摘要
沙门氏菌肠炎血清型Typhimurium菌株YB1是一种经过基因工程改造的专性厌氧菌，具有很强的肿瘤靶向潜力。在本研究中，我们评估了YB1作为Laz（一种脂质化的天青蛋白）递送平台的潜力，使用了三种分泌策略：天然脂蛋白信号肽（SPase II；YDL）、Sec依赖的分泌信号肽（SPase I；YDN）和III型分泌信号（YDP）。Laz的表达由pET29a载体上的aTc诱导的Pxyl/tet启动子控制。为了消除代谢负担的干扰，我们构建了一个与TetR匹配的对照质粒（命名为YC*）作为对比。与YC*相比，表达Laz的YB1菌株显著降低了MCF-7细胞的存活率：YDL（50.69±5.51%，p<0.001），YDN（52.05±4.69%，p<0.001）和YDP（51.03±3.92%，p<0.001）。这种效应依赖于诱导条件，在较高的aTc浓度下观察到更强的反应。使用Ehrlich癌小鼠模型进行的体内评估显示，细菌处理组的肿瘤坏死增加，有丝分裂活性降低。在各种构建体中，YDL表现出更高的Laz表达和分泌水平，这在体外和体内都显示出更明显的效果。总体而言，这些发现支持了YB1作为细菌递送平台介导Laz递送的可行性，并强调了在工程细菌治疗设计中匹配调控结构的重要性。本研究提供了YB1系统中Laz相关细胞毒性效应的功能评估，同时指出了进一步研究的领域。
引言
使用生物制剂（如病毒和细菌）进行靶向癌症治疗因它们能够定向到肿瘤、在缺氧环境中复制并将治疗载荷直接递送到恶性组织中而受到越来越多的关注（Fukuhara等人2016；Krzykawski 2015；Ryan等人2009；Song等人2018）。虽然病毒载体已经发展到临床应用（Kudlay和Svistunov 2022），但它们在癌症治疗中的应用面临免疫清除、毒性和肿瘤穿透受限等限制（Alemany等人2000；Gong等人2016；Hirasawa等人2003；Krzykawski 2015；Reid等人2002；Russell等人2014；Toley和Forbes 2012；White等人2008）。相比之下，某些细菌种类，特别是像沙门氏菌肠炎血清型Typhimurium这样的兼性厌氧菌，具有显著的优势，包括更深入的肿瘤浸润、更长的循环时间和易于基因工程改造（Clairmont等人2000；Krzykawski 2015；Toso等人2002）。在沙门氏菌菌株中，YB1因其工程安全性和肿瘤选择性而成为有前景的载体（Yu等人2012）。YB1是aroA缺陷的SL7207菌株的衍生物，通过将必需的asd基因置于缺氧诱导控制下（PpepT启动子）并在常氧条件下抑制其表达（PsodA反义启动子）进行了进一步改造。这种工程使得YB1仅在缺氧肿瘤环境中具有复制能力，从而减少了脱靶效应并提高了其生物安全性。研究表明，YB1能够有效地定植肿瘤组织，同时迅速从正常组织和系统循环中清除（Yu等人2012, 2015）。
使用S. Typhimurium作为递送载体的潜力不仅限于其肿瘤定植能力（Kasinskas和Forbes 2006；Leschner和Weiss 2010；Leschner等人2009；Wang等人2016），还包括其在原位持续产生和分泌治疗剂的能力。这激发了将细胞毒性基因或蛋白质装载到沙门氏菌中的努力，使癌细胞长时间暴露于杀肿瘤分子中。其中一种分子是脂质化的天青蛋白（Laz），它来自脑膜炎奈瑟菌（Gotschlich和Seiff 1987），具有文献记载的抗肿瘤效应。与其他天青蛋白类似，Laz通过稳定肿瘤抑制因子p53、阻止细胞周期进展以及调节参与增殖、血管生成和转移的途径来诱导癌细胞凋亡（Bernardes等人2014；Chaudhari等人2007；Hu等人2023；Punj等人2004；Yamada, Goto, Punj, Zaborina, Chen等人2002a；Yamada等人2009）。其独特的H.8表位和SPase II切割的信号肽使其在结构和功能上与其他天青蛋白同源物（如铜绿假单胞菌的Paz）区分开来（Gotschlich和Seiff 1987；Hashimoto等人2015；Hong等人2006）。我们之前的工作证明了在另一种减弱的沙门氏菌菌株VNP20009中成功表达了Laz（Mansour等人2020），该菌株在缺氧诱导启动子的控制下表达Laz。Laz定位于细菌膜上，并在体外赋予重组菌株增强的细胞毒性。然而，仅蛋白质表面暴露可能限制其治疗潜力，因此我们目前正在研究替代的分泌策略。
