展示了一种基于丁胺的生物质降解方法，该方法可以利用多种微生物菌株对杨木生物质进行分解和转化

低沸点烷基胺如丁胺作为一种有效的生物质预处理溶剂显示出巨大的潜力，因为它们可以容易地被回收和再利用；然而，它们支持微生物转化水解物中营养物质的能力是一个重要的研究领域。在这里，我们使用丁胺对杨木生物质进行预处理，并研究了溶剂去除和酶水解后可发酵糖的释放情况，以及所生成的水解物与三种常用作生物转化宿主的微生物的生物相容性。我们观察到，残留的丁胺及其衍生物丁基乙酰胺的浓度很高，足以对产生苹果酸、异戊二酚和双萜烯的黑色曲霉（Aspergillus niger）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）和托鲁氏红孢菌（Rhodosporidium toruloides）产生毒性。通过活性炭过滤去除这些有毒化合物并补充营养物质后，得到的水解物中含有超过100克/升的糖分，这促进了强健的生长、底物消耗和生物产物的积累，其性能优于传统的培养基。这是首次在试点规模上展示基于丁胺的杨木生物质分解过程，利用工程微生物将高浓度的糖转化为有价值的生物产物。

1. 本研究展示了一种可扩展的丁胺预处理策略，可以从杨木中生成高糖含量的水解物，同时实现真菌、细菌和酵母的直接微生物转化。通过整合预处理、解毒和发酵，它建立了一个统一且多功能的木质纤维素生物加工平台，并具有溶剂回收的潜力。
2. 在试点规模上，丁胺预处理后释放了超过100克/升的糖分，对于产生苹果酸、异戊二酚和双萜烯的黑色曲霉（Aspergillus niger）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）和托鲁氏红孢菌（Rhodosporidium toruloides）来说，仅需要最少的补充。活性炭去除了抑制性的酰胺副产物，同时保留了可发酵的碳，使得在没有洗涤步骤或高能耗溶剂回收的情况下能够获得高生物产物产量。
3. 该方法可以通过减少预处理过程中的酰胺形成、提高溶剂回收效率以及增强微生物对残留化合物的耐受性来进一步改进。这些改进将简化水解物的制备，并支持与分批或连续发酵系统的集成。

木质纤维素生物质是可持续生产生物燃料和生物制品最丰富的可再生资源。其大规模利用对于减少对有限化石资源的依赖并实现国家循环型生物经济至关重要。与其他有机废弃物流相比，木质纤维素生物质具有更高的可用性、较低的食物系统竞争性以及更稳定的碳组成。然而，由于其细胞壁成分结构紧密，其转化为可发酵底物的过程受到阻碍：纤维素形成被半纤维素包裹并被木质素覆盖的结晶微纤维。这些障碍使得有效的预处理成为释放可发酵糖分并实现下游微生物转化的关键。克服这种内在的顽固性是开发可扩展、成本效益高的木质纤维素生物质转化工艺的关键技术挑战之一。已经开发了多种物理、化学和生物预处理技术用于木质纤维素生物质。其中，化学预处理被认为是一种独特且有前景的方法，包括碱处理、稀酸水解、有机溶剂有机溶剂法、离子液体（ILs）和深共晶溶剂（DES）。然而，大多数化学预处理会产生在发酵过程中可能具有抑制作用的化合物（例如，酸预处理产生的糠醛和5-羟基甲基糠醛；碱预处理产生的木质素衍生酚类），并且通常需要后续的固体洗涤和高能耗的溶剂回收步骤。理想的预处理溶剂能够高效地分解生物质，以最大化可发酵糖的产量，同时最小化抑制性副产物的产生，减少广泛洗涤或中和的需要，并便于溶剂回收。胺功能化溶剂，如丁胺，在木质纤维素生物质预处理中显示出巨大潜力，因为它们具有高分解效率和易于回收的优势。丁胺预处理选择性地切割木质素-碳水化合物复合物中的酯键，提高酶的-accessibility，并在酶水解后释放高达90%的纤维素衍生葡萄糖。与其他胺相比，丁胺预处理通过提供高可发酵糖产量、允许通过蒸馏高效回收溶剂以及无需洗涤即可直接进行酶水解，从而可能简化下游工艺。

几种微生物物种，包括细菌、酵母和丝状真菌，因其固有的代谢木质纤维素衍生底物的能力而被研究用于下游处理。例如，长期以来用于有机酸发酵的丝状真菌黑色曲霉已被工程改造，能够高效地将便宜的未精炼底物转化为L-苹果酸。同样，铜绿假单胞菌已成为生物合成有价值化合物（如航空燃料前体异戊二酚）的强健细菌宿主。工程改造的铜绿假单胞菌菌株可以共消耗混合糖、有机酸和木质素衍生分子，而不影响异戊二酚的生产，这突显了其在复杂原料上的代谢多样性。同样，富含油脂的酵母托鲁氏红孢菌已被用于萜类化合物（如双萜烯）的生产，利用其高油脂积累能力和对木质纤维素水解物抑制剂的固有耐受性。然而，不同的微生物物种可能对预处理抑制剂表现出不同的耐受性，并具有不同的营养需求和吸收机制，这影响了它们吸收和转化生物质水解物中营养物质的能力。直接比较这些有吸引力的生物转化宿主在标准化的木质纤维素水解物上的表现，可以阐明它们的相对优势，并指导未来生物工艺设计中微生物菌株的选择和优化。在这项工作中，我们评估了使用基于丁胺的工艺的有效性，该工艺包括杨木生物质的分解、溶剂去除和微生物转化，杨木是一种重要且丰富的生物能源作物。我们通过确定酶糖化产量来评估预处理效率，并研究三种工程改造的黑色曲霉、铜绿假单胞菌和托鲁氏红孢菌菌株在丁胺衍生水解物中的生长情况以及产生有价值生物产物的能力：分别是苹果酸、异戊二酚和双萜烯。通过整合预处理性能与微生物生长和产物形成，这项研究为基于烷基胺的杨木生物质生物转化平台的可行性提供了见解，并为未来木质纤维素生物工艺开发中的微生物菌株选择提供了信息。

