彭宇飞 | 周凡超 | 何立明 | 李双江 | 杨宇杰 | 江彤 | 徐树森 | 谢晓燕
湖南中医药大学口腔医学院，中国长沙，410208
摘要
口腔阿弗他溃疡是一种常见的口腔黏膜炎症性疾病，会引起显著的疼痛和功能障碍。传统治疗方法无法实现全面的组织再生，部分原因是单一生长因子无法模拟生理愈合所需的多种信号分子之间的复杂相互作用。为了解决这一问题，我们开发了一种多功能漱口水，其中整合了五种关键生长因子（PDGF、TGF-β、IGF、VEGF和bFGF）以及抗菌剂十六烷基吡啶氯化物（CPC）。这种设计模仿了内源性生长因子的自然协同作用，将促再生信号与强大的抗菌活性相结合。体外实验表明，这种协同配方能够促进上皮细胞和内皮细胞的增殖，加速细胞迁移，促进血管网络形成，并使巨噬细胞向修复型表型转变，同时保持高杀菌效力而不影响蛋白质的生物活性。在大鼠口腔溃疡模型中，局部使用该漱口水显著加快了黏膜闭合速度，增加了胶原蛋白沉积，促进了血管生成，并抑制了促炎细胞因子的表达。这些发现表明，在稳定的抗菌微环境中协同释放多种生长因子可以有效促进口腔黏膜修复，为临床溃疡管理提供了有前景的策略。
1. 引言
口腔阿弗他溃疡是一种高度普遍的黏膜疾病，影响全球约20%至25%的人口[1,2]。该病以反复发作和剧烈疼痛为特征，严重影响咀嚼功能和整体生活质量[3]。其发病机制复杂，涉及免疫失调、微生物失衡和营养缺乏。作为主要的生物屏障，口腔黏膜在受损后会引发渗出和微生物侵袭。生理愈合需要精确调控炎症、增殖和重塑阶段[4]。口腔独特的微环境决定了其治疗策略需要不同于皮肤伤口管理的特殊性，因为口腔中持续存在水分和动态的生理活动[5]。
用于治疗阿弗他溃疡的传统药物和漱口水通常只发挥单一作用（如抗菌或抗炎），但无法调节组织修复所需的基本再生过程[6],[7],[8]。相比之下，生长因子相比这些传统化学方法具有更好的治疗效果[9,10]。虽然标准治疗主要是反应性和缓解性的，但生长因子可以主动激活内源性再生途径，驱动细胞增殖、迁移和细胞外基质合成。由于缺乏内在的再生信号，传统药物治疗无法具备这种直接启动生物重建的能力。因此，基于生长因子的策略本质上优于传统漱口水，因为它们能够主动协调组织重建而不仅仅是缓解症状。
尽管生物活性疗法具有很大潜力，但使用单一生长因子往往难以达到最佳疗效。这一限制是由于口腔黏膜修复是一个复杂的生物过程，需要多种信号分子的顺序和协同作用。单一信号分子无法复制协调愈合所需复杂的多信号调控网络，通常导致组织成熟不完全或愈合延迟。此外，动态的口腔环境和微生物酶的存在会加速蛋白质的降解[11],[12],[13]。因此，同时释放多种生长因子不仅有益，而且是必要的，以满足愈合过程中多样的生物学需求并确保强烈的再生反应。
十六烷基吡啶氯化物（CPC）被选为抗菌成分，因为它具有明确的临床安全性、广谱抗菌活性，其阳离子性质能够增强与带负电荷的口腔黏膜的静电结合，从而提高局部作用效果[14],[15],[16]。与可能引起牙齿染色的氯己定或易于降解的高成本抗菌肽不同，CPC提供了一种实用且耐受性良好的选择。除了直接的杀菌作用外，CPC还能有效控制局部微生物负荷，从而减少基于蛋白质的治疗药物的蛋白酶降解，确保其在溃疡部位的生物活性。基于这些优势，我们开发了一种多功能复合漱口水（GF-CMW），将多种生长因子与抗菌剂CPC相结合[17],[18],[19]（图1）。我们的策略旨在重建一个协同的修复系统，同时稳定释放微环境。PDGF、TGF-β、IGF、VEGF和bFGF的系统性整合形成了一个互补的功能网络：PDGF驱动成纤维细胞活化[20],[21],[22]，TGF-β调节炎症反应并促进基质合成[23,24]；IGF增强细胞存活[25,26]，VEGF促进血管生成[27,28]，bFGF促进细胞增殖和迁移[29,30]。这种同步释放方式模仿了血小板中生长因子的自然释放过程，通过顺序表达的受体发挥作用，无需分子间氢键或特定的给药顺序，而CPC则提供对炎症降解的保护。
2. 材料与方法
2.1. 化学品和试剂
