**摘要**
由**Vibrio anguillarum**引起的弧菌病爆发一直是虹鳟（Oncorhynchus mykiss）水产养殖业持续面临的挑战。然而，关于土耳其野外菌株的种群结构信息一直缺乏。在此，我们首次系统地对从土耳其六个主要水产养殖区虹鳟养殖场收集的23株**V. anguillarum**分离株进行了血清型、蛋白质组学和基因组学分析。基于微凝集的血清学分析，并结合ELISA对高免疫血清的检测，发现O1血清型明显占主导地位，而分离株V12表现出非凝集性的、非典型的O抗原谱型。蛋白质谱分析（SDS-PAGE）和免疫印迹显示这些分离株的全细胞蛋白质模式基本一致，但在V18和V21分离株中检测到了14、18和40 kDa处的独特免疫原性条带。长读长全基因组测序结果显示，大多数土耳其分离株属于全球O1谱系，而V12、V25和V28分离株则位于更远的分支上。比较基因组学分析表明，这些菌株具有保守的核心毒力基因集（RTX毒素、铁载体和铁吸收系统、运动性和黏附因子、VI型分泌系统），但在辅助基因位点（如anguibactin和T6SS-I）上存在菌株间差异。对虹鳟的实验感染表明，不同分离株之间的毒力存在显著差异（p < 0.05），其中V18分离株的毒力最强，V15分离株中等，V12分离株的毒力最弱。通过阐明血清型、免疫原性蛋白质谱型、毒力基因库和体内致病性之间的关系，本研究提供了土耳其**V. anguillarum**分离株的抗原性和基因组多样性的全面概述。值得注意的是，V18和V21分离株因其高毒力和独特的免疫原性特征而被确定为进一步疫苗评估的有希望的候选菌株，为开发针对弧菌病的血清型特异性疫苗策略提供了科学基础。
**1 引言**
全球范围内，天然鱼类资源的减少和人口的增长使得水产养殖成为动物蛋白越来越重要的来源。然而，集约化生产系统促进了传染病的传播，尤其是细菌性传染病，导致高死亡率、治疗成本增加以及产品质量下降（FAO 2022）。在这些病原体中，**Vibrio anguillarum**（同义词Listonella anguillarum）被认为是影响淡水、海洋和半咸水环境中多种养殖鱼类的最重要的革兰氏阴性细菌之一（Zorrilla等人2003；Frans等人2011；Mohamad等人2019）。如今，**V. anguillarum**仍然是欧洲、亚洲、美洲和地中海盆地经济重要鱼类（如虹鳟、大西洋鲑鱼、海鲈和海鲷）中最常报告的细菌病原体之一。该菌通常引起急性出血性败血症，其特征是外部溃疡、脾肿大、腹部膨胀和内出血，并且病情进展迅速，导致高死亡率（Toranzo等人2005；Salleh等人2023）。迄今为止，已描述了23种**V. anguillarum**血清型，其中O1、O2a和O2b血清型与临床爆发最为相关（Pedersen等人1999；Plumb 2018）。这些血清型在抗原结构和逃避宿主防御的策略上存在差异；例如，O1血清型的脂多糖（LPS）O抗原有助于抵抗吞噬作用，并促进更侵袭性的感染过程（Naka和Crosa 2011；Lindell等人2012）。传统上使用抗菌疗法来控制弧菌病，但水产养殖系统中抗菌素耐药性（AMR）的出现和传播已成为全球性的关注问题（Schar等人2020；Duman等人2025）。这些发现凸显了迫切需要替代的、针对特定场所的预防措施。使用体内生物发光成像的实验研究表明，**V. anguillarum**在感染过程中会迅速定植于鱼皮肤和肠道黏膜，且LPS O抗原对于逃避上皮细胞吞噬作用和抵抗溶菌酶及抗菌肽至关重要（Weber等人2010；Lindell等人2012）。这些研究表明，识别关键毒力决定因子并利用减毒菌株作为活疫苗候选物是控制弧菌病的互补策略。在可用的控制措施中，疫苗接种被认为是最有效的方法之一，可以提供长期保护，同时减少对抗生素的需求（Colquhoun和Lillehaug 2014；Monaghan等人2016）。然而，商业疫苗的有效性可能会受到当地野外菌株遗传和抗原多样性的影响。在土耳其，先前的研究已经证明了**V. anguillarum**菌株在表型和基因型上的显著变异（Onuk等人2018），这突显了需要基于当地流行血清型和基因型的场所特异性疫苗。因此，本研究对2013至2023年间从土耳其六个地区的水产养殖场分离的**V. anguillarum**菌株进行了全面的表型（溶血类型、蛋白酶和DN酶活性）、血清学（凝集试验和ELISA）、分子（毒力和抗菌素耐药性基因检测、全基因组测序）和抗原（SDS-PAGE和Western blot蛋白质谱）分析，并评估了其体内毒力。我们假设在土耳其虹鳟养殖场中传播的**V. anguillarum**菌株表现出显著的血清型和基因组多样性，将血清学、蛋白质组学和基因组数据与感染结果相结合，将有助于识别本地疫苗候选菌株，并支持开发针对土耳其弧菌病的有效、场所特异性疫苗策略。
**2 材料与方法**
**2.1 细菌菌株**
本研究使用了2013至2023年间从土耳其不同地区（西黑海/马尔马拉海、中央安纳托利亚、东安纳托利亚、地中海、爱琴海和黑海）的虹鳟养殖场分离的**V. anguillarum**菌株。细菌分离来自内脏器官（肾脏、肝脏、脾脏、心脏、大脑）和/或具有病变的特定器官。分离使用添加了1% NaCl的Tryptic Soy Agar（TSA）培养基，并在22°C下培养24–48小时。培养后获得的纯菌落被转移到含有15%–20%甘醇的保存培养基中，长期保存于-80°C（Buller 2014；Austin和Austin 2016）。研究中使用的菌株详细信息见表1。
| 分离株 | 分离特征 | 鱼类物种 | 体重（g） | 分离年份 | 来源（省份） | 序列类型（ST） |
|-------|---------|---------|---------|---------|---------|
