摘要
在来自美国东北部和加拿大魁北克三个水体的褐头鲶鱼（Ameiurus nebulosus）中，观察到了黑色素病变，包括由于真皮和表皮中黑色素细胞及黑色素巨噬细胞增生导致的非隆起黑色区域，以及与黑色素瘤一致的隆起黑色区域。这些病变首次在美国佛蒙特州Memphremagog湖和加拿大魁北克地区被发现，2014年至2020年间，200毫米及以上长度的褐头鲶鱼中黑色素病变的发病率超过了30%。2023年，对湖泊中的七个地点进行了评估，发病率在18%到42%之间。在缅因州的Hermon Pond，2024年的发病率为29%；在新罕布什尔州的Village Pond，2025年有22%的褐头鲶鱼出现了病变。与外观正常的褐头鲶鱼皮肤相比，具有黑色素病变的皮肤中七种金属（包括已知致癌物砷和锌）的浓度显著更高。在与氧化损伤相关的病变中，还观察到了蜡样质/脂褐素的积累，这些病变同时出现在受影响和外观正常的褐头鲶鱼的鳃、脾脏和肾脏组织中。通过组织病理学观察，病变的发展过程从炎症、氧化损伤的迹象、梭形细胞的增生和坏死，到表皮中黑色素巨噬细胞和黑色素细胞的出现，最终发展为侵袭性黑色素瘤，这表明褐头鲶鱼长期暴露于致癌因素和促进因素中。
1 引言
2012年，佛蒙特州鱼类与野生动物部门（VFWD）开始收到渔民的报告，称在佛蒙特州/魁北克省Memphremagog湖的成年褐头鲶鱼身体表面、口腔和鳍部发现了隆起的黑色生长物。2014年至2017年间，在湖泊佛蒙特州境内的两个海湾——South Bay和Scott's Cove（图1）进行的初步电捕鱼调查显示，200毫米及以上长度的褐头鲶鱼中黑色素病变（包括隆起和非隆起类型）的发病率为23%至37%；较年轻的鱼未受到影响。组织病理学分析确认这些隆起的黑色素病变为恶性黑色素瘤，偶尔在鳃、卵巢和肠道中观察到转移。2015年采样的褐头鲶鱼中有8%出现了肝肿瘤（胆管癌和肝细胞癌）（Blazer等人，2020年）。图1：2023年采样的Memphremagog湖地点。佛蒙特州的地点包括South Bay（JR）、South Main Lake（SML）、Scott's Cove（SC）和North Main Lake（HC）；魁北克的地点包括Fitch Bay（FB）、Sargent's Bay（SB）和Magog（MA）。数据来源于mapZ.com—OpenStreetMapOdbl。
（A）2023年采样的Memphremagog湖地点。佛蒙特州的地点包括South Bay（JR）、South Main Lake（SML）、Scott's Cove（SC）和North Main Lake（HC）；魁北克的地点包括Fitch Bay（FB）、Sargent's Bay（SB）和Magog（MA）。褐头鲶鱼被广泛用作五大湖（Baumann等人，1996年；Pyron等人，2001年；Blazer等人，2009年；Lauren等人，2010年；Pinheiro等人，2020年）、切萨皮克湾流域（Pinkney等人，2009年，2019年）及其他地区的指示物种（Poulet等人，1994年）。皮肤肿瘤，主要是乳头瘤和鳞状细胞癌，与接触遗留污染物有关（Baumann等人，1987年，2008年；Pinkney等人，2004年）。早在19世纪50年代，就有人在褐头鲶鱼中描述了疑似黑色素瘤（Osburn，1925年）。然而，在肿瘤调查中，黑色素瘤的发病率通常较低（<5%），尽管其他皮肤肿瘤的发病率可能较高。例如，在1992年至2006年间对切萨皮克湾流域进行的六次调查中，尽管其他皮肤肿瘤的发病率在0%到53%之间（Pinkney等人，2009年），但未发现黑色素瘤。2014年至2016年在Anacostia河进行的类似调查中，5%至16%的褐头鲶鱼有皮肤肿瘤，但未发现黑色素瘤（Pinkney等人，2019年）。2011年至2013年在八个五大湖关注区域和三个参考地点进行的肿瘤调查中，外部肿瘤的发病率在各个地点之间为0%至61.5%。在收集的878条褐头鲶鱼中，6.6%有外部肿瘤，仅观察到1例黑色素瘤（Blazer等人，2014年）。在某些地点，非隆起的黑色素病变更为常见。在五大湖的肿瘤调查中（Blazer等人，2014年），878条褐头鲶鱼中有18.8%有非隆起的黑色素病变。2016年在伊利湖的Ashtabula River关注区域，150条中有18%有非隆起的黑色素病变；在参考地点，150条中有13.3%有类似发现。尽管在Ashtabula有26.7%的褐头鲶鱼有皮肤肿瘤，但仅观察到1例黑色素瘤；在参考地点，23.3%有皮肤肿瘤，未发现黑色素瘤（Blazer等人，2018年）。同样，在2002年，科德角受污染的Ashumet Pond中，70%的褐头鲶鱼（58条样本）有非隆起的黑色素病变，但未发现黑色素瘤。在这些地点，非隆起的黑色素区域在显微镜下表现为表皮中黑色素细胞增多。这些病变似乎没有发展成肿瘤，其病因尚不清楚。值得注意的是，与Adomavirus感染相关的鲈鱼（Micropterus spp.）中也记录了非隆起的黑色素区域，其特征也是表皮中黑色素细胞增多（Blazer等人，2020年；Iwanowicz等人，2025年）。上述发现强调了其他野生褐头鲶鱼群体中黑色素瘤的罕见性，因此最近在佛蒙特州和美国东北部其他地区观察到的恶性黑色素瘤尤其值得关注。