混合杨木被选为代表性的木质纤维素原料，因为它丰富且与生物能源应用相关。对杨木生物质的组成分析显示以下主要聚合物组分的百分比：葡聚糖（44.6 ± 0.6%）、木聚糖（20.3 ± 0.2%）、酸不溶性木质素（28.1 ± 0.7%）和酸溶性木质素（5.0 ± 0.1%）。为了生成足够的用于生物转化测试的水解物，生物质在单个运行中使用10升反应器进行了预处理，使用纯丁胺作为溶剂（固体负载量为15%，140°C，3小时）。预处理反应后进行了溶剂去除步骤（80°C，12小时），实现了93%的去除效率。对预处理和干燥后的生物质进行酶水解（pH 5，50°C，72小时），得到了含有77.3克/升葡萄糖和27.1克/升木糖的主要可发酵糖，相应的糖化产量分别为88.7%和66.8%。获得的组成和糖产量与在较小规模下用类似反应条件分解另一种混合杨木后获得的组成和糖产量相似，这展示了基于丁胺的工艺的稳健性。重要的是，我们没有在水解物中检测到微生物抑制剂糠醛和5-羟基甲基糠醛的存在，这两种物质通常在高温酸性条件下产生。这是首次报道在试点规模反应器中使用丁胺预处理杨木，生成了含有总共104克/升可发酵糖的水解物，可用于生物转化，这是使用烷基胺基生物质转化工艺获得的最高报告浓度。这一结果显示了使用高葡聚糖含量的生物质（如杨木）并结合使用挥发性溶剂进行预处理的好处，消除了在酶水解前通常会导致糖损失的生物质洗涤需要。

微生物转化宿主对木质纤维素水解物的耐受性是工艺效率的关键决定因素，特别是在预处理过程中产生的抑制性化合物在发酵前未被去除的情况下。因此，我们检查了黑色曲霉（Aspergillus niger）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）和托鲁氏红孢菌（Rhodosporidium toruloides）对丁胺预处理杨木所得水解物的耐受性（图1）。图1

评估丁胺预处理杨木水解物的微生物毒性。这些生物被接种在不同浓度的水解物中，用CM稀释对于黑色曲霉（A），LB稀释对于铜绿假单胞菌（B），YPD稀释对于托鲁氏红孢菌（C）。在摇瓶中培养3天后，通过黑色曲霉的菌丝干重或铜绿假单胞菌和托鲁氏红孢菌的OD600来评估生物量生成。数据代表平均值，误差条代表三次生物重复实验的标准偏差（n = 3）。评估了一系列水解物浓度（10–50%，v/v在对照培养基中）下的生长反应，以确定特定菌株的毒性阈值，并确定水解物是否适合微生物转化。评估了高达90% v/v的高浓度水解物，但它们不支持生长，因此被排除。如图1所示，三种菌株表现出明显的不同耐受性。黑色曲霉表现出中等的耐受性（图1A）。在10%的水解物浓度下，该真菌显示出比对照组更高的生物量产生，表明稀释后的水解物中的额外营养物质可以最初刺激生长。然而，在20%的水解物浓度下生长显著下降，在30%浓度下几乎完全被抑制。铜绿假单胞菌即使在相对较高的水解物浓度下也能保持稳健的生长（图1B）。与黑色曲霉类似，在10%的水解物中获得的OD600值超过了对照组，表明低水平的水解物提供了铜绿假单胞菌可以利用的额外营养物质。在20%浓度下，生长仍然相当，与10%水解物相比生物量持续增加。在30%到50%的水解物之间，铜绿假单胞菌的生物量急剧下降，表明超过某个阈值浓度后，抑制性化合物开始降低该菌株的活力。最后，托鲁氏红孢菌即使在最低的水解物浓度下也无法生长（图1C），表明这种酵母对水解物中的抑制性化合物特别敏感。总体而言，这些结果突出了不同菌株对水解物耐受性的差异，其中铜绿假单胞菌表现出最高的耐受性，而托鲁氏红孢菌对丁胺处理的杨木的耐受性最低。

鉴于在原始水解物中观察到的菌株特异性生长抑制，我们分析了它们的化学组成以识别潜在的抑制性化合物。即使这些化合物的量很低，也可能破坏膜完整性、干扰细胞代谢或加剧氧化还原应力。生物质水解物的LC-MS分析（图2和表S1）鉴定出残留的丁胺（0.8克/升）及其乙酰化衍生物丁基乙酰胺（7.1克/升），以及几种已知具有微生物毒性的酚类化合物（<1克/升），包括4-羟基苯甲酸、丁香酸和香草酸。与先前的结果一致，在预处理条件下发生了酰胺化反应，形成了这些芳香族的酰胺衍生物（在这种情况下是N-丁基-4-羟基苯甲酰胺）。因此，使用活性炭作为吸附解毒剂来降低这些抑制物的浓度。活性炭处理导致水解物明显褪色（图S1）。随后的LC-MS定量确认，包括天然形式和酰胺化形式的酚类化合物几乎完全被去除（图2）。丁基乙酰胺的浓度减少了超过94%，降至0.4克/升，而丁胺的浓度减少了大约27%，降至0.6克/升。重要的是，经过活性炭处理后，可发酵糖的浓度保持不变（图2A）。这一结果与之前的报告一致，这些化合物具有比碳水化合物（如呋喃和酚类）更高的疏水性，因此被选择性地吸附。

