姚Z. | 吕G. | 安W. | 麦麦提图逊M. | 赵J.
新疆医科大学第一附属医院（新疆医科大学附属口腔医院）颌面外科
**摘要**
本研究探讨了叶黄素对创伤性颞下颌关节（TMJ）纤维性强直的治疗效果及其潜在机制。在兔子体内建立了TMJ纤维性强直模型，随后将其随机分为叶黄素治疗组和模型组（每组8只），并分别给予叶黄素（10 mg/kg）或生理盐水，持续4周。与模型组相比，叶黄素组表现出更高的体重（P = 0.049）、最大张口度（P = 0.043）、髁突表面积（P = 0.001）和髁突体积（P = 0.003）。苏木精-伊红染色显示叶黄素组的纤维层更厚，细胞增殖活跃，细胞层更加明显。透射电子显微镜观察发现，叶黄素组的关节盘纤维增殖减少，胶原纤维直径增大。EdU（5-乙炔基-2-脱氧尿苷）染色显示叶黄素组的细胞增殖显著增加。酶联免疫吸附测定法显示叶黄素组血清中的骨钙素（OCN）、I型前胶原N端肽（PINP）和骨特异性碱性磷酸酶（BALP）水平升高，而I型胶原C端交联末端肽（β-CTx）水平降低。实时定量逆转录-聚合酶链反应分析显示叶黄素组ALP、OCN、I型胶原（COLIA1）和骨桥蛋白（OPN）的表达上调。研究表明，叶黄素能有效减轻纤维软骨形成，改善TMJ纤维性强直兔模型的关节功能，提示其作为治疗创伤性关节疾病的潜在药物具有可行性。
**引言**
创伤性颞下颌关节（TMJ）强直是一种由外伤或长期过度负荷引起的病理状态，主要表现为关节软骨破坏、关节活动受限和疼痛症状。纤维性强直是由于纤维结缔组织过度生长导致关节活动受限。该病不仅影响患者的咀嚼功能，还可能导致面部畸形，严重影响生活质量。TMJ损伤和退行性变化常伴随异常纤维软骨形成，加剧关节功能障碍。鉴于TMJ独特的解剖结构和生理功能，其修复和再生一直是临床医学的挑战。因此，及时有效的治疗对改善TMJ纤维性强直患者的预后至关重要。目前，纤维性强直的治疗主要依靠手术干预结合术后康复。虽然非甾体抗炎药、肌肉松弛剂和皮质类固醇等药物可缓解症状和炎症，但它们仅针对表面问题。因此，开发新型有效的治疗策略成为研究重点。近年来，植物来源的药物作为安全有效的疗法，在骨关节疾病治疗中受到越来越多的关注。叶黄素是一种天然类胡萝卜素，主要存在于绿叶蔬菜、玉米和菠菜中，广泛用于预防和治疗眼科疾病。研究表明，叶黄素具有抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，可通过调节免疫反应和氧化应激保护组织。它还被推荐用于预防炎症性机械性痛觉过敏的补充剂策略。越来越多的证据表明叶黄素在骨关节疾病中有潜在应用，如骨质疏松症和关节炎。因此，作为潜在的骨修复剂，叶黄素对TMJ纤维性强直的治疗效果值得进一步研究。
**目的**
本研究旨在探讨叶黄素在TMJ纤维性强直兔模型中的治疗效果，评估其是否可通过促进软骨修复、加速骨代谢和调节细胞增殖来改善创伤性关节损伤的愈合过程。
**材料与方法**
**建立TMJ纤维性强直模型**
共使用40只健康的成年新西兰白兔（雄性和雌性，体重2.5–3.0 kg），其中24只用于剂量和时间进程实验（叶黄素剂量分别为5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg，每组8只），16只用于主要疗效实验（生理盐水 vs 叶黄素10 mg/kg，每组8只）。兔子由新疆医科大学动物实验中心提供，在控制条件下适应1周（温度20–24°C，12小时光照/黑暗周期）。实验前禁食12小时，但可自由饮水。
**实验过程**
兔子通过耳静脉注射2%利多卡因麻醉后固定在手术台上。消毒后暴露双侧TMJ，在连接瞳孔和下颌角的线路上做长约5–6 cm的垂直切口以完全暴露下颌骨。暴露髁突颈部和关节囊，使用微型骨锯在髁突颈部后缘制造水平骨折（避开关节囊）。逐层缝合伤口，并连续三天给予青霉素40,000 U/kg预防感染。该模型主要代表纤维性或纤维软骨性TMJ强直，而非完全骨融合。