全球范围内，人类黑色素瘤的发病率正在以高于其他类型癌症的速度增长，遗传因素和环境暴露都被认为是风险因素（Conforti和Zalaudek，2021年）。佛蒙特州的人类黑色素瘤病例年龄调整发病率位居第三，且过去5年这一比率一直在上升（国家癌症研究所，https://statecancerprofiles.cancer.gov）。在哺乳动物物种中，紫外线辐射（UVR）暴露和遗传因素是主要风险因素，发病率随年龄增长而增加。然而，其他环境因素，如金属暴露，也可能起作用。例如，流行病学研究表明，与电子和化学工业相关的职业中黑色素瘤的发病率较高。这一发现及后续研究表明，活性氧（ROS）的增加在黑色素细胞转化和黑色素瘤进展中起重要作用，作为促进癌症生长和细胞死亡的信号分子（Meyskens Jr等人，2004年；Liu-Smith等人，2014年）。关于野生鱼类中黑色素瘤的风险因素以及污染物在鱼皮中的作用知之甚少。在大堡礁海洋公园的野生珊瑚鳟鱼（Plectropamus leopardus）中，黑色素瘤和黑色素沉着归因于紫外线辐射暴露（Sweet等人，2012年），而在Xiphophorus杂交鱼中，紫外线辐射暴露也诱导了黑色素瘤（Setlow等人，1989年）。在其他鱼类物种的研究中，也提出了环境化学物质与色素细胞增生或肿瘤之间的关联（Kimura等人，1989年；Okihiro等人，1993年；Ramos等人，2013年），尽管未确定具体污染物。Memphremagog湖是一个面积为1780平方公里的天然湖泊，位于美国佛蒙特州北部和加拿大魁北克南部。三条主要的佛蒙特州河流——Clyde河、Barton河和Black河流入该湖，提供了湖泊70%的流域面积。湖泊的出水口是魁北克的Magog河，最终流入圣劳伦斯河。该湖是重要的休闲和生计渔业资源，也是某些加拿大社区的饮用水来源；然而，由于磷和其他水质问题，它被列为受污染湖泊（https://dec.vermont.gov/sites/dec/files/wsm/Basin172015.pdf；Gerhardt，2018年）。在Memphremagog湖中持续观察到褐头鲶鱼的黑色素病变。此外，现在在新罕布什尔州和缅因州的几个池塘中也观察到了这些病变（本研究）。因此，公众和管理机构对这些病变的成因和促成因素感到担忧，这些病变也可能对人类或生态系统健康产生不利影响。为了确定这些病变的风险因素和潜在促成因素，一个多学科团队开发了一套全面的终点指标。本文介绍了时间和空间发病率数据；发病率与年龄、性别和形态测量指标的关联；化学分析以及与微观病理学和病变进展的关系。
2 材料与方法
2.1 野外方法
2014年至2020年（5月至8月），VFWD在佛蒙特州Memphremagog湖的Scott's Bay和South Bay地区进行了电捕鱼调查，以确定发病率和相关形态测量参数。所有收集的褐头鲶鱼都进行了测量（总长度，毫米），并记录了黑色素病变。2023年5月，为了评估空间分布、发病率和潜在风险因素，在湖泊的七个地点（图1A）进行了电捕鱼调查。佛蒙特州的四个地点是SC、South Main Lake（SML）、South Bay（JR）和North Main Lake（HC）；魁北克的三个地点是Sargent's Bay（SB）、Fitch Bay（FB）和Cherry River口处的Magog（MA）。所有捕获的褐头鲶鱼都进行了测量，并记录了病变。此外，还对10条临床正常的褐头鲶鱼和10条有黑色素病变的褐头鲶鱼进行了完整的尸检。鱼类被放置在充氧桶中，并按照美国地质调查局东部生态科学中心批准的野生鱼类健康调查机构动物护理和使用协议（EESC 2021-18L）进行尸检。鱼类使用缓冲的三氯甲烷磺酸盐（Syndel USA，350 mg/L）和碳酸氢钠（1:1比例）在湖水中稀释后安乐死，称重（克），测量（毫米），并使用带有22号针头的肝素化3毫升注射器从尾部血管抽取血液。血液被放入含有肝素钠的Vacutainer容器中（Thermo Fisher Scientific，美国罗克维尔），并在湿冰上保存直至离心（4小时内）。血浆被收集并分装到冷冻管中，然后储存在干冰上直至放入-80°C的冷冻柜中。外部异常情况被记录并拍照。正常皮肤、病变皮肤和肝脏组织的小块（约30毫克）被保存在RNAlater稳定溶液中（ThermoFisher）用于分子分析。正常皮肤、病变皮肤、前肾和后肾、脾脏、鳃和生殖腺组织被保存在Z-fix中（Anatech Ltd.，美国密歇根州Battle Creek）用于组织病理学分析。脑组织被取出并放在干冰上用于基因分析，耳石被取出并干燥保存在硬币信封中用于年龄分析。剩余的尸体被冷冻。条件因子（KtL）使用公式KtL = 100 × (体重/总长度³)计算，其中体重以克为单位，长度以厘米为单位。2024年5月，在缅因州的Hermon Pond（图1B）进行了褐头鲶鱼的调查，该池塘面积为187公顷，水浅（最大深度=5.2米），是温水休闲钓鱼池塘。共捕获62条褐头鲶鱼，称重并检查了黑色素病变。如上所述，收集了5条正常个体和5条有病变的个体进行尸检。2025年6月，在新罕布什尔州的Village Pond（图1B）收集了73条褐头鲶鱼，称重并检查；9条正常个体和16条有病变的个体进行了尸检。Village Pond是一个人工池塘，面积为14公顷，位于Alshuelot河流域。
2.2 实验室分析