图2

活性炭处理对水解物组成的影响。未经处理的水解物（Hyd，灰色）和活性炭处理后的水解物（Hyd w/charcoal，白色）。(A) 未经处理的水解物（Hyd）和活性炭处理后的水解物（Hyd w/charcoal）中的糖浓度（葡萄糖和木糖）。(B) n-丁胺和n-丁基乙酰胺的残留溶剂浓度。(C) 未经处理的水解物中的酚类化合物，显示几种酚类抑制剂显著减少或完全去除。ND = 未检测到；n = 1。由于解毒后的水解物仅含有残留水平的丁胺（0.61克/升）和丁基乙酰胺（0.42克/升），我们评估了这些化合物对黑色曲霉（Aspergillus niger）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）和托鲁氏红孢菌（Rhodosporidium toruloides）的生物抑制效应（图3）。将丁胺和丁基乙酰胺的残留浓度与每种菌株的IC50值进行了比较。在活性炭处理之前，丁基乙酰胺的浓度（7.1 g L^-1）超出了所有三种菌株的IC50值：A. niger为1.58 g L^-1，P. putida为3.00 g L^-1，R. toruloides为1.47 g L^-1，这表明它可能是导致水解物毒性的因素之一。相比之下，丁胺的浓度为0.8 g L^-1，虽然超过了R. toruloides的IC50值（0.67 g L^-1），但仍远低于A. niger（4.04 g L^-1）和P. putida（6.32 g L^-1）的抑制水平。由于R. toruloides对丁胺和丁基乙酰胺都具有高度敏感性，这可能解释了为什么即使在最低浓度的未过滤水解物中它也无法生长（见图1C）。经过活性炭处理后，丁基乙酰胺的浓度降至0.4 g L^-1，丁胺的浓度降至0.6 g L^-1。这些处理后的浓度都低于所有三种微生物的IC50阈值，表明解毒有效地减轻了化学抑制，并提高了微生物与水解物的兼容性。尽管我们采用了综合分析方法来识别和量化已知的抑制剂，但由于水解物的化学复杂性，我们无法完全排除可能存在未被检测到的其他有毒化合物。

### 丁胺和丁基乙酰胺的IC50测定

A. niger（摇瓶）和P. putida、R. toruloides（微生物反应器平板）分别在含有逐渐增加浓度的丁胺（A–C）和丁基乙酰胺（D–F）的化学定义培养基中生长。对于A. niger，144小时后测定生物量（见表S2和S3）以确定IC50值；而对于P. putida和R. toruloides，则通过整合56小时内的生长曲线来确定IC50值（见图S2）。回归模型和相应的IC50值是用五参数逻辑模型确定的。数据代表平均值，误差条代表三次生物学重复测量的标准偏差（n = 3）。

### 解毒后的进一步评估和优化

经活性炭处理后的水解物被进一步评估并优化为三种工程菌株的培养基。为了识别特定物种的限制因素，逐步向过滤后的水解物中添加营养补充剂。作为对照，每种菌株都在含有与水解物等量葡萄糖和木糖的模拟培养基中培养。模拟培养基缺乏生物质衍生水解物的化学复杂性，从而可以直接比较不同培养基中营养供应和发酵性能的特定影响。

### 酢酸生产

使用模拟或纯水解物培养的A. niger JJ1菌株，依次添加肽胨（N）、硫酸镁（Mg）、磷酸一钾和磷酸二钾（P）以及微量元素（TE；FeSO4和NaCl）。所有培养基都包含CaCO3以支持pH缓冲并促进有机酸的积累。在模拟系列中，随着营养物质的添加，苹果酸的产量和生物量逐渐增加（见图4A和C）。基础模拟条件下的产量和生物量较低（分别为6.8 g L^-1和1.3 g L^-1），而添加肽胨后苹果酸的产量显著提高（达到定义培养基最大产量的95%）。硫酸镁和磷酸的添加对苹果酸或生物量的增加没有显著影响。只有糖的消耗量受到磷酸添加的积极影响。最后添加微量元素（Mock + N + Mg + P + TE）后，产量达到了定义培养基中的最大值，分别为33.4 g L^-1的苹果酸和8.0 g L^-1的生物量。有趣的是，在所有模拟条件下，糖的消耗都不完全，尤其是木糖的利用明显受限。