**叶黄素的剂量和时间依赖性效应**
成功建模的兔子随机分为三组（每组8只）：低剂量组（5 mg/kg/天）、中剂量组（10 mg/kg/天）和高剂量组（20 mg/kg/天）。按照前述方法建立TMJ纤维性强直模型后，各组每天口服叶黄素至6周。通过计算机断层扫描（CT）在术后3、4和6周评估关节修复情况，使用三维重建技术评估髁突愈合状态、表面积和体积。基于初步时间进程评估，选择4周作为评估早期纤维和纤维软骨修复的主要终点。
**治疗**
本研究遵循ARRIVE 2.0动物研究指南设计。16只成功建模的兔子随机分为两组，每组8只。模型组口服生理盐水；叶黄素治疗组从术后第一天起每天口服叶黄素（10 mg/kg，溶于生理盐水中）持续4周。使用GPower 3.1软件进行回顾性功效分析，结果显示每组8只动物的样本量可检测到80%以上的显著差异（效应量=1.8，α=0.05）。实验结束后对兔子实施安乐死。
**术后评估**
术后进行CT扫描以确认骨折位置，排除髁突外或关节囊损伤的实验动物（图1）。术后4周对双侧TMJ进行CT检查，观察髁突骨折处的纤维软骨形成情况，使用三维重建技术分析髁突表面积和体积变化。
**数据收集与分析**
- **体重和最大张口度测量**：术后4周测量两组兔子的体重，使用数字游标卡尺测量最大张口度（MMO）。在轻度吸入麻醉（异氟醚1.5–2.0%）下进行测量，每次测量三次，取平均值进行分析。
- **苏木精-伊红（H&E）染色**：采集髁突组织，用4%甲醛溶液固定24小时，逐步脱水，然后用二甲苯透明处理并包埋在石蜡中。切片厚度为5 µm，用超薄切片机切片，去除石蜡后依次用不同浓度酒精脱水，浸入苏木精溶液5分钟，冲洗后用伊红溶液染色2分钟，再冲洗。
- **透射电子显微镜检测**：将髁突组织切成1–2 mm³块，用2.5%戊二醛溶液固定4小时，逐步脱水后用醚透明处理，浸入树脂包埋液12小时，然后在60°C烤箱中聚合24小时。切片后用超薄切片机切成50 nm厚的切片，用铀酰醋酸和柠檬酸铅染色，用透射电子显微镜观察（Jeol JEM-1400Plus）。
- **EdU染色**：安乐死前24小时腹腔注射预温的EdU（5-乙炔基-2-脱氧尿苷）工作液（20 µM），髁突组织切片用4%甲醛溶液固定，室温下与Click反应缓冲液孵育30分钟，再用Hoechst染料染色5分钟。荧光显微镜观察，由盲法评估员计算每个切片中EdU阳性核的数量。
- **酶联免疫吸附测定（ELISA）**：离心分离兔血清，使用ELISA试剂盒（Biosharp，塔林，爱沙尼亚）检测25-羟基维生素D、骨钙素（OCN）、I型前胶原N端肽（PINP）、骨特异性碱性磷酸酶（BALP）和I型胶原C端交联末端肽（β-CTx）的水平。
- **实时定量PCR（RT-qPCR）**：用TRIzol试剂（Invitrogen，加州卡尔斯巴德）从髁突组织中提取总RNA，用NanoDrop分光光度计测量RNA浓度和纯度，再用逆转录试剂盒（Beijing Aidlab，北京）反转录为cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix（Beijing Aidlab）进行RT-qPCR，设计特异性引物（表S1），以GAPDH为内参基因，计算目标基因的相对表达水平。
- **统计分析**：所有统计分析使用GraphPad Prism（v10.1.0，GraphPad Software，美国波士顿）进行。组间比较采用Student’s t检验或单因素方差分析，P < 0.05视为显著。