本研究的目的是利用YB1的肿瘤靶向机制和Laz的抗肿瘤活性。作为专性厌氧菌，YB1优先定位于并增殖在实体瘤的缺氧核心区域，而传统疗法在这些区域的疗效往往有限，从而诱导局部肿瘤细胞损伤。因此，我们假设通过工程改造YB1以表达和分泌Laz这种细胞毒性蛋白，可以将治疗效果扩展到更富氧的肿瘤外围区域。这种双重策略旨在通过结合空间定向的细菌定植和更广泛的旁分泌细胞毒性作用来提高整体抗肿瘤效果。引入了多种分泌信号以探索不同的蛋白质分泌途径，包括：（1）Laz的天然SPase II信号用于外膜锚定（菌株YDL）；（2）NSP4信号肽（Han等人2017）经SPase I切割后分泌到细胞外介质中（YDN）；以及（3）III型分泌系统（T3SS）信号（SopE和SptP，Konjufca等人2006, 2008）用于宿主细胞质递送（分别为YDE和YDP）。每种构建体的表达都由化学诱导的Pxyl/tet启动子驱动，并在体外针对MCF-7乳腺癌细胞系的二维培养中进行评估；并在体内针对Ehrlich腹水癌（EAC）小鼠模型中进行评估。
本工作强调了从肿瘤靶向的YB1菌株中表达和分泌Laz的效果，并考察了其递送效率。通过比较不同的分泌途径并将它们与细胞结果相关联，本研究为癌症靶向蛋白质治疗的细菌载体进一步优化奠定了基础。
材料与方法
**细菌菌株和质粒**
本研究中使用的细菌菌株和质粒总结在表1中。
**质粒构建和基因工程**
laz基因（GenBank登录号：NC_003112.2；位点标签：NMB_RS07975）针对沙门氏菌Typhimurium进行了密码子优化，并由Eurofins Scientific（卢森堡）合成了三个变体——nsp4laz、sopElaz和sptPlaz；所用序列见补充表S1。这些构建体旨在通过信号肽酶I（SPase I）、信号肽酶II（SPase II）或III型分泌系统（T3SS）来促进Laz的分泌。
**aTc诱导表达盒**
含有tetR抑制子、Pxyl/tet启动子和核糖体结合位点的aTc诱导表达盒从pNZ-sg1594（由德国乌尔姆大学的C. Riedel教授提供）扩增而来。每个laz变体通过Gibson组装插入pUC19载体下游（补充图S1），随后克隆到表达载体pET29a（Novagen，德国）中（补充图S2）。为了检测目的，生成了带有（补充图S3）或不带C末端6×His标签的构建体（图1）。所有构建体两侧都带有SoxR和T7终止子，以防止载体骨架的干扰。用于克隆的引物列在补充表S2中。对照菌株YC使用的是空的pET29a，但后来更换为另一个（pET29a-tetR），以便与测试菌株进行更可靠的比较。
**细菌培养**
所有菌株均在含有适当抗生素的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。YB1衍生菌株补充了氯霉素（25 µg/mL，Sigma Aldrich，德国）和二氨基吡梅酸（DAP；50 µg/mL，Alfa Aesar，美国）。从单个菌落开始过夜培养，在37°C下以200 rpm摇床培养至对数中期（OD600=0.4–0.6）。为了确定活细胞计数，将系列稀释的培养物接种在含有适当添加剂的LB琼脂平板上。
**质粒稳定性测定**
为了评估约50代内的质粒保留情况，每约10代进行传代培养，不进行抗生素选择，基于1000倍稀释。将形成菌落的单位（CFU）接种在选择性（含抗生素）和非选择性（不含抗生素）培养基上，以分别确定携带质粒的CFU和总活细胞计数。质粒阳性CFU占总CFU的百分比表示质粒稳定性（%）。
**laz的表达和分泌**
粗细胞裂解液和培养上清液被分析Laz的表达情况。在准备Laemmli缓冲液之前，将细菌培养物标准化到相同的OD600值，以确保每条泳道的细菌生物量相同。对于上清液样本，收集相当于整个培养物OD600值的体积用于分析分泌的Laz。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行密度分析，仅针对在同一膜上分离的条带。对于细胞裂解液，直接将培养物煮沸后加载。对于上清液，培养物过滤（0.2 µm），用三氯乙酸（TCA；最终浓度20%）沉淀蛋白质（Carl Roth，德国），用冷丙酮洗涤，然后在95°C下干燥，并重新悬浮在Laemmli缓冲液中用于SDS-PAGE。
**蛋白质检测**
通过western blotting使用标准协议进行蛋白质检测（Bio-Rad Mini-PROTEAN和Trans-Blot Turbo系统）。膜在5%脱脂牛奶（TBS-T缓冲液）中封闭，并与一级抗体：anti-Lip/H.8 mAb 2C3（Apicella等人1990）（由R. Say教授提供）孵育。使用HRP偶联的二级抗体（Rabbit Anti-Mouse IgG H&L；Abcam，英国）和SuperSignal™ West Femto底物（Thermo Fisher Scientific GmbH，德国）进行可视化，并使用iBright™成像系统（Thermo Fisher Scientific GmbH，德国）。
**Laz向哺乳动物细胞的递送**
HT-29细胞以100的感染复数（MOI）感染YB1菌株，并用1000 ng/mL的aTc诱导。在无抗生素条件下感染24小时后，从四个组分中分离蛋白质：细胞外细菌（EB）、细胞内细菌（IB）、细胞外分泌蛋白（EP）和细胞内蛋白（IP）。通过离心和PBS洗涤进行分离，然后用Triton X-100裂解哺乳动物细胞。如上所述，使用TCA沉淀法进行蛋白质浓缩。