### 微生物生长、糖消耗和生物产物的积累

在含有葡萄糖和木糖的模拟培养基（Mock，左侧图表）或经丁胺预处理的水解物（Hyd，右侧图表）中，逐步添加营养物质进行培养。上方：通过依次添加肽胨（N）、硫酸镁（Mg）、磷酸（P）和微量元素（TE）后，A. niger的苹果酸产量。（A和B）苹果酸的产量；（C和D）144小时后的糖利用情况和细胞干重（CDW）。中间：通过依次添加氯化铵（N）、硫酸钠（S）、磷酸（P）和微量元素（TE）后，Pseudomonas putida的异戊二烯产量。（E和F）异戊二烯的产量；（G和H）72小时后的糖利用情况和最终细胞密度（OD600）。下方：通过依次添加氯化铵（N）、硫酸钠（S）、酵母氮源（YNB）和磷酸（P）后，Rhodosporidium toruloides的双観烯产量。（I和J）双観烯的产量；（K和L）144小时后的糖利用情况和最终细胞密度（OD600）。白色条形表示初始总糖浓度，灰色和黑色条形分别表示消耗的葡萄糖和木糖量。对于A. niger和R. toruloides使用纯（100%）水解物，对于P. putida使用稀释至60%的水解物。数据代表平均值，误差条代表三次生物学重复测量的标准偏差（n = 3）。相比之下，水解物系列促进了更高的总体产量和生物量积累（见图4B和D）。有趣的是，即使不添加任何补充剂，水解物也能支持生产15.6 g L^-1的苹果酸和5.6 g L^-1的生物量，表明生物质衍生的基质中含有除了葡萄糖和木糖之外的有益成分或额外的碳源。例如，已知水解物中的氨基酸可以提高微生物生物产物的浓度。添加肽胨（Hyd + N）后，产量大幅提升至47.0 g L^-1的苹果酸和11.2 g L^-1的生物量，几乎完全消耗了葡萄糖，并且消耗了大量的木糖。进一步添加硫酸镁、磷酸一钾和磷酸二钾以及微量元素后，产量和生物量分别超过52.0 g L^-1和13.0 g L^-1，比定义培养基高出53%。在模拟培养基和水解物中，添加肽胨时苹果酸产量的提升最为明显，表明对于A. niger来说，获取复杂的营养物质，特别是有机氮源是一个关键的限制因素。在定义培养基和复杂水解物中，通过补充其他营养物质所取得的适度增长强调了A. niger的固有稳健性，表明即使在营养贫乏且因此成本效益较低的配方中也能实现较高的苹果酸产量。

### P. putida的异戊二烯产量

使用一种经过工程改造、能够利用木糖的异戊二烯生产菌株（IY1449SOT）研究了营养物质添加对P. putida底物转化能力的影响。由于我们发现这种浓度的水解物最适合P. putida的生长和异戊二烯的生产（见图S3），因此将水解物稀释至其原始浓度的60%。模拟培养基中的葡萄糖和木糖浓度与稀释后的水解物相匹配，作为定义的基准。两种培养基都逐步添加了氯化铵（N）、硫酸钠（S）、盐类（P；PO43^-和NaCl）以及微量元素（TE），这些成分是基于P. putida常用的M9最小培养基组成的。在模拟系列中，P. putida在前三种条件下的表现较差（Mock、Mock + N、Mock + N + S），OD600值低于1.0，异戊二烯产量低于18 mg L^-1，72小时内的糖消耗量也很少（葡萄糖<8 g L^-1；木糖<1.5 g L^-1）（见图4E和G）。添加磷酸（Mock + N + S + P）后，性能显著提高，生物量达到OD600 = 1.5，糖的消耗量增加（葡萄糖：10.8 g L^-1；木糖：5.9 g L^-1），异戊二烯产量达到64.8 mg L^-1。添加微量元素（Mock + N + S + P + TE）后，生物量产量进一步提高（OD600 = 4.4），而异戊二烯产量略有下降至44.8 mg L^-1。在水解物系列中（见图4F和H），在没有添加任何补充剂的情况下，P. putida的生长和产物形成都很低（OD600 = 0.2；异戊二烯 = 25.4 mg L^-1）。添加NH4Cl（Hyd + N）后，性能得到改善，OD600上升到19.9，异戊二烯产量达到100.7 mg L^-1，同时糖的消耗量也增加（葡萄糖：27.3 g L^-1；木糖：16.8 g L^-1）。随后添加Na2SO4（Hyd + N + S）导致生长（OD600 = 11.6）和异戊二烯产量（86.0 mg L^-1）略有下降。然而，进一步添加磷酸和微量元素（Hyd + N + S + P + TE）后，性能得到进一步提升，异戊二烯产量达到最高值的221.4 mg L^-1，OD600为29.5，同时消耗了超过40 g L^-1的葡萄糖和13 g L^-1的木糖。这些结果表明，对于P. putida而言，生物质衍生的基质支持的产量明显高于定义的糖溶液（3.4倍）。在单独使用Hyd + N的条件下，异戊二烯的产量是任何模拟条件的1.6倍，这突显了在水解物作为功能性发酵基础时的价值。

### Rhodosporidium toruloides的双観烯产量

还评估了经过丁胺预处理的杨木水解物的营养潜力，使用了一种在100%水解物和模拟培养基中生长的双観烯生产菌株R. toruloides。使用模拟培养基时，R. toruloides在纯葡萄糖和木糖上无法生长或有效生产双観烯（OD600 = 3.4；11.4 mg L^-1）（见图4I和K）。逐步添加营养物质后，生长和双観烯产量逐步增加：添加NH4Cl后，生长 OD600达到4.4，双観烯产量达到12.7 mg L^-1；添加Na2SO4后，这些值进一步改善（OD600 = 6.4，21.7 mg L^-1）。添加YNB后，OD600达到9.6，双観烯产量达到38.2 mg L^-1。最后添加磷酸后，在模拟系列中获得了最佳性能（OD600 = 31.1；167.8 mg L^-1）。尽管如此，糖的消耗仍然不完全，表明在化学定义的培养基配方中存在营养限制。即使在没有营养物质补充的情况下，水解物也支持了适度的生长（OD600 = 28.5）和双観烯产量（77.8 mg L^-1）（见图4J和L）。然而，在这种条件下，糖的消耗仍然不完全，表明相对于最初的糖浓度，营养物质的可用性有限。值得注意的是，添加NH4Cl（Hyd + N）后，生长（OD600 = 57.9）和双観烯产量（491.1 mg L^-1）都得到了提升，伴随了糖的完全消耗。这表明氮的限制是主要瓶颈。进一步添加Na2SO4、YNB和磷酸后，产量继续提高，最终产量达到562.9 mg L^-1，生物量达到52.5（OD600 = 52.5），证实这些添加进一步增强了生物转化过程。