| V12 | RT | 250 | 2016 | Muğla | 165 |
| V15 | RT | 350 | 2017 | Muğla | 163 |
| V18 | RT | 200 | 2016 | Tunceli | 163 |
| V21 | RT | 20–200 | 2017 | Elazığ | 163 |
| V25 | RT | 20–200 | 2017 | Muğla | 165 |
| V28 | RT | 250 | 2017 | Muğla | 163 |
| V76 | RT | 150 | 2013 | Muğla | 163 |
| V80 | RT | 8–10 | 2013 | Muğla | 163 |
| V82 | RT | 4–6 | 2013 | Muğla | 163 |
| V85 | RT | 200 | 2011 | Rize | 163 |
| V88 | RT | 20 | 2014 | Muğla | 163 |
| V91 | RT | 20 | 2014 | Muğla | 163 |
| V92 | RT | 20 | 2014 | Muğla | 163 |
| V95 | RT | 200 | 2013 | Muğla | 163 |
| V96 | RT | 200 | 2013 | Muğla | 163 |
| V98 | ES | 0.1 | 2015 | Çanakkale | 163 |
| V99 | RT | 250 | 2015 | Muğla | 163 |
| V100 | GS | 5–10 | 2015 | Muğla | 163 |
| V102 | ES | 0.5 | 2015 | Çanakkale | 163 |
| V152 | GS | 0.6–1.0 | 2017 | İzmir | 163 |
| V2022-104 | RT | 0.3 | 2022 | Kayseri | 163 |
| V2022-124 | RT | 0.6–1.0 | 2022 | Kayseri | 163 |
| V2022-154 | RT | 1.0–1.5 | 2022 | Kayseri | 163 |
**2.2 细菌鉴定和基因组特征**
**2.2.1 经典生化鉴定**
在培养基上生长的菌落接受了包括革兰氏染色、氧化酶、过氧化氢酶、运动性、氧化/发酵（O/F）和vibriostat（O/129）在内的经典生化测试，以及在特定选择性培养基上的生长特性鉴定（Buller 2014；Austin和Austin 2016）。
**2.2.2 DNA提取和全基因组测序**
使用基于旋转柱的提取试剂盒（Nucleogene，伊斯坦布尔，土耳其）根据制造商的协议从细菌分离株中提取DNA。使用Qubit 4.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）测量DNA浓度，使用Thermo Scientific Multiskan GO分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）评估纯度比（260/280）。全基因组分析使用每个分离株的50 ng细菌DNA，基因组测序使用PromethION 2 Solo平台（Oxford Nanopore Technologies，牛津，英国）进行。24小时的测序运行使用MinKNOW控制软件（版本0.46.1.9，流式细胞仪类型R9.4；Oxford Nanopore Technologies，牛津，英国）完成。
**2.2.3 基因组组装和分类**
使用Flye组装器（版本2.9.1-b1780）进行从头基因组组装，该工具针对长读长Nanopore数据进行了优化。使用Minimap2（版本2.24-r1122）进行组装优化，使用Racon（版本1.5.0）进行一致性校正。使用QUAST（版本5.2.0）评估组装质量指标，如N50、总长度和contig数量。使用Samtools（版本1.13；HTSlib 1.13+ds）进行读段比对处理。所有组装和分析步骤都在BV-BRC平台（细菌和病毒生物信息学资源中心）上进行。使用Type Strain Genome Server（TYGS）（https://tygs.dsmz.de/）（Meier-Kolthoff和Göker 2019）对组装的草图基因组进行分类。基因组注释使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP v2024-03）（Tatusova等人2016）完成。
**2.2.4 毒力和抗菌素耐药性基因分析**
为了检测毒力基因，基于先前发表的涉及**V. anguillarum**菌株的研究编译了一个自定义参考数据集，包括来自菌株775的240个毒力相关基因和来自菌株RV22的10个基因（Naka等人2011；Castillo, Alvise等人2017；Balado等人2018）。使用BLAST识别分离株中的同源基因，应用最小序列同一性和60%覆盖率的阈值。使用Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）进行抗菌素耐药性（AMR）基因分析。为此，使用CARD平台上的Resistance Gene Identifier（RGI）工具（https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi）进行分析，并使用默认参数（Alcock等人2020；Liu等人2022）。