用于组织学的组织被修剪成切片，通过分级酒精处理后嵌入石蜡中。切片厚度为5微米，常规用苏木精和伊红（Luna 1992）染色，以便通过光学显微镜评估。耳石使用West System 105环氧树脂和West System 205硬化剂（West System，Gougeon Brothers Inc.，美国密歇根州Bay City）嵌入，并放置24小时。凝固的环氧树脂随后用带有金刚石锯齿刀片的Isomet低速精密切割机切割（Buehler，美国伊利诺伊州Lake Bluff）。切割后的切片用30微米抛光膜（Precision Surfaces International，美国德克萨斯州休斯顿）进行打磨和抛光，整个过程中保持薄膜湿润。抛光过程中间歇性地检查耳石。抛光的耳石浸入矿物油中，并在Richter Optica U-2D生物显微镜下以10倍放大率观察。通过计数耳石的年轮来估计每条褐头鲶鱼的年龄。两名VFWD渔业生物学家独立审查每个样本以确保准确性。91.3%的样本年龄测定结果一致，而16个样本（8.2%）的年龄差异为1年，需要重新读取以达成共识。通过量化褐头鲶鱼皮肤中23种元素的总可回收浓度来表征元素（金属和类金属）的吸收和暴露情况。冷冻的尸体部分解冻，从17条临床正常的鱼（SML、SC、MA各4条，FB 5条）和17条有黑色素病变的鱼（SML和SC各3条，HC 1条，FB 4条）中各取出约1克皮肤。此外，还分析了来自赫尔蒙池塘的四条临床正常的鱼和四条具有黑色素病变的鱼的皮肤。组织被放置在10毫升的聚乙烯管中，并通过干冰在夜间运送到美国地质调查局位于密苏里州哥伦比亚的环境研究中心进行检测。组织使用切割玻璃棒手动匀浆后，通过冻干（VirTis EL-35；Scientific Products，美国宾夕法尼亚州威斯敏斯特）处理，以便基于干重（dw）进行分析。随后，组织在高温纯度、自制蒸馏的浓硝酸和30%过氧化氢中通过升温法进行微波消化（MARS6；CEM Corporation，美国北卡罗来纳州马修斯）。这种总回收方法旨在获取金属的生物可利用部分（例如，EPA方法3050B；US EPA 1996）。然后使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）根据类似于EPA方法6020B的方法（US EPA 2014）量化消化物中的元素浓度。质量控制措施包括使用NIST可追溯的校准标准、二次源初始和持续校准验证标准、实验室对照溶液、认证参考材料、方法和分析加标物以及重复实验和干扰检查。所有质量控制结果均符合方法要求。结果在估计的方法定量限（LOQ；使用误差传播方法估计；Long和Winefordner 1983）处进行了审查。分析物和检测限列在表S1中。
2.3 统计分析
数据使用GraphPad Prism版本10.1.2（GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州拉霍亚）进行分析。由于数据未通过Shapiro-Wilk正态性检验，因此使用Mann-Whitney检验比较了每个地点的可见正常鱼和病变鱼之间的差异。所有检验中使用的p值为0.05以表示显著性。
3 结果
3.1 视觉观察
黑色素病变从小的、不凸起的斑点到略微凸起的大面积区域不等，有时会覆盖身体的50%以上。黑色素病变出现在身体表面、鳍、嘴唇以及口腔内部（图2）。一些可能是转移的黑色素区域也出现在鳃和内脏器官中，包括大脑、肠道和卵巢（图3）。
3.2 梅姆弗雷莫戈湖中黑色素病变的流行情况
在2014年至2020年的调查中，仅在体长200毫米或更大的褐头鱼（BBH）中观察到黑色素病变。共检查了61条体长小于200毫米的BBH，发现它们没有病变。在JR地点，收集了283条体长200毫米或更大的BBH，其中33.6%有黑色病变；在SC地点，576条体长200毫米或更大的BBH中有33.5%有黑色病变。将个体按24毫米的长度类别分组以比较不同长度类别的流行情况。通过合并两个地点的所有年份的数据进行了比较（图4）。病变的流行率通常随着鱼体长的增加而增加，达到324毫米后开始下降；然而，每个长度组的样本量不同，因此无法进行明确比较。
3.2.1 梅姆弗雷莫戈湖中具有黑色素病变的褐头鱼的比例
在2014-2020年间收集的梅姆弗雷莫戈湖（South Bay和Scott's Cove）中的褐头鱼中，只有体长200毫米或更大的鱼出现了黑色素病变。条形图中的数字表示每个长度类别中收集的鱼的总数。与往年一样，2023年也只观察到体长200毫米或更大的鱼有黑色素病变。在六个地点共捕获并检查了78条体长小于200毫米的BBH（SC：n=50，SML：n=6，JR：n=8，HC：n=7，SB：n=6，FB：n=6）。合并所有地点的数据后，共检查了427条体长200毫米或更大的BBH，其中26.5%有黑色素病变。临床正常的BBH的平均长度（241.5±1.8毫米）显著（p<0.001）短于有黑色素病变的BBH（267.3±3.2毫米）。梅姆弗雷莫戈湖七个采样地点中，体长200毫米或更大的BBH的黑色素病变流行率从JR的18%到HC的42%不等（图5）。
3.2.2 2023年梅姆弗雷莫戈湖（South Bay和Scott's Cove）中具有黑色素病变的褐头鱼的比例
3.3 其他地点的黑色素病变流行情况