### 微生物宿主在水解物中的比较性能

本研究使用的三种工程微生物在过滤前后的水解物培养中表现出不同的行为。在过滤之前，水解物对微生物的毒性不同，其中P. putida最为耐受，而R. toruloides最为敏感。由于这三种微生物能够分解和耐受许多木质素衍生的芳香族化合物，并且在预处理过程中没有产生糠醛或5-羟甲基糠醛，观察到的毒性部分可以归因于残留的丁胺及其衍生物丁基乙酰胺。图3中的剂量-反应实验一致表明P. putida是最耐受的微生物，其次是A. niger和R. toruloides。有趣的是，当通过活性炭过滤去除有毒化合物后，P. putida是在60%水解物浓度下达到最大细胞密度、底物消耗和产物积累的唯一微生物，而其他微生物则在100%水解物浓度下才能达到这些指标。这表明可以探索其他工艺配置，如分批进料法，以保持糖浓度在一定阈值以上，避免由于渗透压导致的生长抑制，这对像P. putida这样的细菌来说是已知的限制因素。

尽管活性炭过滤在工业上被广泛使用并且可以大规模应用，但也可以通过调整生物质预处理和溶剂去除过程中的反应条件来最小化水解物的毒性。例如，使用较为温和的反应条件可以防止或减少导致丁基乙酰胺形成的酰胺化反应的发生。同样，在较小的反应器规模下，使用其他胺类官能化溶剂和去除方法时，也报告了较高的溶剂去除率（>98%）。16,40 采用蒸馏或其他溶剂回收技术可以提高丁胺的去除效果，从而可能改善水解产物的生物相容性，并允许溶剂再次使用。总体而言，本研究中生成的白杨木水解物在经过炭处理后支持微生物生长，所有菌株仅需要补充氮源即可实现比未补充时更高的生长和生物产物产量。通过微生物发酵利用胺预处理水解物中的高浓度糖分，提供了一种重要的替代方法，该方法结合了简单的溶剂蒸发和水解物处理方法，并使用了经过工程改造的菌株，从而能够积累多种生物产物，并进一步强化工艺。A. niger 在生产苹果酸方面表现出色（高达52 g L−1），特别是在存在蛋白胨和无机盐的条件下，这突显了其作为从木质纤维素原料中合成有机酸的真菌底盘的潜力。值得注意的是，即使不进行补充，它也能对水解物基质产生积极反应，表明其具有一定的内源性营养吸收能力。P. putida 对残留抑制剂的耐受性最高，即使在简单的NH4Cl补充下也能实现显著生长（OD600 > 20）和产物形成（>100 mg L−1）。它能够快速消耗葡萄糖和木糖，并且具有强大的应激反应系统，使其成为直接发酵丁胺处理过的生物质水解物的有希望的候选菌株。当水解物仅提供NH4Cl时，R. toruloides 产生的细胞密度和双萜醇含量与完全补充后的水解物相当。经过脱毒和补充的水解物能够实现高密度生长（OD600 = 52），并且通过相对简单的营养添加就能完全转化糖分。这些特性使得R. toruloides成为在调整过营养的木质纤维素培养基中生产萜类化合物的理想宿主。

结论

我们的发现表明，经过丁胺处理的白杨木水解物是一种强劲且化学成分丰富的原料，只需补充NH4Cl就能达到或超过在特定培养基中可实现的生物产物产量。分解过程产生了高浓度的糖分、较高的糖化产率和溶剂回收效率；然而，水解物中含有足够高浓度的丁胺和丁酰酰胺，可能会对微生物宿主产生毒性。对水解物进行炭处理显著提高了其与所有生物体的兼容性，使它们能够在批次模式下吸收高达100 g L−1的糖分。这种工艺性能的差异强调了仔细选择预处理溶剂和反应条件的重要性，这些条件不仅能够最大化糖分的释放，还能最小化像酰胺这样的有毒化合物的形成。重要的是，经过脱毒的水解物成功支持了多种微生物平台，证明了该工艺的多功能性及其在不同发酵系统中的广泛应用潜力。

化学品和植物生物质原料

除非另有说明，所有化学品均从Sigma-Aldrich购买（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。作为木质纤维素原料使用了杂交白杨（Populus alba × grandidentata）。树木在之前描述的条件下在温室中生长。41 生物质首先使用商用木屑机被粉碎成木屑，在 knife mill（型号4，Thomas Scientific，美国新泽西州Swedesboro）中研磨，并筛分至2毫米的均匀颗粒大小，以确保预处理前的一致性。