柠檬酸、木糖醇、薄荷醇、CPC和山梨醇购自Aladdin Biochemical Technology Co. Ltd.（中国上海）。重组人PDGF-BB、TGF-β1、IGF-1、VEGF-165和bFGF（SDS-PAGE纯度>95%，冻干且不含载体）购自GenScript ProBio（美国新泽西州皮斯卡特韦）。各因子的生物活性由制造商使用标准细胞增殖实验进行了预验证。商用漱口水（CHX）购自Jinkouxin（中国江苏），含有1.2 mg/mL葡萄糖酸氯己定。牛血清白蛋白（BSA）购自Biofroxx（德国艾因豪森）。VEGF和bFGF的ELISA试剂盒购自江苏美棉实业有限公司（中国盐城）。钙黄素-AM/PI细胞活力/细胞毒性试剂盒和Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自Beyotime Biotechnology（中国上海）。细胞外基质凝胶购自Corning Life Sciences（中国上海）。抗CD86、抗CD206和山羊抗兔IgG H&L抗体购自Abcam（中国上海）。
2.2. 细胞和动物
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠RAW264.7细胞和人牙龈成纤维细胞（HGFs）购自湘雅中央实验室（中国长沙）。HUVEC细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的F12/Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基中培养；HGFs在添加了10% FBS的DMEM中培养；小鼠RAW264.7细胞在含有10% FBS的高葡萄糖DMEM培养基中培养。所有细胞均在37°C、5% CO2条件下培养。
6至8周大的Sprague-Dawley（SD）大鼠由湖南Slake Jingda实验动物有限公司（中国长沙）提供，并在无特定病原体的环境中饲养。所有实验程序严格遵守《实验动物护理和使用指南》，并获得湘雅第二医院动物伦理委员会的批准（方案编号2026004）。
2.3. GF-CMW的制备
多功能生长因子复合漱口水（GF-CMW）通过两步程序制备：
- **第一步**：制备基础抗菌漱口水（CMW），将0.05% (w/v) CPC、10.0% (w/v) 山梨醇、2.0% (w/v) 木糖醇、0.1% (w/v) 柠檬酸和0.1% (w/v) 薄荷醇溶解在纯水中，用柠檬酸钠调节pH值至5.8至6.0之间。
- **第二步**：在无菌条件下将重组人生长因子混合物加入无菌基础漱口中。最终生长因子浓度为：PDGF 50 ng/mL、TGF-β 5 ng/mL、IGF 100 ng/mL、VEGF 50 ng/mL和bFGF 10 ng/mL。为确保这些蛋白质在阳离子表面活性剂基质中的结构完整性和稳定性，加入0.1% (w/v) BSA作为分子保护剂和稳定剂。制备好的GF-CMW储存在4°C避光处待用。
2.4. GF-CMW的特性分析
通过精确pH计在25°C下测定三次pH值以评估其物理化学性质；用电导仪测量电导率（单位：μS/cm）并进行记录；用浊度计在NTU单位下测定浊度；使用旋转粘度计在25°C下测定粘度（结果为三次测量的平均值）。长期物理化学稳定性在4°C下监测；在0天、10天、15天、20天、25天和30天记录外观和pH值。
2.5. 黏附性能评估
使用猪皮肤作为黏膜模型评估GF-CMW的黏附性能。测试了四组样品：对照组（生理盐水）、CMW、CHX和GF-CMW。向每种配方中加入0.1% (w/v) 甲基蓝溶液作为示踪剂。每种配方在猪皮肤表面作用5–10分钟后，用人工唾液冲洗1小时，通过ImageJ半定量残留的蓝色强度。
2.6. 生长因子稳定性评估
为了评估长期稳定性，将GF（仅含生长因子）、GF-CMW和CMW单独储存在4°C。通过ELISA测定VEGF和bFGF在0天、2天、4天、6天和8天的浓度。为了评估短期抗蛋白酶能力，将GF和GF-CMW与0.1%胰蛋白酶在37°C下孵育。在0分钟、5分钟、15分钟、30分钟和60分钟时，样品分别用冰冻缓冲液稀释100倍，然后进行ELISA检测剩余的VEGF和bFGF。