从缅因州的赫尔蒙池塘共捕获并检查了62条体长在203至322毫米之间的BBH，其中29%有黑色素病变。对五条临床正常的BBH和五条有病变的BBH进行了尸检；其中有三条有病变的BBH是雄性，五条是雌性。在尸检的10条鱼中，正常和病变个体在长度、重量、年龄或状况因子方面没有显著差异（表1）。
3.4 组织病理学
正常BBH的皮肤由表皮和真皮组成，下面是皮下层和脂肪层。表皮的基底层含有柱状上皮细胞，这些细胞在外层转变为鳞状细胞；还有较大的棒状细胞（警报细胞）和较小的黏液细胞（杯状细胞）。偶尔在表皮中观察到黑色素细胞，以及味蕾和凹坑器官。表皮的基底膜将其与真皮分隔开，真皮由致密的纤维结缔组织构成。一层黑色素细胞沿着基底膜排列（图6A）。
3.4.1 梅姆弗雷莫戈湖中黑色素病变的流行情况
3.4.2 其他地点的黑色素病变流行情况
在缅因州的赫尔蒙池塘共捕获并检查了62条体长在203至322毫米之间的BBH，其中29%有黑色素病变。在新罕布什尔州的Village Pond共捕获并检查了73条BBH，体长在105至210毫米之间。在体长超过158毫米的BBH中，22%有黑色素病变。在该地点，没有对鱼进行性别鉴定，也没有保存生殖腺用于组织学研究。在尸检的25条鱼中，正常和病变个体在长度、重量或年龄方面没有显著差异；然而，正常鱼的平均状况因子较高（表1）。
3.4.3 组织病理学
正常BBH的皮肤由表皮和真皮组成，下面是皮下层和脂肪层。表皮的基底层含有柱状上皮细胞，这些细胞在外层转变为鳞状细胞；还有较大的棒状细胞（警报细胞）和较小的黏液细胞（杯状细胞）。偶尔在表皮中观察到黑色素细胞，以及味蕾和凹坑器官。表皮的基底膜将其与真皮分隔开，真皮由致密的纤维结缔组织构成。一层黑色素细胞沿着基底膜排列（图6A）。
3.4.4 更高级病变的显微镜观察
在更高级的病变中，表皮层丧失，伴有细胞坏死和脱落，许多是棒状细胞。在皮下组织和肌肉组织中常见囊化的吸虫。在某些样本中，观察到脂肪层（c）的炎症（c）、异常的肌肉（d）以及囊化的吸虫（e）。在某些鱼中，脂肪细胞（b）周围出现了类脂质/脂褐素色素（a）。下面的肌肉纤维（c）异常，但炎症较轻。临床正常BBH的皮肤和皮下组织中观察到病理变化，包括棒状细胞的增殖，其中一些细胞的细胞质出现空泡化，皮下组织中有炎症灶和含色素的细胞（图6B）。在更严重的病变中，表皮层丧失，伴有细胞坏死和脱落，许多是棒状细胞。不同地点的正常鱼和病变鱼在形态学上存在差异，但并不总是显著不同（表1）。新生的黑色素细胞主要分布在真皮和皮下组织中，表皮中的数量较少，这些细胞形态多样，色素含量也各不相同。在该区域的一些细胞呈梭形，几乎不含色素（图8B）。表皮中的大多数色素细胞（推测为黑色素巨噬细胞）体积较小，呈圆形，细胞核偏心，色素颜色从黄褐色到黑色不等。表皮组织中存在游离的黑色颗粒，这些颗粒被认为是黑色素体（图8C）。在其他隆起的病变部位，表皮较薄，未观察到大的假囊肿，但存在色素细胞。下方的真皮、皮下组织和肌肉层受到破坏，并充满了色素细胞和炎症细胞（图8D）。这些更严重的病变部位的表皮中含有色素细胞，这些细胞通常位于空泡化区域，并伴有炎症细胞。表皮上皮细胞常被细胞膜的突起形成的小细胞间隙所包围（图8E）。
图8：显示了晚期、隆起的黑色素病变的显微外观。(A) 切片显示了新生的黑色素细胞在真皮中的增生情况，以及表皮中黑色素巨噬细胞的增生。(B) 真皮和皮下层的黑色素细胞在形态、大小和色素含量上存在差异；部分细胞呈延长状（箭头所示）。(C) 表皮中的黑色素巨噬细胞为小型圆形细胞，细胞核偏心，含有不同量的色素；还存在游离的黑色素体（红色箭头所示）。(D) 隆起的病变主要由真皮及下方组织中的增生黑色素细胞构成；表皮中存在色素细胞（箭头所示）。(E) 放大后的表皮显示，表皮细胞出现空泡化现象，其中含有色素细胞（b）和炎症细胞（白色箭头所示）。细胞膜的突起在表皮细胞周围形成了小空泡（黑色箭头所示）。
在临床正常的和病变的褐头鲶鱼（BBH）的其他器官中也发现了与转移无关的显微病变。鳃部出现了细胞变化，包括导致次级鳃片融合的增生（图9A）、细胞坏死和炎症（图9B），以及含有脂褐素的细胞的积累，偶尔还含有黑色素细胞（图9C）。在脾脏（图9D）和前后肾脏中观察到了大量含有脂褐素的巨噬细胞聚集。在Lake Memphremagog，肝脏肿瘤的发生率较低（6%），而在Hermon Pond为10%。
图9：显示了褐头鲶鱼组织中的细胞变化，这些变化表明了氧化损伤的存在。(A) 鳃部的上皮增生区域和次级鳃片的融合。(B) 方框内区域的放大图显示了含有细胞碎片的空泡化区域、增生以及次级鳃片的破坏（b）和炎症（白色箭头所示）。(C) 在次级鳃片之间的增生上皮细胞中存在含有黄褐色脂褐素色素的细胞（a）；这些细胞也存在于初级鳃片组织中（白色箭头所示），同时还有含有黑色素细胞的细胞（黑色箭头所示）。脾脏组织中含有大量的巨噬细胞聚集。
3.5 污染物分析
3.5.1 元素浓度分析