**细胞系和培养条件**
HT-29（ATCC HTB-38）和MCF-7（ATCC HTB-22）细胞系在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，德国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在37°C的5% CO2培养箱中维持。细胞活力通过台盼蓝排除法和光镜检查评估。选择MCF-7乳腺癌细胞系进行主要的体外实验，因为它表达野生型p53（Leroy等人2014），这是Laz蛋白已知的分子靶点（Hashimoto等人2015；Yamada, Goto, Punj, Zaborina, Kimbara等人2002b）。HT-29细胞用于初步实验，以优化蛋白质递送方案并验证其在哺乳动物细胞中的摄取情况。为了进行体内评估，使用了Ehrlich腹水癌（EAC）小鼠模型作为已建立的可移植肿瘤系统，以评估抗肿瘤活性。MTT细胞毒性测定：细胞毒性通过MTT测定法进行测量。细胞以2×10^4个细胞/孔的密度接种在96孔板中（除非另有说明），并在24小时后进行感染。细菌培养物根据OD600值和预先建立的cfu:OD标准曲线制备到所需的MOI（通常为100:1）。感染持续两小时后，细胞被洗涤，并用标准庆大霉素（Carl Roth，德国）处理（50 µg/mL）以杀死细胞外细菌（Sharma和Puhar 2019）。感染后的维持阶段包括添加卡那霉素（Sigma-Aldrich，德国）、氯霉素、aTc（0–1000 ng/mL）和DAP的培养基。感染后，通过将细胞与MTT试剂（0.5 mg/mL，SERVA Electrophoresis GmbH，德国）在含有10 µg/mL四环素的PBS中孵育4小时来评估细胞活力。甲酚蓝晶体溶解在二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，德国）中，并在595 nm处测量吸光度。活力以相对于未处理对照组的百分比表示。
**Ehrlich腹水癌小鼠的体内研究**
**动物**：从埃及开罗的The Holding Company for Biological Products & Vaccines (VACSERA)获得了35只3-4周大的瑞士白化小鼠（体重20-25克）。小鼠在开罗德国大学的药学与生物技术学院的动物房中适应了三周。每个实验组每笼5只小鼠，处于受控的环境条件下：温度（25±2°C）、相对湿度（60±10%）和12小时光照/黑暗周期。整个研究期间提供标准啮齿动物饲料和高压灭菌水。所有实验方案均经过开罗德国大学药学学院动物实验伦理委员会的审查和批准（CPH-2005-09-KAA），符合《实验室动物护理和使用指南》（“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”，2011年）。尽一切努力减少动物痛苦并减少使用的动物数量。
**肿瘤诱导**：Ehrlich腹水癌（EAC）细胞来自从埃及开罗的国家癌症研究所购买的供体瑞士白化小鼠。从供体小鼠中收集腹水，计数活的EAC细胞，并将其稀释在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中至1×10^6个细胞/mL的浓度。每个携带肿瘤的小鼠的右后大腿皮下注射0.2 mL含有2×10^5个细胞的溶液，如先前所述（Gothoskar和Ranadive 1971）。本研究中仅使用雌性小鼠，因为文献记载EAC细胞在雌性中的初始增殖率和总细胞计数高于雄性（Vincent和Nicholls 1967）。肿瘤在接种后七天内形成，并监测肿瘤生长，直到肿瘤体积达到约100-200 mm^3。使用数字卡尺测量肿瘤尺寸，并根据公式V=(a×b^2)/2估算肿瘤体积，其中V代表肿瘤体积，a代表最长肿瘤直径，b代表最短肿瘤直径。
**细菌制备和小鼠感染**：所有Salmonella Typhimurium菌株在含有DAP和适当抗生素（氯霉素、卡那霉素）的LB肉汤中于37°C培养过夜。测量600 nm处的光密度（OD600），并使用预先建立的标准曲线将其与菌落形成单位（cfu/mL）相关联。细菌通过离心收集，洗涤两次，然后重新悬浮在无菌PBS中至最终工作浓度以进行注射。通过将系列稀释液接种在LB琼脂板上确认纯度和活力。
**肿瘤接种后12天，小鼠通过尾静脉注射含有5×10^7 CFU的细菌悬浮液（Yu等人，2012, 2015）。两天后，小鼠接受含有aTc（1 µg/mL）的250 µL PBS腹腔注射，每隔一天重复一次处理以诱导Laz（或其衍生物）的表达（Hernandez-Abanto等人，2006）。小鼠在细菌注射后23天被处死，相当于从肿瘤接种开始的总体实验持续时间为35天。**
**实验设计**：小鼠随机分为七组（每组n=5）。第1-5组为携带肿瘤的组，接受不同的处理，而第6组和第7组作为健康对照（不携带肿瘤）用于组织病理学比较。