**2.2.5 基于基因组的系统发育分析**
使用BV-BRC流程识别的3800个单拷贝直系同源基因推断核心基因组系统发育。蛋白质序列使用MAFFT v7.525（Katoh和Standley 2013）进行比对，并在IQ-TREE v2.3.3中使用LG+G模型和1000次自助复制重建最大似然（ML）树（Nguyen等人2015）。土耳其分离株与代表不同血清型的参考菌株（O1：ATCC 68554和775；O2a：ATCC 43306；O3：CNEVA NB 11008）一起进行分析。所得拓扑结构在Type Strain Genome Server（TYGS）上使用Genome BLAST Distance Phylogeny（GBDP）和数字DNA–DNA杂交（dDDH）指标独立验证（Meier-Kolthoff和Göker 2019）。类似的系统基因组学策略已应用于最近的**V. anguillarum**研究（Castillo, Alvise等人2017；Hansen等人2020；Saticioglu等人2025）。
**2.3 **V. anguillarum**分离株的表型毒力特征测定（溶血、蛋白酶、明胶酶、DN酶和脂肪酶活性）**
通过酪蛋白酶和明胶酶水解、DN酶、脂肪酶（甘油三酯和Tween 80水解）以及溶血素活性来评估分离株的表型毒力特征。所有实验均按照Saticioglu等人（2025）的描述进行，略有修改，每个分离株在四到五个独立实验中进行了测试。酪蛋白酶、明胶酶、DN酶和脂肪酶活性使用标准的基于平板的测定方法进行，略有修改（Romalde和Toranzo 1993；Farrar和Reboli 2006；Austin和Austin 2016；Frans等人2013；Huang等人2013；Gao等人2018）。简要来说，酪蛋白酶和明胶酶活性在添加了脱脂牛奶或明胶的TSA上测定；DN酶活性在DNase琼脂上测定；脂肪酶活性在甘油三酯琼脂和添加了Tween 80的TSA上测定；溶血活性在羊血琼脂上测定。溶血根据标准标准分为α、β或γ型；蛋白水解活性通过透明区直径与菌落直径的比率来估计；菌落周围出现透明晕圈被认为是DN酶和脂肪酶活性的阳性反应。
**2.4 产生高免疫血清和基于ELISA的**V. anguillarum**血清型鉴定**
根据Sørensen和Larsen（1986）描述的静脉免疫方案，在新西兰白兔体内产生了针对**V. anguillarum**参考菌株O1（NCIMB 2131）、O2a（NCIMB 6T）和O2b（NCIMB 2130）的高免疫血清，略有修改，并获得了当地伦理批准（2023年5月17日，决定编号2023–01）。通过重复注射福尔马林灭活的细菌后加入活细菌悬浮液来获得高滴度的抗血清，收集血清并分离后储存在-70°C直至使用（Altun等人2025）。根据Dudek等人（2020）的描述，通过热灭活、洗涤和超声处理从TSA培养物中制备用于ELISA的总细菌抗原。间接ELISA按照Sørensen和Larsen（1986）的方法进行。初步的棋盘滴定实验用于确定**V. anguillarum**参考血清型的最佳工作血清稀释度和抗原包被稀释度。基于这些分析，兔血清在比较实验中的工作稀释度为1:100。平板上涂有特定血清型的抗原（每孔10微克），与兔血清孵育后，加入HRP标记的抗兔IgG和TMB底物，使用微孔读数仪在405–450纳米波长处测量吸光度。该测定用于确定特异性抗体水平并评估不同血清型之间的交叉反应性。
2.5 平板及微孔板（定量）凝集试验
通过平板和微孔凝集试验，使用兔全细胞抗血清和标准化抗原悬浮液（约10^9个细胞/毫升；McFarland编号3）来评估分离株之间的血清学关系，方法如Larsen等人（1994年；Santos等人，1995年、1997年）所述。通过热处理制备的O-抗原用于平板凝集试验，快速可见的凝集反应被视为阳性结果。微孔凝集试验重复进行两次，使用抗血清的两倍系列稀释液，滴度定义为孵育后出现宏观凝集的最高血清稀释度。
2.6 SDS-PAGE分析全细胞蛋白质谱
根据Laemmli（1970年）的方法，通过SDS-PAGE分析全细胞蛋白质谱。蛋白质在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离，使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）进行可视化，并使用Precision Plus Protein Dual Colour Standards（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）估计分子量。使用Quantity One软件（v4.6.5，Bio-Rad，Hercules，CA，美国）分析条带模式，并在BioNumerics v7.6（Applied Maths，Sint-Martens-Latem，比利时）中进行进一步比较，先进行凝胶标准化和条带匹配。使用Dice系数计算相似性矩阵，并通过UPGMA生成树状图，方法如Santos等人（1995年）所述。
2.7 抗原谱的确定
通过Western blot分析确定抗原谱，方法如Altun等人（2025年）所述，略有修改。简要来说，全细胞蛋白质通过SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上，然后用超免疫兔血清（1:200）进行检测，随后加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:10,000）。免疫反应条带使用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad）和Clarity Max底物进行可视化。非免疫兔血清作为阴性对照，大肠杆菌的全细胞蛋白质用于评估血清特异性（Sepúlveda等人，2022年）。
2.8 体内毒力测定