**结果**
- **叶黄素对兔子髁突损伤的影响**：
- 5 mg/kg/天组：骨折裂隙可愈合，但最终在骨折处有部分吸收。
- 10 mg/kg/天组：骨折处可见愈合，第四周开始细胞增殖，第六周相对稳定，骨折处无吸收。
- 20 mg/kg/天组：骨折裂隙愈合，第三和第四周的骨量增殖比5 mg/kg和10 mg/kg/天组更明显。第六周在愈合处观察到骨增殖（图S1）。在这些剂量中，10毫克/千克/天显示出最有利的治疗效果，且没有明显的不良反应，因此被选为主研究。计算机断层扫描（CT）显示模型组中髁突后缘有明显的裂隙，纤维软骨的形成表明关节处于损伤修复阶段（图2A）。在叶黄素处理组中，未观察到髁突骨折部位的纤维软骨，骨骼结构显得更加稳定，这表明叶黄素在促进骨骼修复中起作用（图2B）。基于CT的三维重建分析显示，叶黄素组的髁突表面积（159.78 ± 16.68 vs 118.47 ± 24.49平方毫米，P = 0.001）（图2C）和体积（200.12 ± 16.68 vs 171.59 ± 16.17立方毫米，P = 0.003）（图2D）显著大于模型组。治疗4周后，叶黄素组的兔子体重（3.30 ± 0.46千克）显著高于模型组（2.94 ± 0.11千克）（P = 0.049）（图2E）。在4周的治疗期间，叶黄素组的最大开口度（MMO）（15.00 ± 2.25毫米）显著大于模型组（12.63 ± 2.02毫米）（P = 0.043）（图2F）。这些发现表明，与模型组相比，叶黄素显著改善了髁突的骨折愈合。
组织学变化通过H&E染色观察到（图3）。与模型组相比，叶黄素组的髁突组织显示出更有序的细胞排列、更完整的纤维层、活跃的细胞增殖和更清晰的细胞层。这表明叶黄素促进了关节软骨的修复和再生。
透射电子显微镜进一步揭示了叶黄素在增强软骨修复中的作用。与模型组相比，叶黄素组的关节盘中的胶原纤维直径显著增大，同时纤维增殖减少（103.80 ± 12.12 vs 173.30 ± 23.28微米，P < 0.001）（图4）。这表明叶黄素促进了胶原纤维的有序排列，并减轻了纤维化，从而改善了关节的结构完整性。
EdU染色用于评估细胞增殖，结果显示叶黄素组的髁突细胞增殖水平（0.39 ± 0.01）显著高于模型组（0.24 ± 0.02）（P < 0.001）（图5）。在叶黄素组的髁突增殖区域观察到更高比例的EdU阳性细胞，这表明叶黄素可能通过促进细胞增殖来加速颞下颌关节（TMJ）的修复过程。
ELISA用于评估叶黄素治疗对骨代谢相关指标的影响（图6）。结果显示，叶黄素组的血清OCN（32.47 ± 6.34 vs 22.92 ± 3.25纳克/毫升，P = 0.002）、PINP（14.41 ± 1.64 vs 9.10 ± 1.03纳克/毫升，P < 0.001）和BALP（309.59 ± 53.28 vs 168.41 ± 24.07皮克/毫升，P < 0.001）水平显著升高，而β-CTx水平（357.59 ± 26.56 vs 542.94 ± 24.09皮克/毫升，P < 0.001）显著降低。两组之间的血清25-羟基维生素D水平没有显著差异（139.60 ± 13.41 vs 150.20 ± 22.52纳摩尔/升，P > 0.05）。这些发现表明叶黄素促进了骨形成，同时抑制了骨吸收，从而改善了骨代谢平衡。
RT-qPCR结果进一步证实了叶黄素对骨代谢相关基因表达的影响（图7）。与模型组相比，叶黄素组的ALP（2.09 ± 0.90 vs 1.09 ± 0.45，P = 0.002）、OCN（2.70 ± 1.33 vs 1.11 ± 0.47，P < 0.001）、COLIA1（2.37 ± 1.25 vs 1.07 ± 0.45，P = 0.003）和OPN（2.39 ± 0.64 vs 1.14 ± 0.54，P < 0.001）的表达水平显著升高。通过上调这些基因的表达，叶黄素可能有助于TMJ中软骨和骨的修复和再生。
