（f-o）、大配子细胞（p-t）和小配子细胞（u-y）。注意扇形裂殖子（m-o）、折射小球（l）、裂殖子中稀少的（几乎看不见的）细胞质（h, j, k-o）以及大配子细胞中的液泡（p-r）。简单宽箭头：感染红细胞的核；三角形箭头：裂殖子；简单长箭头：折射小球；简单箭头：色素颗粒；短简单箭头：液泡；长三角形箭头：寄生虫核；短三角形箭头：配子细胞与红细胞核之间的空隙。甲醇固定，Giemsa染色薄血涂片。比例尺：10 µm。所有图像均来自正模标本。
**红细胞内裂殖子（图2e-o）**仅存在于成熟红细胞中；年轻裂殖子的细胞质较少，通常呈现淡蓝色，在成熟裂殖子中难以观察到（图2f-o）；裂殖子通常自由存在于细胞质中，但有时会轻微接触感染红细胞的核（图2k, l, m）；裂殖子可以位于红细胞的任何位置，包括极部（图2j, o）、亚极部（图2i, k-o）或侧面（图2f）；大多数完全成熟的裂殖子呈扇形，裂殖子位于边缘（图2m-o），但有些形状不规则，裂殖子分布随机（图2h, l）；成熟裂殖子含有四个（图2j）到十个（图2m, o）裂殖子（通常为5到7个）；裂殖体含有一个或两个中等大小的（0.5 – 0.7µm）色素颗粒（图2g, m），有时会看到两个相同大小的色素颗粒（图2n, o）；色素颗粒通常紧密附着在折射小球上（图2h, i, j, n）；寄生虫对感染红细胞的影响不明显。
**大配子细胞（图2p-t）**仅存在于成熟红细胞中；细胞质呈颗粒状（图2s, t）；轮廓略不规则（图2q, r）；年轻和成熟的配子细胞呈细长状，位于感染红细胞的侧面，通常不接触宿主细胞核，但会接触宿主细胞的膜（图2p-t）；色素颗粒数量从四个到九个不等，呈圆形，中等大小（0.5 – 1.0 µm），分布分散（图2q, r），但有时会在寄生虫边缘聚集（图2p, t）；完全成熟的配子细胞大小超过宿主细胞核，长度不超过13.3 µm，宽度不超过3 µm（表4）。
**小配子细胞（图2u-y）**具有与大配子细胞相似的一般结构和特征，也具有血孢子虫的典型两性异形特征；通常在寄生虫细胞质中散布着更多的色素颗粒（表4），与大配子细胞相比；它们可能会略微变形宿主细胞的核（图2x, w）（表4）。
**备注**
在鸟类疟疾寄生虫中，P. borealis sp. nov. pLK06的血液阶段与P. vaughani pSYAT05最为相似，两者都属于Novyella亚属，部分cytb基因的遗传距离为5%。P. borealis sp. nov. pLK06可以通过其成熟的红细胞内裂殖子来区分，这些裂殖子呈扇形排列，含有9-10个裂殖子（图2, m-o）；而P. vaughani中不存在这种裂殖子。此外，P. borealis sp. nov. pLK06含有四个到十个（通常为5到7个）裂殖子，而P. vaughani pSYAT05产生四个到八个（通常为六个）裂殖子。关于成熟裂殖子中的色素颗粒，新物种的色素颗粒大小为中等（0.5 – 0.7 µm），通常含有一个（图2i, l, m），有时也有两个（图2g, o），当有两个颗粒时，它们的大小大致相同。相比之下，P. vaughani pSYAT05的成熟裂殖体含有一个到三个小色素颗粒（<0.5 µm），且大小不一致。**P. borealis sp. nov. pLK06的巨配子细胞的细胞质呈颗粒状（图2s, t），而P. vaughani pSYAT05的细胞质则主要呈均匀状态。P. borealis sp. nov. pLK06的巨配子细胞中含有4到10个色素颗粒；P. vaughani pSYAT05的色素颗粒数量变化较大，可能在2到24个之间（Valkiūnas, 2005; Zehtindjiev et al., 2012; Valkiūnas & Iezhova, 2018）。P. borealis sp. nov. pLK06还需与几种其他在美洲常见的Novyella物种区分开来，这些物种具有相似的血液阶段，并且在基因上与之密切相关，包括Plasmodium homopolare pBAEBIC02、Plasmodium unalis pTFUS06、Plasmodium hexamerium pALEDIA02和Plasmodium parahexamerium pALDI1。在鉴定这些寄生虫物种时，以下血液阶段的特征特别有帮助：**P. homopolare pBAEBIC02的成熟裂殖子在受感染的红细胞中通常位于极点或亚极点位置，而P. borealis sp. nov. pLK06的裂殖子则可以出现在细胞的任何位置，包括极点（图2h, o）、亚极点（图2j, k, m-o）或侧面（图2f）。