在土耳其Çanakkale Onsekiz Mart大学的鱼类实验单元进行体内毒力测定，获得了当地伦理批准（编号2022–01/12）。总共180条虹鳟鱼（O. mykiss；平均体重15.2±0.3克）在标准循环水养条件下适应15天后，通过细菌学方法验证鱼的健康状况。根据先前的表型、血清学、蛋白质组学和基因组学特征，选择了V12、V15和V18分离株，以代表土耳其菌株库中的不同生物学特征：V12为非凝集型且基因组差异较大的分离株，V15为具有中等毒力相关表型的O1型分离株，V18为表现出强烈酶活性和免疫原性的O1型分离株。从24小时培养物中制备细菌悬浮液，通过平板计数和光密度进行定量，并标准化至约1×10^7 CFU/鱼，相当于Li等人（2024年）确定的LD60剂量。鱼用苯氧乙醇麻醉后腹腔注射0.1毫升细菌悬浮液，而对照组鱼则注射无菌0.85% NaCl。每天记录死亡率，连续21天，从死亡鱼的肾脏样本中细菌学确认V. anguillarum感染。挑战设计的详细信息见表2。
2.9 统计分析
从体内挑战实验中获得的生存数据使用Kaplan–Meier生存曲线进行分析。使用Mantel-Cox（对数秩）检验评估实验组之间的生存差异，并在适当情况下进行成对比较。所有统计分析均使用SPSS软件（版本20.0，IBM Corp.，Armonk，NY，美国）进行。
3 结果
3.1 表型和基因型特征
所有表型鉴定为V. anguillarum的分离株在基因组水平上也得到了确认。然后使用五种测定方法——溶血素、酪蛋白酶、明胶酶、DN酶和脂肪酶——评估来自不同地理区域的野外分离株的表型毒力特征，以表征其毒力相关表型。这些表型毒力特征被选为病理发生的关键步骤的代理指标，包括宿主进入、组织降解、系统传播和直接细胞损伤，结果见表3。
3.2 V. anguillarum血清型的超免疫血清生产及ELISA测定抗体水平
ELISA优化试验显示，所有3种V. anguillarum参考血清型的吸光度值随稀释度降低，而阴性血清的吸光度值保持在0.150以下。基于这些定量分析，选择1:100的血清稀释度作为后续测定的最佳工作稀释度。相应的最佳抗原稀释度分别为O2b型1:204800，O2a型1:51200，O1型1:204800。在选定的工作稀释度下，同源抗原-血清组合显示出强烈的反应性，并与阴性对照有明显区分，证实了超免疫血清的特异性。代表性平板图像见图S1，相应的定量优化结果见表S1。
3.3 V. anguillarum分离株的血清学和血清型特征
总共23个野外分离株的O-抗原与参考抗血清进行了测试，确定了它们的血清型特性。根据平板凝集结果，22个野外分离株仅与O1抗血清发生阳性反应。没有观察到与O2a或O2b抗血清的反应。只有V-12野外株与三种抗血清均无凝集反应（表4）。
3.4 V. anguillarum菌株的全细胞蛋白质谱
使用SDS-PAGE方法分析了23个V. anguillarum野外分离株以及三个参考菌株（NCIMB 2131 [O1型]、NCIMB 6T [O2a型] 和 NCIMB 2130 [O2b型]）的全细胞蛋白质谱。使用BioNumerics 7.0软件（Applied Maths，比利时）对结果蛋白质条带进行比较评估。基于蛋白质相似性比率构建的树状图见图1，全细胞蛋白质类型（WCPT）分组见表S2。
3.5 通过Western blot分析V. anguillarum菌株的免疫原性蛋白质谱
Western blot分析显示，野外分离株与参考菌株之间存在明显的免疫原性差异。当用针对O1型（NCIMB 2131）的抗血清检测时，大多数野外分离株显示出多个条带。仅在5个分离株（V15、V18、V21、V85和V2022-104）中检测到脂肪酶活性，而20个分离株在四个或更多测试中呈阳性，因此被归类为具有高毒力潜力的候选菌株。
3.6 为V. anguillarum血清型鉴定生产超免疫血清及通过ELISA测定抗体水平
ELISA优化试验表明，所有3种V. anguillarum参考血清型的吸光度值随稀释度降低，而阴性血清的吸光度值保持在0.150以下。基于这些定量分析，选择1:100的血清稀释度作为后续测定的最佳工作稀释度。相应的最佳抗原稀释度分别为O2b型1:204800，O2a型1:51200，O1型1:204800。在选定的工作稀释度下，同源抗原-血清组合显示出强烈的反应性，并与阴性对照有明显区分，证实了超免疫血清的特异性。代表性平板图像见图S1，相应的定量优化结果见表S1。
3.7 V. anguillarum分离株的血清学和血清型特征
总共23个野外分离株的O-抗原与参考抗血清进行了测试，确定了它们的血清型特性。根据平板凝集结果，22个野外分离株仅与O1抗血清发生阳性反应。与O2a或O2b抗血清均无反应。只有V-12野外株与三种抗血清均无凝集反应（表4）。
3.8 V. anguillarum菌株的全细胞蛋白质谱
使用SDS-PAGE方法分析了23个V. anguillarum野外分离株以及三个参考菌株（NCIMB 2131 [O1型]、NCIMB 6T [O2a型] 和 NCIMB 2130 [O2b型]）的全细胞蛋白质谱。使用BioNumerics 7.0软件（Applied Maths，比利时）对结果蛋白质条带进行比较评估。基于蛋白质相似性比率构建的树状图见图1，全细胞蛋白质类型（WCPT）分组见表S2。
3.9 通过Western blot分析比较V. anguillarum菌株的免疫原性蛋白质谱
Western blot分析显示，野外分离株与参考菌株之间存在明显的免疫原性差异。当用针对O1型（NCIMB 2131）的抗血清检测时，大多数野外分离株显示出多个条带。值得注意的是，V12野外株在O1参考菌株和野外菌株中均检测到12至18 kDa之间的条带，表明这些蛋白质可能是血清型特异性的抗原标志物。相比之下，V12野外株与O2a型和O2b型参考菌株的区别在于缺乏48 kDa的条带。