生物质预处理

预处理是通过将白杨生物质以15 wt%的固体负载与纯丁胺（以下称为丁胺）（85 wt%）混合，在10 L反应器（4555-58，Parr Instruments Company，美国伊利诺伊州Moline）中进行反应，然后在140 °C下加热3小时来进行的。由于反应规模的原因，仅进行了一次预处理操作。预处理后，将容器冷却至室温，并将预处理混合物转移到特氟龙托盘上。然后在80 °C下在家用真空环境中干燥12小时。通过剩余的干生物质量来确定通过蒸发去除的溶剂量。

酶解和水解物处理

在将pH调整到5后，通过加入水和72%硫酸进行干生物质的酶解处理，随后加入商业纤维素酶和半纤维素酶混合物Cellic® CTec3和HTec3（Novozymes，美国北卡罗来纳州Franklinton）。首先将CTec3和HTec3混合物按9∶1（v/v）的比例混合，然后在500 mL玻璃瓶中以每克生物质30毫克的最终浓度加入，在旋转平台的恒温器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州Waltham）中于50 °C下进行72小时的糖化处理。将水解物与富含木质素的固体部分分离，并用0.45 µm Nalgene®过滤器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州Waltham）过滤。然后，将水解物与1/10体积的40–60目活性炭（Fluka，美国）混合，并进行10分钟的超声波处理。让活性炭在室温下沉淀，然后将上清液通过0.2 µm Nalgene®过滤器（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州Waltham）过滤。

微生物菌株

本研究中使用的菌株和质粒序列已存放在Joint BioEnergy Institute公共注册库中，可以通过以下ID号码访问：A. niger JJ1 (JBx_275419)，R. toruloides GB2 (ABFPUB_000311) 和 P. putida IY1449SOT (JBx_257853)。菌株基因型和特征列表见表S4。A. niger JJ1通过转化来自Aspergillus oryzae的C4-二羧酸转运基因进行工程改造，该基因经过密码子优化，并由A. niger的gpdA启动子控制。42 R. toruloides GB2通过基因组整合多个异源双萜醇合成酶拷贝来进行α-双萜醇的生产。43 P. putida IY1449SOT通过基于基因组规模代谢建模的七次定向基因敲除以及IPP旁路和木糖途径的优化进行异戊二烯的生产。

在水解物中的微生物生长比较

通过评估其对微生物生长的影响来评估丁胺预处理后的白杨木酶解产物的毒性。对于A. niger，使用完整培养基（CM）作为稀释剂。CM按照之前描述的方法制备。44 对于P. putida，用水解物在LB培养基中稀释；而对于R. toruloides，则使用YPD培养基作为稀释剂。A. niger菌株在30 °C下的CM琼脂平板上维持以进行孢子制备。孢子通过用5–10 mL无菌0.4% Tween 80（聚氧乙烯-山梨聚糖单油酸酯）洗涤来收集。大约1 × 10^8个A. niger孢子被加入250 mL的Erlenmeyer烧瓶中的CM中。培养物在30 °C下以200 rpm的速度培养过夜。菌丝体通过Miracloth过滤并用无菌水冲洗后收集。菌丝体转移到250 mL的Erlenmeyer烧瓶中的CM中，并在30 °C、200 rpm下培养3天。通过真空过滤将菌丝体收集在预先称重的滤纸上，并用蒸馏水冲洗后，确定菌丝体的干重。随后，在冻干机中冷冻干燥后确定干重。从单个菌落中提取的P. putida和R. toruloides细胞在LB和YPD培养基中以200 rpm和30 °C培养过夜。过夜培养物用于接种24孔培养板（Costar，Corning，美国纽约州）中的培养基，工作体积为1 mL，起始光密度OD600 = 0.1。培养物在30 °C下以200 rpm培养3天。

丁胺和丁酰酰胺的毒性测定

每种生物体都暴露于一系列对数间隔的丁胺和丁酰酰胺浓度（表S5）下，以评估化合物的毒性。选择的浓度覆盖了亚抑制到完全抑制的水平，从而能够为每种物种提供稳健的曲线拟合。A. niger的毒性测定在含有1 × 10^8孢子的250 mL Erlenmeyer烧瓶中进行，孢子预先在CM中培养过夜，然后转移到化学定义的培养基中，在30 °C和200 rpm下培养7天。生长性能通过终点干重来确定，并相对于对照组（0 g L−1丁胺或丁酰酰胺）进行标准化。A. niger的生长培养基含有67 g L−1葡萄糖、33 g L−1木糖、6 g L−1 Bacto蛋白胨、0.10 g L−1 MgSO4·7H2O、0.15 g L−1 KH2PO4、0.15 g L−1 K2HPO4、0.10 g L−1 CaCl2·2H2O、0.005 g L−1 FeSO4·7H2O和0.005 g L−1 NaCl。P. putida和R. toruloides的毒性测定在48孔FlowerPlates（M2P-48-B，m2p-labs，美国纽约州Islandia）中使用微生物反应器系统（BioLector II Pro，m2p-labs，德国Baesweiler）进行。培养物在化学定义的培养基中培养，每种条件测试三次。通过在线光散射在620 nm处监测生物质积累。通过整合生长曲线直到56小时来量化生长性能，并将得到的曲线下面积（AUC）值相对于对照组（0 g L−1丁胺或丁酰酰胺）进行标准化。P. putida在含有67 g L−1葡萄糖、33 g L−1木糖、10 g L−1 NH4Cl、10 g L−1 Na2SO4、1× M9盐、4 mM MgSO4、0.2 mM CaCl2和1×痕量金属溶液（Teknova，美国Hollister，CA）的培养基中培养。R. toruloides在含有67 g L−1葡萄糖、33 g L−1木糖、1.7 g L−1酵母氮基础（YNB；不含AA和(NH4)2SO4）的培养基中培养。使用五参数逻辑回归模型确定每种生物体的丁胺和丁酰酰胺的半数最大抑制浓度（IC50）。化合物在表S3中列出的范围内进行测试。