实验组总结在表3中。
**组织取样**：在处理期结束时，根据批准的机构动物伦理协议，通过吸入乙醚诱导深度麻醉对小鼠实施安乐死。小心切除肿瘤块，将每个肿瘤的一部分固定在10%中性缓冲福尔马林中用于组织病理学分析。
**组织病理学分析**：肿瘤组织样本在10%中性缓冲福尔马林中固定72小时。然后组织通过分级乙醇系列处理，用二甲苯清洗，并嵌入石蜡中。使用旋转切片机切割5 μm厚的切片并安装在玻璃载玻片上。对于一般组织学检查，根据标准协议（Culling 1974a, b, c）用Hematoxylin和Eosin（H&E）染色。所有载玻片由经验丰富的组织病理学家盲法检查。
**形态计量分析**：根据Elgewelly等人（2025；Mahmoud等人，2022）采用的方法，对H&E染色的切片进行肿瘤坏死的形态计量评估；使用Full HD显微成像系统（Leica Microsystems GmbH，德国）捕获每个肿瘤切片的至少六个随机不重叠的视野。使用Leica组织病理学分析应用程序模块量化每个视野的坏死面积的平均百分比。
**统计分析**：使用Microsoft Excel 2016和Real Statistics Resource Pack插件进行统计分析。数据以平均值±标准差（SD）表示。在参数测试之前评估数据分布的正态性。对于涉及多个独立组的比较，包括体外MTT细胞毒性测定和形态计量分析，应用单因素方差分析（ANOVA）后跟Tukey的事后检验。对于纵向数据集，包括肿瘤生长曲线、质粒稳定性测量和体重监测，使用双因素重复测量ANOVA来评估处理和时间的效果。当违反球形性假设时，应用Greenhouse–Geisser校正来调整p值。仅在适当的情况下使用Student的非配对双尾t检验进行独立成对比较。
**使用Grubbs检验（α=0.05）评估每个实验组内的潜在异常值。当识别出异常值时，在统计分析之前将其排除。p值<0.05被认为具有统计学意义。**
**质粒稳定性和表达载体的选择**：使用pUC19的初步测试显示S. Typhimurium YB1中的质粒稳定性很高（图2），这与先前的报告一致（Gahan等人，2007）。在携带pUC19或pET29a的菌株中评估了50代的质粒稳定性。观察到两种载体之间的质粒保留有显著差异。携带pET29a的细胞在整个实验中保持高质粒稳定性，50代后保留率仍高于78%，而pUC19的质粒丢失迅速，在第50代时几乎检测不到。混合双因素重复测量ANOVA显示质粒类型对质粒稳定性有显著影响（F(1,4) = 687.48，p<0.001），表明pET29a在连续传代过程中比pUC19更稳定。
**Laz的表达、输出和递送**：Western blot分析确认了YB1衍生菌株中Laz、NSP4Laz和SptPLaz的表达，但未检测到SopELaz。作为一级抗体的抗-Lip/H.8 mAb 2C3显示出比抗-His抗体更高的敏感性（补充图S4），后者似乎无法检测到前者能够检测到的潜在截短形式的SptPLaz。根据抗体靶向的位置，这可能表明蛋白质的C末端发生了降解。随着aTc浓度的增加，蛋白质表达增强，细菌生长减少（补充图S5），特别是在培养物达到对数中期后添加aTc时。粗提物在诱导后4小时的Laz、NSP4Laz和SptPLaz的蛋白质条带比24小时时更明显（图3a，补充图S6a）。Laz和NSP4Laz的分泌具有不同的动力学：Laz的分泌依赖于诱导剂，而NSP4Laz的分泌具有时间依赖性（图3b，补充图S6b）。在模拟肠道环境的体外条件下，SptPLaz的分泌较弱（图3b，补充图S6b，S7，基于Konjufca等人，2006）。
**Western blot显示了在细菌培养基和共培养环境中Laz及其衍生物的Western blot。Western blot显示了用不同浓度anhydrotetracycline（aTc）诱导的YB1产生的菌株的粗细胞裂解物和无细胞上清液。Blot 1：YB1-pET29a-laz-his（YCL）；Blot 2：YB1-pET29a-nsp4laz-his（YCN）；Blot 3：YB1-pET29a-sopElaz-his（YCE）；Blot 4：YB1-pET29a-sptPlaz-his（YCP）。泳道2-5：诱导后4小时采集的样本；泳道6-9：诱导后24小时采集的样本。aTc浓度：0、200、500和1000 ng/mL。c Western blot分析了Laz在感染后24小时向HT-29细胞的表达和递送。蛋白质组分包括细胞外细菌（EB）、细胞内细菌（IB）、细胞外可溶性蛋白质（EP）和细胞内递送的蛋白质（IP）。**
**无庆大霉素的HT-29感染**：进行无庆大霉素感染以评估Laz（及其衍生物）在体外实验设置中的表达和递送可能性（图3c）。在细胞外组分、细菌粗裂解物和分泌蛋白质中均检测到Laz（YCL）、NSP4Laz（YCN）和SptPLaz（YCP）。HT-29被选为这项测试，因为它携带突变的p53基因，这是Laz蛋白的已知靶点。