2.7. 体外和体内生物相容性测试
通过一系列体外和体内实验评估GF-CMW的生物相容性：
- **细胞相容性**：首先使用钙黄素AM和碘化丙啶（PI）染色法检测细胞相容性。将HUVECs用无菌过滤后的漱口水处理，通过荧光显微镜观察细胞形态。
- **代谢活性和细胞毒性**：进行CCK 8实验。将HUVECs和HGFs以每孔4000个细胞的密度接种在96孔板上，暴露于相应配方24小时后，测量450nm处的吸光度以计算细胞活力（与对照组相比）。
- **血液相容性**：通过红细胞溶血实验评估。简单来说，将10 mL抗凝大鼠血液用玻璃棒轻轻搅拌脱纤维，离心（2500 rpm）5分钟分离红细胞（RBCs），用PBS多次洗涤后纯化。将所得RBC沉淀重悬在PBS中，并与蒸馏水或实验漱口水组在37°C下孵育5小时。孵育后，将实验结果拍照记录在1.5 mL微离心管中。
- **体内安全性**：使用大鼠模型评估配方的安全性，给药6天后采集主要器官进行H&E染色组织学检查。
2.8. 短期局部刺激试验
健康大鼠每天两次接受五种配方（对照组、GF、CHX、GF-CMW、CMW）的局部涂抹，持续5天。收集口腔黏膜进行H&E染色和IL-1β免疫组化分析。
- **长期安全性**：另一组健康大鼠每天接受相同五种配方的局部涂抹，持续21天，每周记录体重。采集主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏）和口腔黏膜组织进行H&E染色，并通过免疫组化检测黏膜IL-1β表达。
2.9. 划痕伤口愈合试验
将HUVEC培养至96孔板70%汇合度，用无菌吸管 Tip制造线性划痕，然后用相应漱口水处理细胞。通过显微镜监测24小时内的细胞迁移情况以量化伤口闭合速率。
2.10. 管腔形成试验
将细胞外基质凝胶与DMEM混合，在37°C下聚合1小时。制备细胞悬浮液（浓度为每毫升100,000个细胞）并加入凝胶中。孵育6小时后，使用ImageJ软件定量分析管腔形成情况。
2.11. 体外抗炎潜力评估
将RAW264.7细胞接种在24孔板中，用LPS（1 μg/mL）诱导M1型极化，然后用漱口水提取物处理24小时。细胞固定、通透化、用BSA封闭，随后在4°C下用抗CD86（1:400）和抗CD206（1:300）抗体处理过夜。洗涤后加入荧光二抗，用DAPI染色细胞核，并通过荧光显微镜成像。
2.12. 体外和体内抗菌测试
使用实验室保存的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）菌株进行体外抗菌测试。每种微生物都被接种到LB肉汤中，并在37°C下过夜培养。然后将培养物稀释至1×10^6 CFU/mL，并与漱口水配方混合。测试了五个组，包括对照组、MW（不含CPC的漱口水基料）、GF、CMW和GF-CMW。在37°C下共同培养24小时后，以200 rpm搅拌，将混合物接种到琼脂板上进行菌落计数。为了进行扫描电子显微镜观察，用2.5%的戊二醛固定处理过的微生物，通过分级乙醇脱水，并用金沉积。通过随机选择的每个组至少计数200个细胞来定量分析形态损伤。表面破坏、收缩或溶解的细胞被计为受损细胞。
在体内，对于大鼠口腔溃疡模型，通过用200 μL的无菌PBS轻轻冲洗口腔来收集漱口水。测试了五个组，包括对照组、CMW、GF、CHX和GF-CMW。将系列稀释液接种到LB琼脂板上，在37°C下培养24小时，然后计数菌落形成单位。
2.12. 大鼠口腔溃疡模型的建立和治疗
所有动物实验均得到了中南大学湘雅第二医院动物伦理委员会的批准（批准编号：20260042）。雄性SD大鼠（300–350克）使用异氟醚麻醉。通过在下唇黏膜上局部应用50%的冰醋酸来诱导一个5毫米直径的口腔溃疡。48小时后，大鼠被随机分配到各治疗组（每组n=6）。另一组大鼠被分为空白对照组、五个单生长因子漱口水组（PDGF、TGF-β、IGF、VEGF或bFGF在CMW基料中），以及GF-CMW组。每个溃疡每天接受两次50 μL的指定治疗，持续5天，并每天拍摄愈合情况。