P. homopolare的完全成熟的配子细胞既附着在红细胞核上又附着在红细胞膜上，并且会充满红细胞的各个极点（Walther et al., 2014）；这些特征在P. borealis sp. nov. pLK06中并不存在。这两种寄生虫谱系之间的遗传距离为4.2%。P. borealis sp. nov. pLK06的成熟裂殖子位置变化较大，而P. unalis pTFUS06的成熟裂殖子则主要呈扇形分布。此外，P. borealis sp. nov.的成熟裂殖子通常含有两个色素颗粒（图2g, o），而P. unalis的相应血液阶段仅含有一个色素颗粒（Mantilla et al., 2013）。P. borealis sp. nov. pLK06可以通过其在红细胞裂殖子中的裂殖子数量与P. parahexamerium pALEDIA02（遗传距离为4%）和P. hexamerium pALDI1（遗传距离为4.1%）区分开来。****
**系统发育分析**显示，P. borealis sp. nov.在部分cytb基因上与P. hexamerium pALDI1（遗传距离为4.1%）、P. parahexamerium pALEDIA02（4%）、P. unalis pTFUS06（5%）、P. vaughani pSYAT05（5%）和P. homopolare pBAEBIC02（4.2%）密切相关。然而，该新物种的血液阶段形态特征与P. vaughani最为相似。在系统发育推断中，所有这些寄生虫都聚集在一个得到良好支持的支系中，与新物种一起属于Plasmodium（Novyella）家族，新物种被置于一个单独的分支上（图3）。
**图3**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
**基于479 bp线粒体基因cytochrome b（cytb）的贝叶斯分析推断出的系统发育树，涵盖了代表性的鸟类血液孢子虫物种。本研究中获得的序列以粗体和紫色突出显示。使用了五个Haemoproteus谱系和一个Leucocytozoon谱系作为外群。节点的支持值（以百分比表示）表示后验概率。**谱系pLK06在非洲和欧洲的Falconiformes和Passeriformes鸟类中被报道；这些鸟类属于十个科（Falconidae、Alaudidae、Fringillidae、Hirundinidae、Motacillidae、Muscicapidae、Paridae、Phylloscopidae、Sylviidae和Turdidae）以及18种鸟类（表3）。最常见的宿主包括非洲蓝山雀Cyanistes teneriffae、眼镜莺Curruca conspicillata和Berthelot's pipit Anthus berthelotii，这些都是非洲和欧洲的常住物种（MalAvi数据库，当前可访问地址：https://tavimalara.shinyapps.io/malavi_tables/，访问日期：2025年7月11日）。
**粪便检查、血液学和血液生化结果**
入院后前三天进行的粪便检查（1月25日至27日的混合样本）显示中度寄生虫负担（类似肠球菌寄生虫的卵囊）。入院时的血象（1月27日）显示低色素性小红细胞贫血，伴有明显的多形性和异形性，以及血液涂片中的中度红细胞血液寄生虫负担（后来通过PCR确认为Plasmodium spp.，见表2）。生化检测显示AST轻度升高（382 U/L）和轻度低白蛋白血症（0.7 g/dL）（表5）。抗寄生虫治疗（Toltrazuril 5%，7mg/kg，每日一次，共3天）后的控制粪便检查（2月6日至8日的混合样本）结果为阴性。
**2月11日，贫血持续存在，AST轻度升高（648 U/L），钙磷比值增加（5.4），低磷血症（1.8 mg/dL），白细胞增多（14630 U/L）和单核细胞增多（877.8 U/L）（表5）。2月21日，血液分析显示贫血持续，AST略有下降但仍偏高（335 U/L），高钙磷比值持续（5.7），异形性减轻。2月28日，多形性中度减轻但仍异常，钙磷比值（3.2），LDH升高（307 U/L），尿酸降低（2.3 mg/dL），AST升高（424 U/L）和低血糖（178 g/dL）（表5）。3月25日（安乐死前一天），血液涂片分析显示寄生虫负荷为2.09%，表明尽管接受了治疗，疟疾仍复发。肾脏（尿酸 – 3.9 mg/dL）和肝酶（AST – 251 U/L）仍异常（表5）。
**放射学检查**
2月16日进行的X光检查显示两个肾脏的放射密度增加，肺泡模式和锁骨气囊的放射密度增加（提示感染过程）。2月28日的对照X光检查显示气囊有所改善；然而，肺泡模式仍然存在。肾脏放射密度显著增加和肝肿大被观察到。