3.10 V. anguillarum菌株的免疫原性蛋白质谱比较
Western blot分析显示，野外分离株与参考菌株之间存在明显的免疫原性差异。当用针对O1型（NCIMB 2131）的抗血清检测时，大多数野外分离株显示出多个条带。值得注意的是，V12野外株在O2a和O2b参考菌株中未检测到特定条带。这些发现共同表明，野外分离株与参考菌株之间存在保守的以及具有不同免疫原性的条带模式。
3.6 基因组分析
使用Oxford Nanopore Technology技术生成了23株土耳其来源的V. anguillarum分离株的全基因组序列。基因组大小在4.32至4.57 Mb之间，GC含量为44.3%–44.8%。基因组组装由4–34个contigs组成，N50值介于2.4–3.1 Mb之间。平均每个分离株有3900–4100个CDSs、75–105个tRNAs和8–11个rRNAs（表S3）。基于3800个单拷贝基因的氨基酸序列（通过BV-BRC方法）的核心基因组系统发育分析显示，大多数土耳其分离株与O1血清型参考菌株聚类在一起，特别是V. anguillarum 775、ATCC 68554（O1，美国）、LMG 12010（O1，希腊）和VA1（海鲈鱼）。分离株V28和V152属于这个O1分支，而V12和V25则属于与主要O1分支较远的分支。相比之下，土耳其分离株与其他血清型的参考菌株（如ATCC 43306（O2a）、030305–1/5（O2b）和CNEVA NB 11008（O3））在系统发育上距离更远（图4）。
V. anguillarum分离株的核心基因组系统发育树。该树是根据BV-BRC中3800个单拷贝同源蛋白的串联比对推断出的最大似然树。红色标签表示土耳其分离株，黑色标签表示参考菌株。刻度条表示每个位置的替换次数，节点标签表示自助法支持值。分离株的元数据和登录号在表S3中提供。使用TYGS进行的比较分析证实了土耳其分离株在O1分支内的紧密聚类，但也揭示了基于毒力基因库的亚组划分（图5）。
基于GBDP基因组间距离并通过TYGS推断出的V. anguillarum基因组系统发育树。分支长度对应于GBDP距离，节点标签表示伪自助法支持值（例如，n=100）。右侧的注释列总结了TYGS物种和dDDH簇。共研究了261个基因（256个与毒力相关基因和5个抗菌素抗性基因），它们在功能类别中的分布总结在表S4和S5中。铁获取系统得到了很好的代表，有61个基因与vanchrobactin、anguibactin和血红素/铁转运相关。vanchrobactin和血红素吸收系统在所有分离株中都得到保守，而anguibactin簇在包括V12和V100在内的一些菌株中缺失。毒素和酶相关基因也广泛分布。所有分离株都携带六个溶血素基因，包括vah1和delta-VPH。与RTX毒素及其辅助成分相关的七个基因在所有基因组中都得到保守，表明所研究的群体中存在完整的RTX系统。在所有分离株中检测到编码分泌酶（如磷脂酶、胶原酶、脂肪酶和金属蛋白酶）的八个基因，而在V12中唯一鉴定出一个非溶血性肠毒素基因。运动性和粘附相关功能构成了毒力库的另一个主要部分。共鉴定出88个与鞭毛、运动性和趋化性相关的基因，包括扩展的mcp1-20家族，表明具有较高的趋化性和运动潜力。所有分离株都携带一个看似完整的IV型菌毛（T4P）系统，msh菌毛与粘附和定植作用一致。同样，检测到编码VI型分泌系统（T6SS）组分的31个基因：T6SS系统II（vstA-vstK）在所有分离株中都完整，而T6SS系统I的元件在一些菌株中部分缺失，尤其是V12和V25。群体感应和调控功能得到了广泛保守。所有分离株都含有11个群体感应基因，包括luxS、luxR和vanT，以及四个全局或毒力调节因子（hns、hfq、hlyU和vpsT）。此外，还有三个被归类为“其他”毒力相关因子的基因编码了菌毛蛋白和多模块转肽酶，可能有助于细胞表面结构。抗菌素抗性（AMR）基因谱包括五个基因。所有分离株都检测到喹诺酮类抗性决定因子qnrVC6，而tet（34）在95.6%的菌株中存在，仅在V85中缺失。值得注意的是，qnrS2、sul2和tet(B)仅在V28中独特鉴定，表明该分离株可能携带与移动遗传元件相关的额外抗性决定因子。
3.7 体内毒力测试
用V. anguillarum O1分离株对虹鳟鱼进行实验感染后，出现了典型的弧菌病临床表现。受感染的鱼皮肤色素沉着加深；口部、成对鳍基部和肛门周围出现瘀点出血；以及腹部区域明显的红斑和出血（图6）。
在用V. anguillarum实验感染的虹鳟鱼中观察到的临床症状。感染过程中，鱼皮肤变暗，腹部区域和成对鳍基部出现明显的红斑和出血。Kaplan–Meier生存分析显示，感染不同V. anguillarum O1分离株的实验组之间存在显著差异（p<0.05）。不同分离株的总死亡率差异显著：感染V12分离株的组别死亡率为3.70%和7.40%；感染V15分离株的组别死亡率为29.62%和40.74%；而感染V18分离株的组别死亡率为74.07%和66.66%（图7）。