另一组大鼠被分为对照组、CMW、GF、GF-CMW和CHX（1.2 mg/mL葡萄糖酸氯己定）组。每天两次施加治疗（每个溃疡50 μL），持续5天，并记录溃疡愈合情况。
2.13. 西部印迹分析
收集细胞或组织，并在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。使用商业试剂盒（Beyotime，中国）提取核蛋白和细胞质蛋白。按照标准程序进行西部印迹分析。使用的初级抗体包括抗-p-NF-κB、抗-NF-κB、抗-CD31、抗-COL1A1和抗-GAPDH（均来自Abcam）。与HRP标记的二级抗体孵育后，使用增强型化学发光可视化蛋白质条带，并用ImageJ软件定量。GAPDH用作加载对照。
2.14. 免疫组化分析
对安乐死的大鼠进行组织采集，切除口腔黏膜标本并进行固定，以进行全面的组织学评估。使用H&E和Masson三色染色定量上皮再生和胶原沉积。通过使用ImageJ软件计算五个随机选择的高倍视野中的蓝色阳性区域比例来确定胶原沉积水平。通过免疫荧光检测CD31和α-SMA来评估血管生成，其中血管密度定义为基于五个随机视野的每个视野中的平均微血管数量。通过免疫组化分析测量IL-α和IL-6等促炎细胞因子的表达量，并用ImageJ软件测量积分光密度。此外，通过免疫荧光染色CD86和CD206来表征巨噬细胞的极化情况，结果表示为每个高倍视野中的阳性细胞数量。同时通过H&E染色评估主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的系统毒性。
2.15. 统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。所有定量数据均以平均值±标准差表示。对于纵向溃疡愈合率，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后进行Bonferroni事后检验，以评估每个时间点组间的差异。对于单时间点的组织和免疫荧光数据，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验，进行成对比较。显著性水平定义为p < 0.05，其中星号表示∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001。
3. 结果与讨论
3.1. GF-CMW的制备和表征
3.1.1. 配方设计和优化
通过划痕试验（图S1–S2）确定了各个生长因子的理想浓度。随后的评估显示，综合多生长因子配方（GF）在HUVECs中诱导出的迁移反应显著强于任何单一成分（图S3）。这一结果证实了协同作用，PDGF、TGF-β、IGF、VEGF和bFGF的联合作用共同增强了内皮修复能力，超出了单个组分的效应。
抗菌策略的核心是加入0.05%（w/v）的CPC。这一浓度在保持对口腔病原体的高效杀菌效果的同时，具有良好的黏膜安全性，这一点得到了临床先例的支持[[31]、[32]、[33]]。为了维持这些生物活性蛋白在含CPC基质中的结构完整性，加入了0.1%（w/v）的BSA作为牺牲稳定剂和分子屏障。标准辅料以常规浓度加入，以确保稳定性、耐受性和患者的依从性。山梨糖醇和木糖醇不仅用作非致龋甜味剂，还用作重要的保湿剂和蛋白质稳定剂。柠檬酸用于建立精确的pH缓冲液，而薄荷醇则用于改善感官特性并促进黏膜渗透[34,35]。
3.1.2. 物理化学性质和黏附性