生物产物积累实验

A. niger孢子通过用5–10 mL无菌0.4% Tween 80洗涤来收集。大约使用1 × 10^8个孢子进行接种。对于苹果酸生产实验，根据实验条件逐步向丁胺预处理的水解物中添加定义的营养物质。补充物包括80.00 g L−1的CaCO3、6 g L−1 Bacto蛋白胨、0.10 g L−1 MgSO4·7H2O、0.15 g L−1 KH2PO4、0.15 g L−1 K2HPO4、0.10 g L−1 CaCl2·2H2O、0.005 g L−1 FeSO4·7H2O和0.005 g L−1 NaCl。准备了与糖分匹配的模拟培养基（70 g L−1葡萄糖、30 g L−1木糖），并同时添加相同的组合作为对照。苹果酸生产实验在125 mL的Erlenmeyer烧瓶中进行，并在30 °C、200 rpm的platform shaker（INFORS HT Multitron 2，美国马里兰州Annapolis Junction）中培养。将单个P. putida菌落接种到含有卡那霉素（50 μg mL−1）的1 mL LB培养基中，并在30 °C、1000 rpm和80%湿度的platform shaker（INFORS HT Multitron 4，美国马里兰州Annapolis Junction）中培养过夜。过夜培养物用于接种M9-NREL培养基，初始OD600为0.1。M9-NREL培养基含有10 g L−1葡萄糖、10 g L−1木糖、1× M9盐、2 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、1×痕量金属溶液（Teknova，美国Hollister，CA）。对于异戊二烯生产实验，丁胺预处理的水解物稀释至60%（v/v），并根据实验条件逐步添加定义的营养物质。补充物包括10 g L−1 NH4Cl、10 g L−1 Na2SO4、1× M9盐、4 mM MgSO4、0.2 mM CaCl2和1×痕量金属溶液（Teknova）。准备了与糖分匹配的模拟培养基（42 g L−1葡萄糖、18 g L−1木糖），并同时添加相同的组合作为对照。为了捕获产物，在48孔flower plates（M2P-48-B，m2p-labs，美国纽约州Islandia）中加入十五烷覆盖层（占培养体积的20%），并在30 °C、1000 rpm和80%湿度下培养。R. toruloides的预培养物从冷冻库存中接种到含有1.7克/升YNB、35克/升葡萄糖、15克/升木糖、5克/升(NH4)2SO4和100毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH = 6.2）的化学定义培养基中，并在30°C、1000转/分钟和80%湿度的环境条件下，在平台振荡器（INFORS HT Multitron 4，美国马里兰州安纳波利斯珊瑚角）中过夜培养。对于双氢萜烯的生产实验，预先用丁胺处理过的水解物根据实验条件逐步添加了定义的营养物质组合，包括1.7克/升YNB、5克/升NH4Cl和5克/升Na2SO4以及100毫摩尔磷酸盐缓冲液（pH = 6.2）。同时准备了糖分匹配的对照培养基（70克/升葡萄糖、30克/升木糖），并添加相同的组合作为直接比较的对照。为了捕获双氢萜烯，添加了占培养体积20%的十五烷覆盖层。每种条件都是从初始OD600为0.1的预培养物开始接种的。生产实验在48孔花盘（M2P-48-B，美国纽约州岛尼亚）中进行，并使用Aeraseal透气密封材料（Excel Scientific，美国加利福尼亚州维克托维尔）密封，在30°C、1000转/分钟和80%湿度下进行。