这项研究首次全面描述了土耳其野外分离株的表型、抗原性、蛋白质组学和基因组学特征，填补了文献中的空白，并为水产养殖病原体控制策略做出了贡献。大约87%的分离株表达了至少三种表型毒力标志物，这种模式之前与弧菌病爆发中的高死亡率相关（Frans等人，2013年）。V15、V18和V21分离株中同时存在β-溶血素、明胶酶、酪蛋白酶、DN酶和脂肪酶，这与DN酶通过降解中性粒细胞胞外陷阱（NETs）促进细菌传播的证据一致（Gao等人，2018年），以及脂肪酶活性与毒力增强相关（Huang等人，2013年）。这些酶谱支持使用表型毒力特征作为选择疫苗开发和挑战实验菌株的实际指标。基于针对V. anguillarum O1、O2a和O2b血清型的超免疫兔血清的血清学分析，能够对野外分离株进行稳健的血清分型并评估抗原关系。在1:100血清稀释度下的间接ELISA明确区分了同源和异源抗原-血清组合，证实了血清型之间的显著抗原差异，并验证了超免疫血清作为可靠血清分型工具的有效性，这与Pedersen等人（1999年）的扩展方案一致。这种强烈的血清型特异性与血清型匹配对鱼类保护性免疫和疫苗效果至关重要的观点一致（Colquhoun和Lillehaug，2014年），并支持在DIVA兼容的疫苗接种策略中强调抗原特异性和受控交叉反应（Monaghan等人，2016年）。血清分型显示O1在土耳其野外分离株中明显占主导地位：23株中有22株仅与O1抗血清反应，而与O2a或O2b抗血清没有反应。微孔板凝集实验确认了O1阳性，滴度在40至640之间（Larsen，1983年；Pedersen等人，1999年），而O2a和O2b参考菌株仅与同源抗血清反应。这些观察结果加强了O血清型的高抗原特异性，并有助于解释为什么血清型兼容性是疫苗效力的关键决定因素（Colquhoun和Lillehaug，2014年）。相比之下，V12分离株不与任何参考抗血清发生凝集，这与之前与未表征的O血清型相关的非凝集或非典型O抗原谱一致（Grisez和Ollevier，1995年；Pedersen等人，1999年）。这样的非典型变异对血清学诊断和未来的疫苗配方都很重要。蛋白质组学和免疫蛋白质组学分析支持了高度保守但免疫原性不同的表面结构的观点。SDS-PAGE显示野外和参考菌株的全细胞蛋白质谱有97%–100%的相似性，大约在95、77、47、35、26和14 kDa处有一致的条带。保守的外膜和表面蛋白长期以来被认为是宿主免疫反应的关键靶标（Chart和Trust，1984年），我们的发现与功能研究一致，表明外膜孔蛋白（如38 kDa的OmpU）有助于抗胆汁能力和生物膜形成（Wang等人，2023年），以及Scophthalmus maximus皮肤黏液中的抗菌蛋白对抵抗V. anguillarum的重要性（Wang等人，2023年）。Hippoglossus hippoglossus中观察到的血清型依赖性免疫反应进一步支持了脂多糖（LPS）和保守的外膜蛋白在塑造保护性免疫中的双重重要性。Western blotting通过识别保守的和与血清型相关的免疫原性条带进一步细化了这些观察结果。O1参考抗血清在大多数野外分离株中识别出38–42 kDa和60–70 kDa的主导条带，与基于组学的识别一致，表明外膜蛋白（如OmpK，70–110 kDa）具有交叉保护潜力（Jonsson等人，2025年）。针对野外分离株的血清在同源和异源菌株中分别显示出28–32 kDa和45–50 kDa的条带，这可能对应于鞭毛蛋白A、溶血素和OmpK的条带大小（Mikkelsen等人，2011年；Baliga等人，2018年）。这些模式说明了免疫蛋白质组学如何补充基因组学在抗原发现中的作用，正如Mishra等人（2023年）和Natnan等人（2021年）所强调的。相比之下，O2a和O2b抗血清仅在参考菌株中检测到血清型特异性条带，而V12再次显示出弱反应性，进一步证实了其非典型的抗原状态（Grisez和Ollevier，1995年；Pedersen等人，1999年）。总体而言，蛋白质组数据支持保守的外膜蛋白作为有前景的广谱疫苗抗原，而血清型特异性条带指向与血清型匹配的成分。全基因组测序为解释这些表型模式提供了基因组框架。基因组大小（4.32–4.57 Mb）和GC含量（44.3%–44.8%）与已充分表征的菌株（如携带pJM1质粒的毒力分离株NB10和pJM1，Naka等人，2011年；Holm等人，2015年）非常相似，表明该物种内的基因组稳定性。在土耳其分离株中未检测到质粒，表明其致病性主要通过染色体编码而非依赖于pJM1样质粒。比较分析显示保守的铁吸收系统（如vabA–E、tonB、exbB/D、feoABC、fbpABC）、鞭毛运动性、IV型和Msh菌毛以及群体感应系统，与其他地区V. anguillarum的核心毒力库一致（Castillo、Christiansen等人，2017年；Hansen等人，2020年）。同时，辅助毒力因子存在差异：anguibactin铁载体簇和VI型分泌系统T6SS-I在某些菌株中不完整或缺失，特别是V12，而V15和V18分离株携带完整的RTX毒素、溶血素、T6SS基因、铁载体转运蛋白和粘附素。这些结果与RTX毒素及其相关系统在V. anguillarum毒力中的核心作用一致（Balado等人，2018年），并表明铁载体和T6SS位点的变异有助于观察到的毒力潜力差异。对用于挑战实验的三种菌株进行更集中的比较进一步支持了辅助毒力组成与体内结果之间的联系。V12分离株以其非凝集表型、较弱的免疫反应性和相对于主要O1分支的基因组位置不同而脱颖而出。此外，它缺乏anguibactin簇，并表现出不完整的或减弱的T6SS-I库，这些特征与其在体内的显著减弱的表型一致。相比之下，V15具有更典型的O1背景，并结合了强表型毒力谱和比V12更广泛的毒力相关基因库，这反映在其中等的死亡率模式中。在三种菌株中，V18显示出最明显的毒力相关表型，包括脂肪酶阳性、强烈的免疫原性条带模式和更广泛的辅助毒力库，这与挑战实验中观察到的最高死亡率一致。总体而言，这些发现表明V12、V15和V18之间的死亡率差异不是由单一决定因素引起的，而是由抗原谱、辅助毒力位点和表型毒力特征的综合作用造成的。抗菌素抗性（AMR）基因谱包括五个基因。所有分离株都携带喹诺酮类抗性决定因子qnrVC6，而tet（34）在95.6%的菌株中存在，仅在V85中缺失。值得注意的是，qnrS2、sul2和tet(B)仅在V28中独特鉴定，表明该分离株可能携带与移动遗传元件相关的额外抗性决定因子。