随后对GF-CMW进行了物理化学表征，以验证其质量和治疗应用的适用性。结果显示GF-CMW呈清澈透明溶液，没有可检测的沉淀或浑浊（图2a），证实所有成分都已完全溶解和分散。电位测量显示配方的pH值精确调节在5.8至6.2之间（图2b），这既保持了生长因子的生物活性，又防止了黏膜刺激。电导率测试确认了离子成分的有效溶解（图2c）。此外，运动粘度测量显示GF-CMW的粘度与水相似，仅相比对照组略有增加（图2g和h）。尽管粘度较低，但亚甲蓝试验证实活性成分能够很好地附着在黏膜表面（图2i和j）。这是通过阳离子CPC与带负电荷的口腔黏膜之间的静电吸引以及山梨糖醇的润湿效应实现的。因此，活性成分局部留在口腔表面，而不会使漱口液感觉浓稠或不适。
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图2. GF-CMW的表征。(a) GF-CMW的外观。(b) pH值测量的照片。(c) 电导率测量的照片。(d) 不同组的浑浊度值。(e) pH值。(f) 电导率值。(g) 运动粘度测试的代表图像。(h) GF-CMW的运动粘度值。(i) 猪黏膜在0小时和人工唾液冲洗1小时后的亚甲蓝染色。(j) 1小时后亚甲蓝保留率的条形图。显著性水平表示如下：∗P < 0.05, ∗∗P < 0.01, ∗∗∗P < 0.0001。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网页版本。）
3.1.3. 长期稳定性和储存建议
为了评估GF-CMW的物理化学稳定性和储存潜力，我们在4°C下监测了该配方30天的变化。在整个期间，溶液保持清澈，pH值稳定在目标范围内（图3a）。定量ELISA分析集中在bFGF和VEGF上，作为五因子复合物的代表指标。这两种蛋白质被优先考虑，因为bFGF被认为是最不耐热和最敏感的成分，而VEGF是我们之前实验中验证的血管生成反应的核心驱动因素。通过确认这些高敏素质因子的稳定性，可以合理推断出混合物中更稳定成分的结构完整性。结果确认bFGF和VEGF在储存过程中保持了高结构完整性。8天后，GF-CMW中的bFGF保留率为60%，VEGF为64%（图3b-c）。bFGF和VEGF在CPC存在下的成功保存归因于BSA和表面活性剂之间的相互作用。如先前研究所示，BSA通过自发的疏水性和静电相互作用与CPC结合[34,36,37]。在这种配方中，BSA作为分子屏障，捕获CPC分子，防止表面活性剂与生长因子的疏水核心相互作用。这种竞争性结合确保了生长因子在储存期间不会展开或变性。
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图3. GF-CMW的稳定性评估。(a) 在4°C下第0天、10天、15天、20天、25天和30天测量的GF-CMW的pH值。(b) 在4°C储存8天期间GF-CMW和GF组中的VEGF的ELISA值。(c) 在4°C储存8天期间GF-CMW和GF组中的bFGF的ELISA值。(d) 在37°C下与0.1%胰蛋白酶孵育0分钟、5分钟、15分钟和60分钟后的VEGF的ELISA值。(e) 在37°C下与0.1%胰蛋白酶孵育0分钟、5分钟、15分钟和60分钟后的bFGF的ELISA值。显著性水平表示如下：ns = 无显著差异。
为了模拟临床环境，我们评估了bFGF和VEGF对37°C下0.1%胰蛋白酶的抵抗力。ELISA结果显示，该配方对酶切具有显著的保护作用（图3d和e）。特别是在5分钟时，代表典型的冲洗时间，两种生长因子的保留率均保持在约90%。即使在15分钟时，保留率仍高于70%。这种抵抗力是由BSA的牺牲作用提供的，BSA作为蛋白酶的竞争性底物，吸收了最初的酶攻击，从而阻止了生长因子的快速降解。这些发现表明，在口腔给药期间，GF-CMW能够保持足够的生物活性以促进组织愈合。
这些表征数据共同证实，GF-CMW具有稳定且均匀的物理化学性质，为后续的体外和体内生物学评估提供了可靠的基础。鉴于重组人生长因子 inherent 的热力学不稳定性和在室温下容易迅速变性的特性，我们的定量评估集中在4°C作为最可行的临床储存条件。根据观察到的生长因子保留情况，我们建议将GF-CMW储存在4°C的密封、避光容器中，并在制备后8天内使用，以保持其足够的生物活性。
3.2. 体外和体内生物相容性