**分析方法**

**糖分分析**：样品通过0.45微米聚丙烯滤板（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）过滤，使用5微升的样品注射量。葡萄糖和木糖使用配备Aminex HPX-87H柱（BioRad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）的Agilent Technologies 1200系列HPLC系统进行定量分析，分析过程中保持温度在60°C。流动相为4毫摩尔硫酸，流速为0.6毫升/分钟。酚类化合物的分析采用了之前描述的方法。丁胺及其相关酰胺使用Kinetex Phenyl-hexyl柱（内径4.6毫米，柱长100毫米，固定相颗粒大小2.6微米，Phenomenex公司，美国加利福尼亚州托伦斯）通过Agilent Technologies 1260 Infinity HPLC系统分离。HPLC样品托盘、柱室和注射量分别设置为6°C、50°C和1微升。HPLC溶剂A和B分别为0.4%甲酸（化学纯度≥98%，Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯）在LC-MS级水中（Honeywell Burdick & Jackson，美国北卡罗来纳州夏洛特）和0.4%甲酸在LC-MS级甲醇中（Honeywell Burdick & Jackson，美国北卡罗来纳州夏洛特）。梯度洗脱过程如下：2.0分钟内从5%溶剂B线性增加到25% B，1.0分钟内从25% B增加到90% B，保持在90% B 4.5分钟，然后从90% B线性减少到5% B 0.3分钟，最后保持在5% B 2分钟。流速在7.5分钟内保持0.6毫升/分钟，然后在0.3分钟内从0.6毫升/分钟增加到1.0毫升/分钟，最后保持在1.0毫升/分钟2分钟。总LC运行时间为9.8分钟。HPLC系统与Agilent Technologies 6520四极杆飞行时间质谱仪相连。对于电喷雾离子化（ESI）分析，干燥气和雾化气体分别设置为11升/分钟和30 psi，整个过程中使用340°C的干燥气体温度。ESI在负离子模式下进行，毛细管电压为3500伏特。碎片化器、斯基默器和OCT 1 RF Vpp电压分别设置为100伏特、60伏特和400伏特。数据采集通过Agilent Technologies MassHunter工作站（版本8）进行，数据分析通过MassHunter Qualitative Analysis（版本6）、Profinder（版本8）和MassHunter Quantitative Analysis（版本10）完成。分析物通过外部校准曲线进行定量。苹果酸浓度使用配备Aminex HPX-87H柱（BioRad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）的Agilent Technologies 1200系列HPLC系统进行定量，分析过程中保持温度在50°C，使用氘灯和二极管阵列检测器在210纳米处收集信号。流动相为4毫摩尔硫酸，流速为0.55毫升/分钟。分析前样品通过0.45微米聚丙烯滤板（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）过滤，使用5微升的样品注射量。双氢萜烯浓度通过将十五烷覆盖层中的2微升样品与含有十六烷（50毫克/升）的48微升乙酸乙酯混合进行定量。样品（1微升）通过GC-MS（7890A GC；5975C MS；Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）进行分析，使用HP-5MS柱（30米×0.25毫米内径，0.25微米膜厚；Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。GC烘箱温度程序如下：首先保持70°C 1分钟，然后以30°C/分钟的速度升高到220°C，然后在220°C保持2分钟。进样温度设置为200°C。最终滴度从覆盖层反算到水相，以反映培养基中的浓度。异戊二烯醇浓度通过使用20%十五烷覆盖层的P. putida培养物进行测定。 Culture物在18000g下离心以分离有机相和水相。十五烷覆盖层的10微升样品用含有1-丁醇（30毫克/升）的990微升乙酸乙酯稀释作为内标。样品（1微升）通过气相色谱-质谱（GC-MS；7890A GC；5975C MS；Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）进行分析，使用DB-WAX柱（15米×0.32毫米内径，0.25微米膜厚；Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。GC烘箱温度程序如下：首先以15°C/分钟的速度升高到40°C，然后以40°C/分钟的速度升高到230°C，然后在230°C保持2分钟。进样温度设置为200°C。最终滴度从覆盖层反算到水相，以反映培养基中的浓度。所有定量化合物的校准曲线使用线性回归建立，用于确定分析样品中的浓度。

**统计分析**：统计分析使用OriginPro 2025（OriginLab，美国马萨诸塞州北安普顿）进行。除非另有说明，每个实验都进行了三次技术重复（来自相同的预培养物）。误差条表示平均值的标准偏差，表格和图中用±表示。对于毒性检测，IC50值使用OriginPro 2025中的五参数逻辑回归模型通过非线性曲线拟合确定。

**作者贡献**

**概念化**：J. J.、D. D.、J. P.、B. A. S.、J. K.、A. R.；**数据管理**：J. J.、D. D.、V. R. P.、E. A. T.、E. E. K. B.、C. A. B.、M. M. R.；**正式分析**：J. J.、D. D.、V. R. P.、E. A. T.、E. E. K. B.、C. A. B.、M. M. R.、E. K.、J. P.；**资金获取**：B. A. S.；**调查**：J. J.、D. D.、V. R. P.、E. A. T.、E. K.、J. P.；**方法学**：E. E. K. B.、C. W. K.、V. E. G.、E. R. S.、A. E.、H. C.、T. S. L.、J. K.；**项目管理**：B. A. S.、J. K.、A. R.；**资源**：J. P.、C. W. K.、V. E. G.、E. R. S.、A. E.、H. C.、T. S. L.、J. M. G.；**监督**：E. R. S.、H. C.、J. M. G.、B. A. S.、J. K.、A. R.；**写作——原始草稿**：J. J.、D. D.；**写作——审阅与编辑**：J. J.、D. D.、J. K.、V. E. G.、A. R.

**利益冲突**

B. A. S.在Illium Technologies、Caribou Biofuels和Erg Bio中持有财务利益。所有其他作者声明没有可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。

**数据可用性**

支持本文的数据已作为补充信息（SI）的一部分提供。补充信息可获取，请参见DOI：https://doi.org/10.1039/d5gc06335c。

**致谢**

在联合生物能源研究所进行的工作得到了美国能源部科学办公室生物与环境研究计划的支持，通过劳伦斯伯克利国家实验室与美国能源部之间的合同DE-AC02-05CH11231。美国政府通过接受文章发表，承认美国政府保留非独家、已支付、不可撤销的、全球性的许可，以出版或复制这份手稿的已发表形式，或允许他人出于美国政府的目的进行复制。本文中可能表达的任何主观观点或意见不一定代表美国能源部或美国政府的观点。桑迪亚国家实验室是由国家技术工程解决方案公司（National Technology & Engineering Solutions of Sandia, LLC）管理和运营的多任务实验室，该公司是霍尼韦尔国际公司（Honeywell International Inc.）的全资子公司，根据合同DE-NA0003525为美国能源部的国家核安全管理局服务。太平洋西北国家实验室由Battelle根据合同DE-AC05-76RL01830为美国能源部运营。图形摘要使用BioRender创建。Dietrich, D. (2025) https://BioRender.com/0cxploi。

**参考文献**

† 这些作者对这项工作做出了同等贡献。