实验性感染虹鳟鱼使用V. anguillarum O1分离株后，出现了弧菌病的典型临床表现。受感染的鱼皮肤色素沉着加深；口部、成对鳍基部和肛门周围出现瘀点出血；以及腹部区域明显的红斑和出血（图6）。
这项研究提供了土耳其野外V. anguillarum分离株在表型、抗原性、蛋白质组学和基因组学层面的首次全面描述，从而填补了文献中的空白，并为水产养殖病原体控制策略做出了贡献。大约87%的分离株表达了至少三种表型毒力标志物，这种模式之前与弧菌病爆发中的高死亡率相关（Frans等人，2013年）。V15、V18和V21分离株中同时存在β-溶血素、明胶酶、酪蛋白酶、DN酶和脂肪酶，这与DN酶通过降解中性粒细胞胞外陷阱（NETs）促进细菌传播的证据一致（Gao等人，2018年），以及脂肪酶活性与毒力增强相关（Huang等人，2013年）。这些酶谱支持使用表型毒力特征作为选择疫苗开发和挑战实验菌株的实际指标。基于针对V. anguillarum O1、O2a和O2b血清型的超免疫兔血清的血清学分析，能够对野外分离株进行稳健的血清分型并评估抗原关系。在1:100血清稀释度下的间接ELISA清楚地区分了同源和异源抗原-血清组合，证实了血清型之间的显著抗原差异，并验证了超免疫血清作为可靠血清分型工具的有效性，这与Pedersen等人（1999年）的扩展方案一致。这种强烈的血清型特异性与血清型匹配对鱼类保护性免疫和疫苗效果至关重要的观点一致（Colquhoun和Lillehaug，2014年），并支持在DIVA兼容的疫苗接种策略中强调抗原特异性和受控交叉反应（Monaghan等人，2016年）。血清分型显示O1在土耳其野外分离株中明显占主导地位：23株中有22株仅与O1抗血清反应，而与O2a或O2b抗血清没有反应。微孔板凝集实验确认了O1阳性，滴度在40至640之间（Larsen，1983年；Pedersen等人，1999年），而O2a和O2b参考菌株仅与同源抗血清反应。这些观察结果加强了O血清型的高抗原特异性，并有助于解释为什么血清型兼容性是疫苗效力的关键决定因素（Colquhoun和Lillehaug，2014年）。相比之下，V12分离株不与任何参考抗血清发生凝集，这与之前与未表征的O血清型相关的非凝集或非典型O抗原谱一致（Grisez和Ollevier，1995年；Pedersen等人，1999年）。这样的非典型变异对血清学诊断和未来疫苗配方都很重要。蛋白质组学和免疫蛋白质组学分析支持了高度保守但免疫原性不同的表面结构的观点。SDS-PAGE显示野外和参考菌株的全细胞蛋白质谱有97%–100%的相似性，大约在95、77、47、35、26和14 kDa处有一致的条带。保守的外膜和表面蛋白长期以来被认为是宿主免疫反应的关键靶标（Chart和Trust，1984年），我们的发现与功能研究一致，表明外膜孔蛋白（如38 kDa的OmpU）有助于抗胆汁能力和生物膜形成（Wang等人，2023年），以及Scophthalmus maximus皮肤黏液中的抗菌蛋白对抵抗V. anguillarum的重要性（Wang等人，2023年）。Hippoglossus hippoglossus中观察到的血清型依赖性免疫反应进一步支持了脂多糖（LPS）和保守的外膜蛋白在塑造保护性免疫中的双重重要性。Western blotting通过识别保守的和与血清型相关的免疫原性条带进一步细化了这些观察结果。O1参考抗血清在大多数野外分离株中识别出38–42 kDa和60–70 kDa的主导条带，与基于组学的识别一致，表明外膜蛋白（如OmpK，70–110 kDa）具有交叉保护潜力（Jonsson等人，2025年）。针对野外分离株的血清在同源和异源菌株中分别显示出28–32 kDa和45–50 kDa的条带，这可能对应于鞭毛蛋白A、溶血素和OmpK的条带大小（Mikkelsen等人，2011年；Baliga等人，2018年）。这些模式说明了免疫蛋白质组学如何补充基因组学在抗原发现中的作用，正如Mishra等人（2023年）和Natnan等人（2021年）所强调的。相比之下，O2a和O2b抗血清仅在参考菌株中检测到血清型特异性条带，而V12再次显示出弱反应性，进一步证实了其非典型的抗原状态（Grisez和Ollevier，1995年；Pedersen等人，1999年）。总体而言，蛋白质组数据支持保守的外膜蛋白作为有前景的广谱疫苗抗原，而血清型特异性条带指向与血清型匹配的成分。全基因组测序为解释这些表型模式提供了基因组框架。基因组大小（4.32–4.57 Mb）和GC含量（44.3%–44.8%）与已充分表征的菌株（如携带pJM1质粒的毒力分离株NB10和pJM1，Naka等人，2011年；Holm等人，2015年）非常相似，表明该物种内的基因组稳定性。在土耳其分离株中未检测到质粒，表明其致病性主要通过染色体编码而非依赖于pJM1样质粒。比较分析显示保守的铁吸收系统（如vabA–E、tonB、exbB/D、feoABC、fbpABC）、鞭毛运动性、IV型和Msh菌毛以及群体感应系统，与其他地区V. anguillarum的核心毒力库一致（Castillo、Christiansen等人，2017年；Hansen等人，2020年）。同时，辅助毒力因子存在差异：anguibactin铁载体簇和VI型分泌系统T6SS-I在某些菌株中不完整或缺失，特别是V12，而V15和V18分离株携带完整的RTX毒素、溶血素、T6SS基因、铁载体转运蛋白和粘附素。这些结果与RTX毒素及其相关系统在V. anguillarum毒力中的核心作用一致（Balado等人，2018年），并表明铁载体和T6SS位点的变异有助于观察到的毒力潜力差异。对用于挑战实验的三种菌株进行更集中的比较进一步支持了辅助毒力组成与体内结果之间的联系。V12分离株以其非凝集表型、较弱的免疫反应性和相对于主要O1分支的基因组位置不同而脱颖而出。