**与上述感染条件相关的不受控制的细菌生长导致宿主细胞大量死亡（补充图S8），这突显了使用抗生素（庆大霉素）保持单层完整性的必要性。**
**体外细胞毒性测定**：在未感染的HT-29培养物中优化了感染协议的步骤、培养基组成和庆大霉素浓度。较高的细胞活力被认为可以提高测定灵敏度并减少与压力相关的细胞死亡。在标准庆大霉素处理时间（1小时）内，最小化PBS洗涤和使用DMEM（代替PBS）可以保持较高的细胞活力（补充图S9）。高达200 µg/mL的庆大霉素不会对活力产生不利影响，后续实验采用了50 µg/mL的浓度。
**与TetR−对照菌株相比的Laz产生菌株**：在标准的一小时庆大霉素处理后杀死细胞外细菌后，观察到YDL（YB1-pET29a-laz）对MCF-7细胞的侵袭性优于YC（YB1-pET29a），在两种MOI下均为如此（100时8.29±0.94% vs 5.62±0.61%；p=0.02；1000时1.5±0.71% vs 0.7±0.40%）（补充图S10a）。细菌剂量的十倍增加显著降低了侵袭率，因为侵袭细菌数量不成比例地增加（YDL=1.8倍；YC=1.25倍）。这表明在两种MOI下侵袭性达到饱和。尽管侵袭能力较差，但在实验结束时YC（TetR−）在细胞外区室的生长明显超过YDL（TetR+）（补充图S10b）。这种生长差异可能是由于YDL中 constitutive 表达的抑制蛋白TetR造成的代谢负担，推测其他Laz衍生物产生菌株也是如此。这种生长差异影响了体外细胞毒性测定的结果，特别是在去除庆大霉素（标准一小时处理后）。无论使用何种aTc浓度，YC始终表现出比YDL更高的细胞毒性（补充图S10c）。然而，随着诱导剂浓度的增加，YDL的细胞毒性逐渐增加，在1000 ng/mL aTc时达到最大值。单因素ANOVA显示测试条件之间存在显著差异（F(9,20) = 7.18，p<0.001），表明诱导剂浓度和使用的菌株显著影响了细胞活力。在每个诱导剂浓度内独立进行的成对比较中，YC和YDL之间的细胞毒性差异也显著（除了1000 ng/mL）。在不同MOI下也观察到了类似的趋势（补充图S11；标准一小时处理后的0 µg/mL庆大霉素）。只有在使用更高MOI（1000）和完全维持的庆大霉素浓度（50 µg/mL）时，这种趋势才能逆转，但总体效果显著降低（补充图S11）。
**由于对照菌株和Laz产生菌株之间的代谢负担不匹配，构建了另一个对照菌株（YB1-pET29a-tetR；YC*）（图4a）。在相同的实验条件下，使用YC*进行的细胞毒性测定显示结果有显著变化（图4b）。单因素ANOVA显示测试条件之间存在显著差异（F(7,60) = 7.80，p<0.001）。YDL在所有诱导浓度下都表现出比YC*更高的细胞毒性，尤其是在1000 ng/mL aTc时（细胞存活率为68.32±12%），这导致了癌细胞存活率最显著的下降。与YC类似，增加aTc浓度对YC*处理的细胞存活率没有显示出任何显著差异，表明诱导剂对哺乳动物细胞存活率没有毒性作用。因此，选择了1000 ng/mL aTc的浓度进行进一步的体外评估。另一个重要的观察结果是，没有任何YC*组与未诱导的YDL组有显著差异，这表明在没有Laz表达的情况下，两种菌株的代谢负担、生长和细胞毒性活性是可比的。
图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：构建了具有匹配代谢负担和相关细胞毒性效应的对照（YC*），作用于MCF-7细胞。a. 用于YC*的pET29a-tetR对照质粒的向量图。b. 在不同诱导剂浓度下，感染YC*和YDL的MCF-7细胞的存活率。标准的一小时庆大霉素处理（n=9）。c. 感染YC*、YDL、YDN和YDP的MCF-7细胞的存活率。标准的一小时庆大霉素处理，aTc浓度=1000 ng/mL（n=3）。数据以平均值±标准差表示。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey’s HSD事后检验。至少共享一个相同上标字母的条形图之间没有显著差异（p<0.05）。
进一步的细胞毒性试验涉及所有三种产生Laz的菌株YDL、YDN（YB1-pET29a-nsp4laz）和YDP（YB1-pET29a-sptPlaz）（图4c），通过单因素方差分析（F(3,8) = 32.96, p<0.001）和随后的Tukey’s HSD事后检验，发现所有菌株的细胞毒性反应与YC*相比都有显著增加。其中YDL的反应最为显著（50.69±5.51%），但与YDN（52.05±4.69%）或YDP（51.03±3.92%）处理相比没有显著差异。
在体外观察到良好的抗肿瘤活性后，对Ehrlich腹水癌（EAC）小鼠模型进行了动物研究。实验组包括未处理的PBS注射组、YC*（YB1-pET29a-tetR）组、YDL（YB1-pET29a-laz）组、YDP（YB1-pET29a-sptPlaz）组以及两个健康的非肿瘤携带组（用于安全性评估，注射YC*或PBS）。从接种当天开始跟踪小鼠的体重和肿瘤体积，随后对肿瘤切片进行组织学检查（健康组的大腿肌肉组织），并对肿瘤切片进行形态测量分析。