**大体病理学和组织病理学发现**
大体上，观察到弥漫性严重脾肿大、轻度至中度弥漫性肝肿大、肝脏局灶性出血和肺部出血（图4a）。口咽部黏膜（腭部）有两个约0.2厘米的黄色病变。腹腔内观察到大量脂肪组织（体重785克）（图4b）。腹侧视图（图4c）显示肺部原位轻度至中度多灶性出血，背侧视图显示广泛的多灶性出血区域（图4d）。组织病理学显示慢性肝炎，特征为中度多灶性淋巴细胞浸润；明显的支气管周围局灶性出血和中度多灶性充血，以及口咽部的轻度局灶性炎性异嗜性浸润和血清细胞结痂，伴有细菌存在。发育良好的生精小管具有多细胞壁和含有精子的腔，证实该个体为性成熟个体。泄殖腔、心脏、大肠和小肠、肌肉、甲状腺和甲状旁腺、皮肤、胸腺、胰腺、肾脏和前胃未观察到病变。
**讨论**
海鸟（包括Procellariiformes）中的Plasmodium感染虽然罕见，但可能严重影响宿主健康和种群动态。该标本的临床病理学发现与先前的报道一致（Vanstreels et al., 2014, 2015），禽类疟疾常导致行为和生理功能障碍，表现为嗜睡、厌食、生长迟缓、粪便呈绿色、呼吸困难，有时甚至死亡（Sorci & Møller, 1997; Atkinson, 2008; Schoenle et al., 2017）。尽管在某些情况下鸟类无症状，但严重感染可能导致肝肿大伴坏死、脂肪肝、脾肿大、心包积液、肾炎、肺水肿、脑毛细血管阻塞或出血性结膜炎，症状严重程度因宿主-寄生虫组合和感染阶段而异，从轻微症状到高死亡率都有（Williams, 2005; Dinhopl et al., 2015; Ilgūnas et al., 2016; Atkinson et al., 1995; Atkinson, 2008; Palinauskas et al., 2008, 2011; Howe et al., 2012; Vanstreels et al., 2014, 2015）。在本研究中，尽管有间歇性的体重波动、呼吸困难发作和食欲不振，受感染的C. borealis在康复期间营养状况和贫血有所改善。然而，尽管接受了治疗，疟疾仍复发，最终因身体状况脆弱和预后不良而实施安乐死，X光、血液学和生化检查显示肾脏和肝脏有后遗症。**
**入院时，该个体的寄生虫负荷相对较高（1.16%），随后几天下降（0.81%），治疗开始后继续下降（0.04%），最终几乎一个月内无法检测到寄生虫。然而，在治疗34天后，寄生虫负荷再次升高（2.09%）。关于禽类疟疾治疗的报道很少，成功率存在争议；即使联合使用氯喹（针对红细胞裂殖子）和伯氨喹（针对导致复发的红细胞外阶段）也不能保证治愈，死亡率通常很高（Stoskopf & Beier, 1979; Remple, 2004; Bueno et al., 2010; Vanstreels and Parsons, 2014; Vanstreels et al., 2019）。值得注意的是，该鸟类仅接受了氯喹治疗，因为伯氨喹在巴西仅用于人类疟疾的治疗，这使得复发是可以预见的（Vanstreels et al., 2014）。死后血液涂片中的较低寄生虫负荷（1.32%）可能是由于死亡后血液粘度和凝固增加导致样本质量较差。实际上，死后涂片不适合进行详细的寄生虫形态分析，因为死亡引起的变化会扭曲寄生虫形态和感染强度。**
**在治疗前后收集了血液涂片。关于人类和啮齿动物疟疾的研究报告称，在给药后几小时内就会出现配子细胞形态变化（Sachanonta et al., 2011; Dechy-Cabaret & Benoit-Vical, 2012），类似的效应也被认为存在于禽类疟疾中（Vanstreels et al., 2014, 2019）。然而，目前尚无关于禽类的详细研究，之前的报道仅限于给药后几小时到一天的效果。在本研究中，形态学变化是在治疗一个月后评估的；使用该方案前后未观察到血液阶段的形态差异（见图2和补充图1）。**所有针对cytb血孢子虫条形码片段的PCR检测在血液样本和器官中均呈阳性，表明为Plasmodium sp. pLK06，这与P. vaughani pSYAT05密切相关。使用针对18S基因的球虫引物获得的序列也与P. vaughani pSYAT05密切相关。有趣的是，这些引物最初是为诊断禽类Lankesterella及相关寄生虫设计的（Chagas et al., 2021b）。该协议已被广泛用于诊断禽类Lankesterella和Isospora寄生虫，但从未报道过它能扩增Plasmodium或其他血孢子虫DNA（Chagas et al., 2021a, b; Keckeisen et al., 2024）。