此外，它缺乏anguibactin簇，并表现出不完整的或减弱的T6SS-I库，这些特征与其在体内的显著减弱的表型一致。相比之下，V15具有更典型的O1背景，并结合了强表型毒力谱和比V12更广泛的毒力相关基因库，这反映在其中等的死亡率模式中。在这三种菌株中，V18显示出最明显的毒力相关表型，包括脂肪酶阳性、强烈的免疫原性条带模式和更广泛的辅助毒力库，这与挑战实验中观察到的最高死亡率一致。总之，这些发现表明V12、V15和V18之间的死亡率差异不是由单一决定因素引起的，而是由抗原谱、辅助毒力位点和表型毒力特征的综合作用造成的。抗菌素抗性（AMR）基因谱对治疗选择有直接影响。所有分离株都携带喹诺酮类抗性决定因子qnrVC6，几乎所有分离株都携带tet（34），表明对喹诺酮类和四环素的敏感性普遍降低。V28中独特的qnrS2、sul2和tet(B)组合表明存在携带多个抗性决定因子的移动遗传元件。在水产养殖中日益增加的AMR背景下，这些发现支持谨慎使用抗生素的必要性，并在制定治疗策略时将基因组AMR监测纳入常规监测。系统发育分析将大多数土耳其分离株置于O1血清型分支内，而V12、V25和V28形成了更分散的分支。V12的非凝集、弱免疫反应性表型与其基因组差异相关，表明抗原和基因组变异之间有很好的一致性。土耳其分离株与高毒力的欧洲菌株（如NB10）明显不同（Holm等人，2015年），这表明它们在虹鳟水产养殖系统中发生了局部适应，进一步强调了需要针对特定地区的疫苗，而不仅仅是依赖非本地菌株来源的抗原。通过整合基因组、表型和体内数据，我们获得了关于菌株致病潜力差异的清晰认识。在实验感染中，V18导致了最高的死亡率（70.4%），V15表现出中等毒性（35.2%），而V12的毒性显著减弱（5.6%）。Kaplan–Meier生存分析证实了各分离株之间的显著差异，且死亡率模式与其毒性基因库和表型毒性特征高度吻合。V12的弱化表型与其失去了anguibactin和T6SS-I成分有关，这与之前关于缺乏关键毒性决定因子的弱化菌株的报道一致（Li和Ma，2017年）。相反，V15和V18具有广泛的毒性成分和强酶活性，这支持了多因素毒性（而非单一标记物）能更好地预测疾病结果的观点（Balado等人，2018年；Baliga等人，2018年）。从疫苗候选者的角度来看，V18和V21是进一步评估的潜在候选者。这两种菌株都拥有广泛的毒性基因库、强免疫原性蛋白谱以及O1血清型背景，值得进一步研究适合土耳其水产养殖的福尔马林灭活疫苗或亚单位疫苗。这一结论与针对鱼类病原体的组学基础疫苗策略一致（Natnan等人，2021年；Mishra等人，2023年），这些策略提倡基于基因组和蛋白质组的抗原选择。本研究中鉴定出的保守外膜蛋白，以及通过Western blotting和组学分析发现的血清型特异性抗原（Mikkelsen等人，2011年；Jonsson等人，2025年），为未来的交叉保护和血清型匹配疫苗配方提供了合理的抗原选择。总之，土耳其的V. anguillarum分离株具有保守的核心基因组和毒性基因集，但在辅助毒性和抗生素耐药性决定因子方面表现出显著异质性，这是菌株间毒性差异的基础。这些发现表明，在其他地区开发的疫苗和治疗方法可能在土耳其的虹鳟养殖中并不总是有效。本研究的全面基因组、表型和免疫蛋白质组学分析突出了V18和V21作为特定地区疫苗开发的潜在候选者，并强调了基于基因组的监测、有针对性的疫苗接种以及在土耳其水产养殖健康管理中合理使用抗生素的重要性。由于本研究未包含疫苗/挑战-保护试验，这些候选菌株的保护效果仍有待验证。
作者贡献：
Jesús L. Romalde：概念化、撰写初稿、方法学设计、验证、审稿和编辑、数据管理、监督、软件使用。
Muhammed Duman：概念化、研究设计、资金获取、撰写初稿、审稿和编辑、数据可视化、验证、方法学设计、软件使用、数据分析、项目管理、资源协调、监督、数据管理。
Bekir Akça：研究设计、方法学设计、验证、软件使用。
Cuneyt Ozakin：研究设计、资金获取、方法学设计、验证、软件使用、项目管理、资源协调。
Soner Altun：概念化、研究设计、资金获取、撰写初稿、方法学设计、验证、数据可视化、审稿和编辑、软件使用、数据分析、项目管理、资源协调、监督、数据管理。
Gorkem Tasci：研究设计、方法学设计、数据可视化、数据管理。
Nazmiye Ulku Tuzemen：研究设计、资金获取、方法学设计、验证、软件使用、项目管理、资源协调。
Sevdan Yılmaz：研究设计、方法学设计、项目管理、资源协调。
Izzet Burcin Saticioglu：概念化、研究设计、资金获取、撰写初稿、审稿和编辑、数据可视化、验证、方法学设计、软件使用、数据分析、项目管理、资源协调、监督、数据管理。
Nihed Ajmi：研究设计、方法学设计、数据可视化、数据管理。
Sebahattin Ergün：研究设计、方法学设计、项目管理、资源协调。
致谢：
作者感谢土耳其科学技术研究委员会（TÜBİTAK）对这项项目的支持（TÜBİTAK项目编号：221O484）。同时，作者也感谢布尔萨乌卢达大学科学研究项目协调部门（BAP）在项目编号TPDD-2025-2332下的支持。
资金支持：
本研究得到了土耳其科学技术研究机构（Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu）的支持，项目编号为221O484，以及布尔萨乌卢达大学（Bursa Uludağ Üniversitesi）的TPDD-2025-2332项目支持。
利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可在本文的支持信息中找到。
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