肿瘤生长和体积进展：所有接种的小鼠都成功建立了肿瘤，接种后第7天即可检测到可触及的肿块。进行了混合双向重复测量方差分析（Mixed Two-Way Repeated Measures ANOVA）来评估处理对小鼠体重的影响。经过Greenhouse-Geisser校正后，未观察到处理与时间之间的显著交互作用（p=0.16），表明在整个23天的研究期间，所有实验组的体重保持稳定。这些结果表明，这些处理被很好地耐受，没有系统毒性或显著体重下降的证据（图5a）。Kaplan–Meier生存分析显示，在23天的观察期间，所有细菌处理的存活率普遍良好，范围从65%到100%（图5b）。
图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：在Ehrlich腹水癌（EAC）小鼠模型中评估细菌处理的效果。细菌处理与模型对照组相比，部分抑制了肿瘤生长。a. 实验期间小鼠的体重监测。数据以平均值±标准差表示（每组5只小鼠）。统计分析使用混合双向重复测量方差分析（mixed two-way repeated-measures ANOVA）进行。经过Greenhouse–Geisser校正后，未观察到统计学上的显著差异（p=0.16）。b. 经细菌处理后肿瘤携带小鼠的Kaplan–Meier生存分析。生存曲线代表两个独立实验的汇总数据（每组13只小鼠）。c–f 分别为YC*、YDL、YDP和YB1处理组的肿瘤体积生长曲线，与模型对照组（PBS）进行比较。肿瘤体积随时间测量，并以平均值±标准差表示（每组5只小鼠）。统计分析使用混合双向重复测量方差分析（mixed two-way repeated-measures ANOVA）进行。使用Student’s t检验在各个时间点比较每个处理组与PBS对照组。星号表示与PBS相比有显著差异（*p<0.05, **p<0.01）。
未经处理的模型组（PBS）的肿瘤生长（图5c和f）稳步进展，显示出在整个观察期间最大的平均肿瘤体积。与PBS组相比，处理组显示出明显的肿瘤生长抑制。在不同处理的小鼠中监测了肿瘤生长。混合双向重复测量方差分析显示处理（F(4,20) = 7.91, p=0.00054）、时间（Greenhouse–Geisser校正后F(3.41,68.22) = 19.54, p<0.000001）以及处理×时间的交互作用（F(13.64,68.22) = 8.91, p<0.000001）有显著效果，表明不同组之间的肿瘤生长轨迹不同。事后比较显示，所有处理组在后期时间点与PBS对照组相比肿瘤体积显著减少。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey’s HSD的终点分析确认，所有处理相对于PBS显著抑制了肿瘤生长（p<0.05）。然而，在这个时间点，四个处理组之间没有观察到统计学上的显著差异（p>0.05）。
组织学评估：第1组（肿瘤模型对照 - PBS）的肿瘤切片显示密集的多形性嗜碱性肿瘤细胞层，具有明显的核仁，频繁的有丝分裂现象，仅有轻微的局部坏死。肿瘤细胞浸润在坏死肌肉纤维之间，周围血管有中度充血，并伴有轻微的单核细胞浸润。这些发现与侵袭性肿瘤生长一致（图6a）。
图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：肿瘤组织（a–e）和正常大腿肌肉组织（f–g；安全性评估）的组织病理学特征。代表性的H&E染色切片显示实验组之间的组织学差异。a. 第1组（模型，PBS）：肿瘤切片显示密集的多形性嗜碱性肿瘤细胞层，具有明显的核仁（红色星号），频繁的有丝分裂现象（黑色箭头），以及轻微的局部坏死（黑色星号）。肿瘤细胞浸润在坏死肌肉纤维之间（蓝色箭头）。也有中度血管充血和轻微的单核细胞浸润。b. 第2组（YC*）：肿瘤切片显示坏死区域和凋亡细胞（黑色星号）有轻微到中度的增加，与存活的肿瘤细胞层（红色星号）交替出现。有丝分裂现象较少。c. 第3组（YDL）：肿瘤切片显示广泛的、中央界定的坏死，伴有明显的细胞丢失（黑色星号），仅有薄的外围存活肿瘤细胞层（红色星号），表明肿瘤受到强烈抑制。d. 第4组（YDP）：肿瘤切片显示中度的中央坏死（黑色星号），并伴有中等厚度的外层存活肿瘤细胞（红色星号）和偶尔的有丝分裂现象（黑色箭头）。e. 第5组（YB1）：肿瘤切片显示比第2组和第4组更大的坏死区域（黑色星号），以及存活的肿瘤细胞区域（红色星号）和偶尔的有丝分裂现象（黑色箭头），周围有中度单核细胞浸润。f. 第6组（健康对照 - YC*）：组织切片显示外层皮肤、皮下组织和下方骨骼肌的正常组织结构。绿色星号表示皮下组织，黄色星号表示骨骼肌纤维。未观察到组织损伤、坏死、炎症细胞浸润或异常细胞变化。g. 第7组（健康对照 - PBS）：切片显示皮下组织和肌肉的正常组织结构和形态。绿色星号表示皮下组织，黄色星号表示骨骼肌纤维。未检测到组织病理学改变。苏木精和伊红（H&E）染色。比例尺：i=500 μm（F-i=50 μm）；ii和iii=50 μm。