总之，这项研究建立了TMJ纤维性强直的兔子模型，并用叶黄素进行治疗，以研究叶黄素在修复创伤性关节纤维化方面的治疗效果。叶黄素显著改善了关节功能，增强了骨代谢，促进了骨修复，并加速了TMJ纤维性强直中的软骨重建。首先，叶黄素显著改善了受伤关节的功能障碍。治疗4周后，叶黄素组的兔子体重显著增加，最大开口度也更大。体重的增加可能与叶黄素改善关节功能和减轻关节僵硬的能力有关，因为TMJ损伤通常会导致活动受限，影响食物摄入和体重。通过促进骨修复和关节功能恢复，叶黄素提高了兔子的活动能力，这可能有助于观察到的体重增加。TMJ纤维性强直的管理旨在恢复开口度。最大开口度的改善进一步验证了叶黄素在缓解功能障碍和恢复关节活动范围方面的有效性。计算机断层扫描提供了叶黄素在关节修复中作用的额外证据。组织学研究表明，在绵羊模型中，纤维软骨阶段是新骨形成的第一阶段。在模型组中，观察到髁突骨折部位后缘有纤维软骨，表明在创伤恢复过程中修复不完全。相比之下，叶黄素组的骨折端没有纤维软骨，骨骼结构显得稳定，表明叶黄素有效促进了骨修复。叶黄素能够缓解这种情况，支持正常骨修复过程的恢复。基于CT的三维重建显示，叶黄素组的髁突表面积和体积显著增加，进一步证实了叶黄素在稳定和维持骨结构完整性方面的贡献。H&E染色显示，叶黄素促进了软骨修复和再生。在创伤恢复过程中，细胞增殖和成骨细胞分化是关键步骤，叶黄素可能通过刺激细胞增殖来促进软骨基质的沉积和修复，从而加速受伤关节的愈合。透射电子显微镜显示，叶黄素组的关节盘中胶原纤维直径显著增大，纤维增殖减少。这表明叶黄素促进了胶原纤维的有序排列，减轻了纤维化，并有助于恢复关节的结构完整性。连续的胶原纤维沉积和有序排列对于骨和软骨的形成及稳定性至关重要。叶黄素可能通过增强胶原合成及其有序排列来改善关节修复。EdU染色实验进一步验证了叶黄素促进细胞增殖的效果。叶黄素组的髁突细胞增殖水平显著高于模型组，表明叶黄素通过促进细胞增殖来加速TMJ的修复。细胞增殖是骨和软骨修复的基础，叶黄素可能通过增加增殖细胞的数量来加速修复过程。叶黄素对骨代谢的调节是其效果的另一个关键方面。OCN、PINP和BALP是骨形成的标志物，而β-CTx是骨吸收的标志物。叶黄素通过促进骨形成和抑制骨吸收来改善骨代谢平衡。这些结果表明，叶黄素通过促进骨基质沉积和矿化来增强骨结构稳定性，同时减少骨丢失。尽管两组之间的25-羟基维生素D水平没有显著差异，但叶黄素仍通过直接调节骨细胞功能来促进骨修复和代谢。RT-qPCR结果进一步证实了叶黄素对骨代谢相关基因表达的影响。ALP、OCN和COLIA1是骨形成的关键分子标志物，而OPN与骨基质矿化和重塑密切相关。通过上调这些骨形成标志物的表达，叶黄素进一步促进了骨基质的合成和矿化，从而加速了受伤关节的修复和再生。这些结果共同表明，叶黄素通过多种机制改善了TMJ纤维性强直的治疗效果。叶黄素促进了软骨修复，调节了骨代谢，促进了细胞增殖，增加了骨形成标志物的表达，并抑制了骨吸收，从而改善了骨结构和关节功能。这些发现提供了实验证据，支持叶黄素作为创伤性关节疾病的潜在治疗候选物。尽管结果令人鼓舞，但仍需要进一步研究来探索叶黄素效果的分子机制，并评估其临床潜力，特别是在长期治疗和人类模型中的效果。总之，这项研究表明，叶黄素可以通过促进功能恢复、增强骨重塑和支持软骨再生来有效缓解TMJ的纤维性强直。这些效果可能是通过刺激成骨活性、抑制纤维过度生长和增强细胞增殖来实现的。我们的发现表明，叶黄素可能作为一种有前景的辅助治疗策略，用于管理创伤性关节损伤和防止纤维性强直的进展。