对皮肤组织进行了23种元素的检测（表S1）。在所有样本中均未检测到7种元素（铝、铍、镉、铊、铋、钍和铀）。在Lake Memphremagog，钒、钼、银、锡和锑的检测频率较低，其浓度略高于定量限。在4个具有黑色素病变的皮肤样本中检测到了铬，浓度范围为0.1至0.84 μg/g，但在正常皮肤样本中未检测到铬。镍和铅在正常和黑色素皮肤样本中的检测频率和浓度均较低。锰（Mn）、钴（Co）、铜（Cu）、锌（Zn）、硒（Se）和钡（Ba）在所有样本中均被检测到，而砷（As）和铁（Fe）在大多数样本中的检测浓度超过了定量限（As为88%，Fe为98%）。对于这8种元素，我们比较了临床正常皮肤和具有黑色素病变皮肤中的浓度。对于未检测到的元素，我们用定量限代替其浓度进行统计分析。所有8种元素在临床正常皮肤和具有黑色素病变的皮肤之间均有显著差异，其中黑色素病变皮肤中的元素浓度更高，除了钡（Ba在临床正常皮肤中的浓度更高，见表2）。
表2：比较了美国Vermont州Lake Memphremagog和加拿大魁北克省具有和没有黑色素病变的褐头鲶鱼皮肤中元素的浓度（μg/克干重）。
| 元素 | 黑色素病变（n=17） | 正常皮肤（n=17） | 显著性 |
|------------------|------------------|------------------|------------------|
| 铁（Fe） | 105.0 ± 17 | 34.0 ± 5.8 | p < 0.001 |
| 锰（Mn） | 5.2 ± 1.1 | 2.0 ± 1.8 | p < 0.001 |
| 钴（Co） | 0.11 ± 0.01 | 0.07 ± 0.01 | p = 0.002 |
| 铜（Cu） | 3.1 ± 0.2 | 2.5 ± 0.3 | p = 0.037 |
| 锌（Zn） | 613.4 ± 88.4 | 72.2 ± 8.4 | p < 0.001 |
| 砷（As） | 2.6 ± 0.6 | 0.3 ± 0.1 | p < 0.001 |
| 硒（Se） | 3.6 ± 0.5 | 1.1 ± 0.1 | p < 0.001 |
| 钡（Ba） | 1.2 ± 0.2 | 3.1 ± 0.4 | p < 0.001 |
在Hermon Pond，锌（Zn）、砷（As）、硒（Se）和钡（Ba）在具有黑色素病变的鱼类皮肤中的浓度显著高于正常皮肤。在Lake Memphremagog和Hermon Pond，砷（As）、硒（Se）和锌（Zn）在正常和病变的褐头鲶鱼皮肤样本之间的差异最大（图10）。
图10：显示了在美国Vermont州Lake Memphremagog和加拿大魁北克省收集的褐头鲶鱼（Ameiurus nebulosus）黑色素病变（黑色条形图）和正常皮肤（灰色条形图）中的金属浓度（条形图上方为Lake Memphremagog，下方为Hermon Pond）。(A) 砷。（B) 硒。（C) 锌。
4 讨论
在三个研究水域收集的褐头鲶鱼中观察到的黑色素病变从小的、不隆起的黑斑到较大的、不隆起或略微隆起的黑色素区域，再到大的隆起病变都有。许多受影响的鱼类同时表现出不隆起和隆起的病变。显微皮肤病理学检查显示了细胞损伤、癌前增生病变和肿瘤形成。我们的研究结果表明，长期暴露于氧化损伤的引发因素和促进因素、炎症、细胞坏死以及多种细胞类型的增生可能会导致癌症发生。早期的病理变化包括表皮中棒状细胞的增生、炎症以及真皮和皮下组织中的脂褐素积累（氧化损伤的标志）。此外，其他组织如鳃部、前肾和脾脏也显示出氧化损伤的迹象，表现为脂褐素色素和巨噬细胞聚集。2012年首次在Lake Memphremagog报告了这些黑色素病变（Blazer, Shaw等人，2020年）。在之前的鱼类调查中并未记录到这些病变，因为那些调查并未将褐头鲶鱼作为目标物种；直到2012年公众报告这些病变后，才开始了对褐头鲶鱼的专门监测（J. Kratzer，VFWD个人通讯）。2011年，热带风暴Irene在该地区引发了广泛的洪水和径流，人们担心这场风暴将致癌物质带入Memphremagog水域的排水系统。迄今为止的监测主要集中在采集水样和整鱼或鱼片样本上。有一些针对其他鱼类的研究分析了皮肤中的污染物，结果显示皮肤可以积累特定污染物（如金属，Uysal 2011年），且其浓度高于其他组织。研究表明，去除鱼片上的皮肤后，鱼类体内的化学物质浓度会降低。例如，去除皮肤后，鲑鱼样本中的亲脂性污染物（多氯联苯、DDT、DDE、DDD、米雷克斯、α-氯丹、六氯苯和八氯苯）的浓度显著降低（Zhang等人，2013年）。因此，为了理解观察到的不良影响，可能需要关注在特定组织中积累的污染物。具有黑色素病变的鱼类皮肤中砷（As）浓度升高，这表明砷的吸收和暴露可能是一个重要风险因素。砷的来源包括工业和农业领域，因为它被用于生产油漆、杀虫剂和其他农药，同时也存在于土壤改良剂、鸡粪和污水处理厂的污泥中（Missimer等人，2018年）。天然来源的砷包括基岩风化，这会导致土壤、沉积物和地下水中砷浓度升高。在新罕布什尔州和缅因州，近30%的基岩含水层井中的砷浓度超标（Ayotte等人，2003年），超过了美国环境保护署规定的最大允许浓度（10 μg/L）。在Vermont州中北部和东部的井中，包括Lake Memphremagog流域的井中，砷浓度也较高（Corenthal，2010年）。如果砷的来源主要是自然的（而非近期污染），那么其他风险因素可能也是病变发展成黑色素瘤的必要条件。砷是一类1级致癌物，容易在皮肤中积累，长期暴露与皮肤病变（包括色素沉着、角化过度和皮肤癌风险增加）有关（Yu等人，2006年；Karagas等人，2015年；Wang等人，2025年）。