第2组（YC*）的肿瘤切片显示与模型组相比，坏死区域有轻微到中度的增加，同时凋亡细胞数量增加。然而，仍然存在大面积的存活肿瘤细胞层，尽管有丝分裂现象减少（图6b）。
第3组（YDL）显示出最明显的抗肿瘤效果。切片特征是广泛的、中央界定的坏死区域，伴有明显的细胞丢失，仅有薄的外围存活肿瘤细胞层。有丝分裂现象很少，表明肿瘤细胞增殖受到强烈抑制（图6c）。
第4组（YDP）的肿瘤组织显示中度的中央坏死，并伴有中等厚度的外层存活肿瘤细胞。偶尔观察到有丝分裂现象，表明肿瘤抑制部分但不完全（图6d）。
第5组（YB1）的切片显示比第2组和第4组更广泛的坏死区域。然而，仍然存在存活的肿瘤细胞区域和偶尔的有丝分裂现象。肿瘤组织周围有中度单核细胞浸润（图6e）。
第6组（健康对照 - YC*）和第7组（健康对照 - PBS）：两组都显示出皮肤、皮下组织和肌肉的正常组织结构，没有异常细胞变化、坏死或炎症浸润的证据（图6f和g）。
坏死区域的形态测量分析：定量形态测量分析（图7）支持了定性的组织学观察、从肿瘤生长进展和体外试验中得出的结论。单因素方差分析显示测试条件之间存在显著差异（F(4,25) = 1217.54, p<0.001）。第3组（YDL）在所有处理组中显示出最高的坏死肿瘤面积百分比（76±2%）。第5组（YB1）的坏死面积百分比（44±2%）高于第2组（YC*，16±1%）和第4组（YDP 24±2%），而第1组（PBS）的坏死比例最低（7±1%）。健康对照组6和7没有坏死或病理变化。
图7：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：不同细菌菌株处理后Ehrlich癌肿瘤切片中坏死区域的形态测量分析。对H&E染色的肿瘤切片进行了坏死面积的定量评估。用表达Laz的YB1菌株处理的肿瘤显示出比PBS和YC*对照组更高的坏死面积。数据以平均值±标准差表示。统计分析使用单因素方差分析（F(4,25) = 1217.54, p<0.001）后进行Tukey’s HSD事后检验。至少共享一个相同上标字母的条形图之间没有显著差异（p<0.05）。
讨论：细菌靶向肿瘤疗法是一种有前景的方法，因为它们具有自我复制性质，并且在缺氧的肿瘤微环境中选择性积累（Bermudes等人2000；Clairmont等人2000；Ganai等人2011）。其中，Salmonella enterica血清型Typhimurium菌株如VNP20009和YB1已被广泛研究（Guo等人2015；Kasinskas和Forbes 2006；Leschner和Weiss 2010；Li等人2017；Ning等人2017；Osswald等人2015；Wang等人2016；Yu等人2012, 2015）。特别是YB1，表现出严格的厌氧生长和增强的肿瘤特异性，支持其作为传递治疗载体的候选者。
在本研究中，我们专注于评估使用不同分泌信号介导的YB1递送Laz及其相关的功能性细胞毒性效应。Laz的表达由化学诱导的Pxyl/tet启动子驱动，并测试了多种分泌途径：天然信号肽（SPase II）（Gotschlich和Seiff 1987）、NSP4信号肽（SPase I）（Han等人2017）以及来自SopE和SptP的III型分泌信号（Konjufca等人2006, 2008）。与pUC19相比，pET29a载体在YB1中提供了更高的质粒稳定性，并实现了成功的蛋白质表达。
Western blot分析确认了细菌培养和感染哺乳动物细胞过程中Laz、NSP4Laz和SptPLaz的表达，而SopELaz未表达。这三种构建体在粗细胞裂解物中显示出诱导剂依赖性的Laz条带强度增加。然而，观察到了不同的分泌模式。Laz的分泌随着aTc浓度的增加而增加，NSP4Laz显示出时间依赖性的动力学，而SptPLaz的分泌相对较弱。尽管在模拟肠道条件的情况下以及与HT-29细胞相互作用时SptPLaz的分泌增加，但目前的实验提供了T3SS介导递送的间接证据。直接证明细胞质转位需要额外的实验，如基于报告基因的转位系统。
优化感染方案突出了关键参数，包括洗涤策略、培养基选择和庆大霉素的维持。过度的PBS洗涤和长时间的PBS暴露显著降低了癌细胞的存活率。此外，发现标准庆大霉素处理（50 µg/mL–1小时）是必要的，以防止细菌过度生长，从而保持癌细胞单层的完整性。