生物相容性是治疗漱口水配方的关键前提。因此，使用体外和体内模型严格评估了GF-CMW的安全性。对HUVECs进行的活死荧光染色显示，所有实验组的细胞形态和生长模式均正常，与未经处理的对照组没有明显差异（图4a）。定量CCK-8测定显示GF-CMW对HUVECs没有细胞毒性，细胞活力与对照组相当，并显著促进了HGFs的增殖，表明其对口腔纤维细胞具有选择性的促增殖效应（图4b和c）[35,38]。这些数据共同证实了GF-CMW系统的优越生物相容性。溶血试验进一步表明，所有漱口水组均保持了高血液相容性。通过口腔溃疡模型在给药后5天评估了GF-CMW的体内安全性。通过对主要器官进行HE染色组织学检查，未发现接受各种漱口水成分处理的大鼠有病理异常，这进一步验证了GF-CMW的优异全身生物相容性（图S6）。
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图4. GF-CMW的生物相容性研究。(a) HUVECs的荧光图像，显示Calcein-AM（绿色）和PI（红色）染色。(b) HUVECs的CCK-8测定结果。(c) HGFs的CCK-8测定结果。(d) HUVEC活细胞的定量统计。刻度尺：200 μm。显著性水平表示如下：ns = 无显著差异，∗P < 0.05。（关于此图例中颜色的解释，请参阅文章的网页版本。）
为了进一步评估局部刺激和长期安全性，进行了额外的实验。短期刺激测试显示，五个组中均没有上皮损伤、异常角化或IL-1β升高，所有组的IL-1β表达水平相似（图S7）。在21天的研究中，所有组的体重稳步增加，组间没有显著差异（图S8）。主要器官和口腔黏膜的H&E染色未发现病理异常，IL-1β表达在所有组中保持相似，表明没有显著的局部刺激或系统毒性。这些结果证实了GF-CMW及其成分在短期和长期应用中的安全性。3.3. 体外促进细胞迁移和血管生成细胞迁移是黏膜伤口愈合协调的基础[39]。通过使用HUVECs进行的体外划痕实验评估了这一功能能力。虽然单独使用CMW对细胞运动性几乎没有影响，但加入生长因子后显著增强了迁移反应。与CMW和未处理对照组相比，GF溶液和GF-CMW复合制剂均显著促进了HUVEC的迁移。值得注意的是，GF组和GF-CMW组之间没有观察到统计学上的显著差异（图5a）。这些结果表明，促迁移活性主要由生长因子成分驱动，且其内在生物活性在漱口水递送系统中得到了有效保持。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图5. 体外评估迁移和血管生成能力。(a) 不同处理后HUVEC细胞迁移实验的代表性图像。(b) HUVECs中CD31表达的Western blot图像。(c) 管道形成能力。(d) HGFs中Col1a1表达的Western blot图像。(e) HUVEC细胞迁移的定量分析。(f) 结节数量的分析。(g) CD31/GAPDH比例的定量分析。(h) Col1a1/GAPDH比例的定量分析。刻度尺：100μm。显著性水平如下：ns=无显著差异，***P < 0.001。局部血管生成是恢复口腔黏膜完整性的另一个关键决定因素[40]。制剂中的生物活性生长因子具有调节组织再生和促进血管重建的能力。为了研究GF-CMW的血管生成潜力，进行了HUVEC管道形成实验。与CMW对照组相比，GF和GF-CMW均表现出显著的更高血管生成活性（图5c）。此外，GF组和GF-CMW组在促进管道形成方面没有显著差异，这验证了复合材料中生物活性因子的功能稳定性。因此，这些发现证实GF-CMW具有通过协调增强细胞迁移和血管生成来促进伤口愈合的能力。为了进一步探讨这些效果的分子基础，我们进行了Western blot分析。GF-CMW增加了HUVECs中的CD31表达（图5b）并上调了HGFs中的COL1A1表达（图5d），提供了该制剂促进内皮分化和胶原蛋白合成的直接证据。3.4. 体外和体内的抗菌能力口腔黏膜溃疡容易受到继发性微生物感染的影响，这会严重影响组织修复并延长炎症期[41]。