氧化损伤被认为是砷致癌的主要因素；因此，皮肤和其他器官中观察到的氧化损伤迹象支持砷在这些病变发展中的作用。研究表明，砷除了导致细胞损伤外，还会引起基因损伤。对病变皮肤的基因分析发现了许多核DNA和线粒体DNA的单核苷酸变异（Curd等人，2025年）。在人类中，染色体异常和生长因子的改变已被确定为砷的作用机制之一，砷已被证明是一种协同致癌物或致癌促进因子，尤其是与紫外线（UVR）共同作用时。例如，砷与紫外线的协同作用使突变负担增加了两倍以上（Speer等人，2023年）。然而，单独暴露于砷也会导致线粒体损伤和突变（Lee和Yu，2016年）。异型线粒体DNA缺失的发生与持续暴露有关，随着暴露的持续，会导致不同的缺失模式（Partridge等人，2007年）。这些与砷相关的突变或凋亡抑制基因的沉默与基因组不稳定有关，从而使受损细胞存活（Bhattacharjee等人，2013年）。具有黑色素病变的鱼类皮肤中锌（Zn）浓度的升高可能是另一个风险因素。与砷不同，锌是一种必需矿物质，但在高浓度下可能具有毒性。一些锌暴露的鱼类中出现了生理和生化机制的紊乱，导致离子调节效应和氧化损伤（Loro等人，2012年），以及免疫调节异常（Dunier，1996年）。在高剂量锌摄入的情况下，锌可能促进黑色素瘤肿瘤的发展（Narayan等人，2024年）。因此，锌可能与砷和其他压力因素共同作用于黑色素瘤的发展。在临床正常鱼类中观察到的砷浓度升高表明，砷的吸收和暴露可能是一个重要风险因素。砷的来源包括工业和农业领域，因为它被用于生产油漆、杀虫剂和其他农药，也存在于土壤改良剂、鸡粪和污水处理厂的污泥中（Missimer等人，2018年）。天然来源的砷包括基岩风化，这会导致土壤、沉积物和地下水中砷浓度升高。在新罕布什尔州和缅因州，近30%的基岩含水层井中的砷浓度超标（Ayotte等人，2003年），超过了美国环境保护署规定的最大允许浓度。Vermont州中北部和东部的井中砷浓度也较高（Corenthal，2010年）。如果砷的来源主要是自然的（而非近期污染），那么其他风险因素可能也是病变发展成黑色素瘤的必要条件。砷是一种1类致癌物，容易在皮肤中积累，长期暴露与皮肤病变（包括色素沉着、角化过度和皮肤癌风险增加）有关（Yu等人，2006年；Karagas等人，2015年；Wang等人，2025年）。氧化损伤被认为是砷致癌的主要因素；因此，皮肤和其他器官中观察到的氧化损伤迹象支持砷在这些病变发展中的作用。研究表明，砷除了导致细胞损伤外，还会引起基因损伤。对病变皮肤的基因分析发现了许多核DNA和线粒体DNA的单核苷酸变异（Curd等人，2025年）。在人类中，染色体异常和生长因子的改变已被确定为砷的作用机制之一，砷已被证明是一种协同致癌物或致癌促进因子，尤其是与紫外线共同作用时。例如，砷与紫外线的协同作用使突变负担增加了两倍以上（Speer等人，2023年）。然而，单独暴露于砷也会导致线粒体损伤和突变（Lee和Yu，2016年）。异型线粒体DNA缺失的发生与持续暴露有关，随着暴露的持续，会导致不同的缺失模式（Partridge等人，2007年）。这些与砷相关的突变或凋亡抑制基因的沉默与基因组不稳定有关，从而使受损细胞存活（Bhattacharjee等人，2013年）。具有黑色素病变的鱼类皮肤中锌浓度的升高可能是另一个风险因素。与砷不同，锌是一种必需矿物质，但在高浓度下可能具有毒性。一些锌暴露的鱼类中出现了生理和生化机制的紊乱，导致离子调节效应和氧化损伤（Loro等人，2012年），以及免疫调节异常（Dunier，1996年）。在高剂量锌摄入的情况下，锌可能促进黑色素瘤肿瘤的发展（Narayan等人，2024年）。因此，锌可能与砷和其他压力因素共同作用于黑色素瘤的发展。在黑色素病变的发展过程中观察到了与三种主要细胞类型（棒状细胞、黑色素细胞和黑色素巨噬细胞）相关的变化。临床正常皮肤中的早期病变涉及棒状细胞的增生，这种细胞存在于某些鱼类中。表皮中的棒状细胞传统上被称为警报物质细胞，因为当皮肤受损时，这些细胞会向同类释放化学警报分子。最近的研究表明，棒状细胞在抵抗紫外线和免疫中起着保护作用（Chivers等人，2007年；Pandey等人，2021年）。棒状细胞对多种压力因素有反应，包括金属暴露（Iger等人，1994年）。特别是，据报道棒状细胞在砷暴露后会增生（Sankhla等人，2024年）。棒状细胞中的蛋白质成分可能导致与蛋白质结合的物质的积累，如全氟烷基物质（PFAS）（Liu等人，2019年）。因此，这些细胞的增生和随后的坏死可能是对多种环境毒素长期暴露的反应。许多研究表明，鱼类黑色素细胞会对各种感染性和非感染性损伤作出反应。例如，某些吸虫寄生虫会引发黑色素细胞的反应，导致黑斑病的发生（Charo-Karisa等人，2021年）。斑驳鲈鱼综合征是由Adomavirus引起的，这种病毒会在表皮中诱导黑色素细胞的反应（Blazer等人，2020年；Iwanowicz等人，2025年）。斑马鱼（Zebra Danio，Danio rerio）的炎症已被证明会招募黑色素细胞和黑色素母细胞到组织损伤部位（Lévesque等人，2013年）。黑色素是一种复杂的聚合物，可以吸收和中和自由基和其他潜在有毒化合物。许多化学物质已被证明可以与黑色素结合，最终导致慢性病变。这些化学物质包括金属（如铜、锰和锌）、除草剂和多环芳烃；金属和除草剂的共同暴露可能增加结合亲和力。