这强调了进行测序的重要性，而不仅仅依赖PCR扩增。然而，由于野外共感染多种寄生虫的情况较为常见，因此研究禽类Lankesterella的研究人员也应注意血孢子虫也可能被扩增，尽管可能性较低。**
**像普通燕鸥（Sterna hirundo）和Cory's shearwater这样的海鸟，其血孢子虫感染率极低，这可能是由于生态和生物学因素的影响（Khan et al., 2019）。例如，普通燕鸥的感染率为3.6%（Capasso et al., 2023），而Cory's shearwater则没有感染（Campioni et al., 2018）。这种模式可能源于它们独特的海洋生态位，缺乏合适的传播媒介，正如海洋栖息地中Plasmodium的普遍缺乏所显示的（Warner, 1968; Valkiūnas, 2005; Merino et al., 2012; Bastien et al., 2014; Campioni et al., 2018; Vanstreels et al., 2020）。尽管如此，海鸟在以陆地和鸣禽为主的血孢子虫调查中仍然被忽视（Quillfeldt et al., 2010; Sgarioni et al., 2024）。**Plasmodium对海鸟的影响可能非常严重，尤其是在初次感染的种群中（Gulliver et al., 2022），但气候变化、栖息地丧失和入侵物种的引入等更广泛的因素增加了传播风险，因此需要密切监测（Vanstreels et al., 2014）。此外，疟原虫（Plasmodium）的低宿主特异性使其能够感染亲缘关系较远的鸟类，这削弱了宿主身份作为可靠分类特征的作用，并使得在意外发现的野生动物宿主体内进行物种鉴定变得复杂（Garnham, 1966, 1980; Valkiūnas & Ashford, 2002; Valkiūnas & Iezhova, 2018）。在本研究中，我们首次记录了北极鹱（Calonectris borealis）感染血孢子虫的病例。通过形态学和分子分析，我们确认了这种寄生虫为Plasmodium (Novyella) borealis sp. nov. pLK06，这也是该寄生虫谱系在巴西的首次报道。北极鹱广泛的地理分布和迁徙行为促进了病原体在不同地区之间的传播，因此研究这一鸟类群体中未被充分报道的感染性病原体显得尤为重要。PLK06谱系已在欧洲（西班牙、葡萄牙和瑞典）和非洲（摩洛哥和佛得角）被发现，感染了雀形目（Passeriformes）和隼形目（Falconiformes）鸟类，这也是该谱系在巴西的首次记录。
关于鹱形目（Procellariformes）鸟类的疟疾感染记录，文献中仅提到了少数案例：一种Plasmodium circumflexum（pSW5）感染了日本的白纹鹱（Calonectris leucomelas）（Inumaru et al., 2017）；一种Plasmodium sp.感染了美国的加拉帕戈斯鹱（Pterodroma phaeopygia）（Warner, 1968）；一种Plasmodium cathemerium（pPADOM09）感染了巴西的马恩岛鹱（Puffinus puffinus）（Vanstreels et al., 2020）；一种Plasmodium relictum（pSGS1）感染了英国福克兰群岛的细嘴鹱（Pachyptila belcheri）（Quillfeldt et al., 2010）；以及一种Plasmodium matutinum（pLINN1）感染了新西兰的西氏鹱（Procellaria westlandica）（Bennett et al., 2024）。
总之，本研究扩展了人们对海鸟中疟原虫存在的认识，将北极鹱（Calonectris borealis）确定为PLK06谱系的新宿主。我们描述了一种新的疟疾寄生虫物种——Plasmodium borealis sp. nov.，并阐述了该寄生虫感染在该宿主体内的临床表现和病理变化。与亲缘关系较近的形态种相比，PLK06在细胞色素b基因上的遗传差异约为5%，这支持了将其认定为新物种的观点。尽管在这一寄生虫群体内的物种界定仍存在挑战（Outlaw and Ricklefs, 2014），但这些特征为识别PLK06为独立物种提供了依据。了解这种寄生虫的致病效应对于评估其对迁徙鸟类种群的影响至关重要，因此进一步研究其在鸟类宿主体内的分布及其后果显得十分重要。
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