在MCF-7的体外感染中，尽管YC（YB1-pET29a；tetR−）在侵袭方面有劣势，但在生长方面具有优势。因此，YC在所有诱导浓度下（1000 ng/mL aTc除外）都表现出比YDL更强的细胞毒性。对于未诱导的YDL的一致性观察，以及Western blot显示的无泄漏表达，表明代谢负担是由TetR抑制蛋白的组成型表达引起的，而不是Laz的表达。通过维持庆大霉素来限制细胞外生长克服了一些生长差异，但总体效果非常有限。这些发现强调了在设计活细菌疗法时需要平衡表达控制与细菌适应性的重要性。为了验证上述假设，构建了一种新的TetR表达控制菌株（YC* - YB1-pET29a-tetR），并在重复的实验设置中进行了测试（与之前的YC类似）。与YC*相比，诱导的YDL处理显著降低了MCF-7细胞的存活率。此外，未诱导的YDL与所有YC*处理之间没有显著差异，表明这两种菌株的生长和基线活性非常接近，这强烈支持了该假设。尽管诱导剂浓度从250 ng/mL增加到1000 ng/mL时没有统计学上的显著差异，但增加aTc浓度后YDL处理的反应始终增强，在1000 ng/mL时达到峰值。这种诱导剂浓度的影响显著强于未诱导的YDL和所有YC*处理。相反，增加aTc浓度对YC*（或YC）处理没有影响，表明在MCF-7细胞中使用aTc浓度高达1000 ng/mL是安全的。这些结果结合Western blotting数据表明，在1000 ng/mL aTc下观察到的更强效果与Laz的诱导依赖性表达有关，而不是诱导剂本身的不良影响。
进一步测试了其他构建的菌株YDN（YB1-pET29a-nsp4laz）和YDP（YB1-pET29a-sptPlaz）的效果，并将其与YC*和YDL进行了比较。所有三种产生Laz的菌株表现出非常相似的细胞毒性水平，并且都显著强于YC*。虽然YDL的Laz表达水平高于YDN和YDP，但在MCF-7细胞中观察到的细胞毒性差异很小且不具有统计学意义。这可能反映了蛋白质传递机制的差异。YDL主要依赖于表面表达，而YDN将Laz分泌到细胞外环境中，YDP则通过III型分泌系统（T3SS）将Laz传递到宿主细胞中。这些传递策略的差异可能会影响Laz对靶细胞的有效利用，尽管总蛋白质表达水平有所不同。体外细胞毒性实验的综合结果支持进行体内研究以进一步评估抗肿瘤活性。
还进行了一项动物研究，以评估测试菌株（YC*、YDL、YDP和YB1亲本菌株）的抗肿瘤活性。所有接受细菌处理的组别相比模型组的肿瘤生长都有所减缓。研究期间小鼠的平均体重略有增加，但各组之间没有显著差异。然而，随着时间的推移，肿瘤体积的增长存在差异，模型组的肿瘤生长明显快于其他所有接受细菌处理的组别。四个实验组之间的波动大多不显著。尽管各组之间的存活率存在轻微差异，但总体存活率仍然很高，表明在实验条件下使用工程细菌菌株是可耐受的。本研究没有量化肿瘤和正常组织中的细菌定植水平。未来的研究将包括基于CFU的生物分布分析，以确定治疗效果的差异是否受到细菌定植动态以及Laz相关效应的影响。
组织病理学检查支持了宏观和形态测量结果，显示实验组之间的肿瘤结构存在明显差异。未经处理的肿瘤组织特征为密集排列的多形性恶性细胞、频繁的有丝分裂现象以及有限的自发坏死，反映了埃利希癌的侵袭性。相比之下，细菌菌株处理导致了不同程度的肿瘤组织损伤，主要表现为坏死区域的扩大和存活肿瘤细胞数量的减少。与更强的蛋白质表达一致，YDL处理组的效果最为显著，其中中心区域出现广泛的坏死，只有薄层存活的肿瘤细胞。这种模式与肿瘤存活率降低和肿瘤组织结构破坏相关。一些中间处理组表现出中等程度的反应，显示出坏死和残留存活肿瘤组织的混合区域。重要的是，来自非肿瘤对照组的肌肉组织保持了正常的组织结构，没有炎症浸润或细胞异型性，支持了细菌治疗的安全性。总体而言，这些发现表明观察到的效果与肿瘤组织的真正结构破坏有关，而非非特异性组织损伤。尽管YDL处理在肿瘤内产生了更大的坏死区域，但肿瘤体积的减少与YC*或YB1菌株处理相比没有显著差异。这可能反映了在当前实验条件下YB1的强大内在抗肿瘤活性，这可能部分掩盖了Laz表达带来的额外治疗效果。通过优化治疗参数（包括细菌剂量和给药方案），未来研究可以进一步明确Laz对抗肿瘤效果的贡献。
本研究强调了在设计、开发和评估细菌肿瘤靶向系统时涉及的复杂性和多因素考虑。为了建立一个具有可控蛋白质表达和传递的功能系统，优化了几个关键参数，包括使用代谢匹配的控制菌株（YC*），从而更准确地解释细胞毒性结果。观察到的诱导依赖性效应和构建物之间的差异强调了在设计工程细菌平台时平衡表达控制、传递策略和细菌适应性的重要性。本研究未检查Laz蛋白在肿瘤组织内的分布和表达情况。未来需要通过免疫组化或蛋白质检测方法来研究给药后的肿瘤内定位和持久性。此外，通过使用替代启动子和染色体整合策略开发一种稳定的、无化学诱导剂和无抗生素的表达系统，将进一步提高该平台的适用性。
结论
本研究展示了在S. Typhimurium YB1中成功诱导表达和输出Laz及其衍生物。在构建物中，天然Laz系统的表达和输出水平高于衍生物。表达Laz的菌株表现出诱导依赖性的细胞存活率降低，并与体内肿瘤形态的可观察变化相关。总体而言，这项工作提供了使用YB1系统进行Laz传递的功能评估，并强调了工程细菌传递平台的关键设计考虑因素。
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