系统评估了GF-CMW及其CPC成分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的体外抗菌效果。定量分析显示，与CMW共培养和GF-CMW显著抑制了这些病原体的增殖。相比之下，不含CPC的制剂几乎没有抑制活性，这证实了CPC是抗菌作用的主要成分（图6a）。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图6. 研究GF-CMW的抗菌能力。(a) 不同处理组后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌落形成的数码照片。(b) 不同处理后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的SEM图像。(c) 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌落形成的定量分析。(d) 基于SEM图像的受损微生物百分比的定量分析。刻度尺：(a) 2cm，(b) 1μm。显著性水平如下：***P < 0.001。使用扫描电子显微镜观察了各种处理后微生物的结构完整性。与未处理对照组相比，暴露于CMW和GF-CMW的病原体显示出广泛的结构异常和形态损伤（图6b）。SEM图像的定量分析（图6d）进一步证实，CMW和GF-CMW组中受损微生物的比例显著增加。在体内，从GF-CMW处理的大鼠中收集的漱口水含有明显较少的细菌菌落（图S4）。这些观察结果证实了GF-CMW平台对多种机会性病原体具有强大的杀菌和杀真菌作用。因此，将CPC整合到多生长因子系统中提供了有效的机制，以减轻微生物干扰并确保有利于黏膜愈合的微环境。值得注意的是，0.05%的CPC已被证明可以选择性地抑制与牙龈炎相关的病原体，同时保持健康口腔微生物群的多样性[42,43]。3.5. 体外抗炎能力在五种添加的生长因子中，TGF-β具有强大的免疫调节特性，并与PDGF、IGF、VEGF和bFGF的修复功能协同作用，以减轻口腔黏膜疾病中的病理表现[[44], [45], [46]]。在不同处理条件下，研究了GF-CMW对LPS刺激的巨噬细胞的调节影响。通过分别用CD86和CD206进行免疫荧光染色来检测M1和M2标志物，以表征巨噬细胞的极化[47]。CD86和CD206的免疫荧光染色显示，TGF、GF和GF-CMW均减少了M1极化并增加了M2极化，与仅LPS对照组相比（图7a和b）。GF-CMW始终表现出最强的效果，并显著优于单独使用TGF，证实了多生长因子组合的协同优势。Western blot分析进一步显示，GF-CMW最有效地降低了p-NF-κB/NF-κB比率（图7e和f），表明NF-κB通路参与了这一过程。这些发现表明，GF-CMW通过调节巨噬细胞向抗炎表型的极化来缓解异常炎症状态，从而减少了促炎细胞的分泌。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图7. 检测GF-CMW的抗炎能力。(a) DAPI（蓝色）和CD86（绿色）免疫荧光染色的巨噬细胞荧光显微图。刻度尺：100μm。(b) DAPI（蓝色）和CD206（红色）免疫荧光染色的巨噬细胞荧光显微图。(c) 表达CD86的M1型巨噬细胞的定量分析。(d) 表达CD206的M2型巨噬细胞的定量分析。(e) 巨噬细胞中p-NF-κB和NF-κB的Western blot图像。(f) p-NF-κB/NF-κB比率的定量分析。刻度尺：100μm。显著性水平如下：ns=无显著差异，***P < 0.01，***P < 0.001。（关于此图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）3.6. 评估GF-CMW在大鼠口腔溃疡愈合中的作用使用大鼠口腔溃疡模型评估了GF-CMW的临床转化潜力。在大鼠模型中，GF-CMW以每次溃疡50μL的剂量每天两次局部施用。