这种结合可能是为了保护作用，但长期暴露会导致不良后果（Larsson，1993年综述）。仅在成年个体中观察到BBH黑化病变的现象表明，长期暴露可能是一个重要因素。如图9D所示，色素化的巨噬细胞（或称为黑色素巨噬细胞）多年来一直被用作环境压力因素暴露的生物指标（Wolke 1992；Agius和Roberts 2003），并且已经证明它们能够积累金属（Barst等人2015）。早期研究表明，这些细胞内的黑色素颗粒是由受损的黑色素细胞释放的黑色素体被吞噬后形成的。最近的研究认为，黑色素巨噬细胞是初级黑色素生成的发生地，其功能是隔离细胞降解产物，包括ROS损伤。脂质生成色素（蜡样脂质和脂褐素）是通过氧化过程从细胞成分中产生的（Agius和Roberts 2003）。在研究鲑鱼肌肉中的黑化病灶时，发现随着病情的发展，无色素化的巨噬细胞会在原位转变为色素化的黑色素巨噬细胞（Bjørgen和Koppang 2024；Bjørgen等人2024）。鱼类有两种主要类型的巨噬细胞：M1巨噬细胞主要参与急性炎症反应，而M2巨噬细胞则与组织修复更为相关（Forlenza等人2011）。在鲑鱼的黑化病灶中发现M2极化的黑色素巨噬细胞，这表明这种极化在激活巨噬细胞内的黑色素合成中起作用（Bjørgen和Koppang 2024）。此外，这些细胞被认为参与了环境污染物的解毒过程，部分原因是由于黑色素具有清除作用（Fenoglio等人2005）。需要进一步的研究来明确识别这些细胞类型并阐明黑化病灶内的反应机制。对于黑化病灶的另一种假设是可能存在一种新型的可传播肿瘤。然而，目前没有证据支持这种传播；这一假设是基于从病灶皮肤样本与脑组织样本中检测到的遗传变异（线粒体和核基因）的数量差异（Curd等人2025）。可传播肿瘤被定义为那些已经进化出通过直接转移寄生性癌细胞克隆来感染其他个体的肿瘤（Ostrander等人2016）。已经确定了一些因素对于癌症的成功水平传播是必要的，包括大量“癌细胞”的脱落，这些细胞能够在宿主体外存活、逃避新宿主的免疫系统并在新宿主体内增殖（Dujon等人2020）。然而，一些观察结果对这一假设在BBH黑化病灶中的适用性提出了质疑。首先，这些病灶出现在整个湖泊以及东北地区的其他不相连的水体中。由于Brown Bullhead鱼的活动范围小且行为主要在底部，因此它们容易接触到水传播和沉积物相关的污染物（Sakaris等人2005；Rafferty等人2009）。虽然我们不知道关于Memphremagog湖中BBH鱼类的移动研究，但其他研究表明它们的长距离移动能力有限。在Presque Isle Bay和Lake Erie AOC，通过遥测标记研究追踪了与繁殖相关的移动情况，发现成年个体的活动具有固定性，表明它们是有效的指示物种，因为大多数成年个体长期居住在某一地点（Millard等人2009）。同样，超声波遥测研究也证实了成年BBH鱼在Anacostia河中的定居情况（Sakaris等人2005），这引发了关于BBH的寄生性癌细胞如何能够在大型湖泊（长度50公里，流域面积1780平方公里）以及其他遥远水体中传播的问题。目前尚未证明这些细胞能够在湖泊或池塘水中存活并入侵和增殖。显微病理学证据支持细胞和突变（遗传）变化的发展。黑色素瘤是人类中突变率最高的肿瘤之一（Davis等人2018）。例如，在一项研究中，黑色素瘤细胞中的体细胞突变频率从每兆碱基0.1到100不等（Alexandrov等人2013）。有趣的是，正常人类皮肤每兆碱基也有2到6个突变，与其他某些肿瘤类型相似（Martincorena等人2015）。虽然紫外线暴露被认为是哺乳动物黑色素瘤的主要诱因，但它仅占皮肤黑色素瘤可归因风险的40%-50%（Meyskens和Yang 2010）。氧化应激在黑色素瘤的发病和进展中起作用（Venza等人2015综述），并且越来越多的证据表明金属在黑色素瘤发展中起作用（Meyskens和Yang 2010；Narayan等人2024）。此外，转基因斑马鱼模型多年来被用于研究黑色素瘤的进展和潜在治疗方法。虽然转基因斑马鱼的肿瘤可以通过两个基因突变引发，但需要4-6个月的时间才能发展出来，而到那时已经产生了数千个额外的突变（Kansler等人2017）。因此，确定BBH黑化病灶各个阶段的基因突变（类型和频率）非常重要。鱼类皮肤，包括经常暴露于环境和沉积物中的BBH鱼，可能具有更高的突变率。不同组织之间的单核苷酸变异存在显著差异，这取决于突变来源（Gomez-Ramos等人2014；Yu等人2024）。因此，比较大脑与皮肤中晚期病灶的基因变异可能并不合适。如图8A,D所示，从病灶中提取的样本将包含受影响的上皮细胞和表皮中的较小圆形黑色素巨噬细胞的DNA，以及增殖和肿瘤性的真皮黑色素细胞，这就提出了一个问题：这些细胞中哪一种是假设中的克隆性、可传播的癌细胞。正如Bjørgen和Koppang（2024）所指出的，“鱼并不是人类”，它们可能已经进化出了自己应对生物和化学挑战的方法，而这些方法我们尚未完全理解。因此，有必要比较临床正常鱼类、外观正常的受影响个体的皮肤以及早期到晚期病灶的DNA变异和转录组，以了解与这些病灶相关的因素以及BBH为应对这些压力因素所采取的反应。识别这些病理反应的潜在启动因素和促进因素有助于更好地管理鱼类、人类和生态系统的健康。还需要考虑砷（As）与其他环境因素（如藻类毒素、病毒和尚未识别的污染物）的潜在协同效应。气候变化和由于营养物质（如磷）过量导致的富营养化为蓝藻的大量繁殖及其多种毒素的产生创造了理想条件，其中许多毒素尚未得到充分研究（Falfushynska等人2023综述）。Memphremagog湖遭受富营养化和有害藻类大量繁殖的影响（Foulon等人2020）；其他含有黑化病灶的池塘中的富营养化也表明这些水体中也可能出现藻类毒素（Bunyon等人2023）。藻类毒素与癌症的发病和进展有关，会导致氧化应激、DNA损伤和细胞信号通路的紊乱（Rajput等人2024）。某些藻类毒素已被证明会导致人类皮肤毒性；然而，尚未发现蓝藻暴露与黑色素瘤之间的直接关联；但根据流行病学数据，某些藻类毒素可能是黑色素瘤的重要风险因素（Backović等人2020）。病毒是另一个需要考虑的潜在风险因素。对组织DNA和RNA序列进行了微生物（包括病毒）的筛查。虽然检测到了病毒，但没有发现任何与分析的肿瘤组织特异性相关的病毒（Curd等人2025）。可能需要进一步分析以确定是否有病毒可能是早期病灶的启动因素。在五个站点测量了BBH鱼血浆中的PFAS浓度（Blazer等人2026）。浓度较低，受影响的个体并没有比临床正常个体更高的浓度。然而，像测量金属一样，在实际皮肤样本中测量PFAS可能很重要，因为PFAS倾向于与蛋白质结合（Liu等人2019），因此可能在俱乐部细胞中积累，最终导致氧化损伤和坏死。在Ictalurus punctatus鲶鱼和其他鱼类物种中，去皮后的皮肤中的PFAS浓度高于带皮的皮肤（Figueroa-Muñoz等人2025）。皮肤也是虹鳟鱼Oncorhynchus mykiss中PFAS的主要靶组织之一（Goeritz等人2013）。总之，关于鱼类的黑化病灶还有很多需要了解的地方，包括生物和化学风险因素的潜在协同效应，以及黑色素细胞和经典免疫细胞（如巨噬细胞）在病灶发展和进展中的作用。这里的结果表明，砷（As）和锌（Zn）可能在黑化病灶的发展中起作用。黑色素细胞和黑色素巨噬细胞会对氧化损伤作出反应，但目前尚不清楚长期暴露于砷和生物累积是否最终会导致肿瘤性病灶，或者是否有其他风险因素（如锌、藻类毒素、UVB或其他污染物）作为致癌的促进因素。正在进行的研究集中在对皮肤样本进行额外的化学测试和转录组分析，以确定这些病灶发病和进展中的关键途径。利用激光显微解剖组织切片来识别多种细胞类型（俱乐部细胞、黑色素细胞和黑色素巨噬细胞）中的基因变异和差异基因表达，有助于准确确定相关因素。解决可传播肿瘤的假设将包括尝试确定黑化细胞在湖泊和池塘水中的存活能力，以及受影响的BBH鱼是否能够将癌症传播给同一水体中的外观正常的个体，或者通过共存传播给未受影响的个体。
作者贡献：
Matthew Pehrson：调查、写作、审稿和编辑、资源提供。
Matthew Bodnar：调查、方法学、写作、审稿和编辑。
Thomas Jones：概念化、调查、写作、审稿和编辑、资源提供。
Cheyenne R. Smith：可视化、写作、审稿和编辑、调查。
Peter Emerson：概念化、调查、资金获取、写作、审稿和编辑、资源提供。
Mark J. Henderson：写作、审稿和编辑、项目管理。
Danielle Cleveland：调查、写作、审稿和编辑、验证、方法学、正式分析。
Patricia M. Mazik：写作、审稿和编辑、资金获取、项目管理。
David R. Russell：调查、写作、审稿和编辑、资源提供。
Vicki S. Blazer：概念化、调查、资金获取、写作、初稿撰写、方法学制定。
致谢：
我们感谢佛蒙特州、新罕布什尔州、缅因州和加拿大魁北克省的众多鱼类生物学家和技术人员在Brown Bullhead鱼类采集工作中的帮助。我们特别感谢魁北克环境、气候变化行动、野生动物和公园部的Jean-Sebastien Messier在地点选择和采样方面的协助，感谢Memphremagog地区县政府、Magog市的David Largy以及Robert Benoit为野外采样提供的庇护；感谢Lindsey Hartzell和Lydia Reed在鱼类尸检方面的帮助；感谢Adam Sperry和Sean Walsh在组织病理学切片制备方面的帮助，以及Vanessa Melton在皮肤样本微波消化方面的协助。还要感谢Stephanie Gordon在地图制作方面的帮助。任何使用商业名称、公司名称或产品名称仅用于描述目的，并不意味着美国政府的认可。
资金支持：
本研究得到了Eastern Ecological Science Center、美国地质调查局生态系统任务区合作鱼类和野生动物研究单位以及Vermont Dingle-Johnson通过Sport Fish Restoration Act和Wildlife Service提供的资金支持。
伦理声明：
该协议和程序已由美国地质调查局Eastern Ecological Science Center的机构动物护理和使用委员会审查并批准。
利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可在ScienceBase上公开获取：https://doi.org/10.5066/P1RTUEKV。
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