根据体表面积转换（大鼠300g对比人类60kg），这相当于每人每次漱口约5-10mL的估计剂量，属于典型漱口水体积范围（10-20mL）。在另一项比较GF-CMW与仅含单一生长因子（PDGF、TGF-β、IGF、VEGF或bFGF的CMW基础）的漱口水的实验中，所有单一因子组都加速了溃疡愈合，但GF-CMW始终表现出最小的溃疡面积和最快的愈合速度（图S5）。这些结果表明，虽然单一生长因子具有有益效果，但需要五种因子的组合才能达到最佳愈合效果，从而证实了多生长因子策略的协同必要性。在主要实验中，大鼠被随机分配到对照组或四个治疗组之一，包括CMW、GF、GF-CMW以及使用市售CHX处理的阳性对照组。结果表明，GF、GF-CMW和CHX均加速了黏膜愈合，且GF和GF-CMW优于CHX。在这些干预措施中，GF-CMW组在第5天表现出最显著的治疗效果，显著优化了黏膜形态（图8a）。这种增强的表现主要归因于GF和CMW的协同作用。它们共同提高了药物保留能力和穿透通常在口腔溃疡上形成的假膜屏障的能力，从而限制了传统漱口水制剂的效力。这些发现表明，GF-CMW在促进溃疡修复方面优于传统干预措施，并支持其作为新的精确医疗策略的潜力。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图8. 大鼠口腔溃疡的体内愈合评估。(a) 治疗第1天至第5天的大鼠口腔溃疡图像。(b) 大鼠口腔溃疡模型中漱口水的施用示意图。(c) 5天内每日相对溃疡面积（%）曲线（平均值±标准差，n = 6）。(d) 从相对溃疡面积计算出的溃疡愈合率（%/天）。刻度尺：5mm。显著性水平如下：ns = 无显著差异，*P < 0.05，***P < 0.01，***P < 0.001。通过HE染色进行的组织学评估进一步证实，GF-CMW促进了强健的上皮再生并改善了结缔组织结构。这种处理有效地减少了炎性细胞渗透，程度超过了对照组或传统制剂（图9a）。为了阐明组织重塑的机制，系统评估了整个溃疡愈合过程中的胶原蛋白沉积和血管生成。Masson三色染色显示，GF和GF-CMW组显著增强了胶原蛋白沉积。GF-CMW组表现出最显著的胶原蛋白富集（图9b）。这一结果突出了该制剂在促进基质重塑方面的特定优势。通过双重免疫荧光染色检测CD31和α-SMA来评估血管生成。对照组显示血管结构稀疏且这些生物标志物的表达极少。相比之下，GF和GF-CMW组均表现出强烈的血管生成活性。GF-CMW组表现出最高的血管标志物表达水平，并成功促进了新血管形成（图9c）。这些观察结果表明，CPC和GF在漱口水系统中协同作用，加速了修复过程，这种协同互动强调了GF-CMW策略的潜力。下载：下载高分辨率图像（3MB）下载：下载全尺寸图像图9. GF-CMW治疗后的胶原蛋白沉积和血管生成研究。(a) 第5天口腔溃疡组织的HE染色图像。(b) 使用Masson三色染色的不同MW组处理后的黏膜组织显微图像。(c) 血管内皮细胞标志物CD31（红色）和血管平滑肌细胞标志物α-SMA（绿色）的双重免疫荧光染色荧光显微图。(d) 黏膜厚度的定量分析。(e) 溃疡组织中胶原蛋白沉积的定量分析。(f) 血管密度的定量分析。刻度尺：100μm。显著性水平如下：*P < 0.05，***P < 0.01，***P < 0.001。（关于此图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）3.7. 抑制体内炎症表达通过在第5天量化TNF-α和IL-6的表达来评估不同处理对溃疡愈合期间炎症反应的调节影响[48,49]。这些促炎细胞因子在对照组中高度表达，但在GF和GF-CMW组中显著降低（图10a）。这种减少表明，生物活性因子有效调节了异常的免疫反应并抑制了炎症介质的释放。为了进一步研究局部免疫微环境，使用CD86和CD206作为M1和M2表型的标志物，通过免疫荧光染色来表征巨噬细胞的极化[50]。与对照组相比，GF和GF-CMW组中CD206阳性巨噬细胞的比例显著增加。这种表型转变表明，GF-CMW促进了巨噬细胞向M2状态的极化，从而减轻炎症并将局部微环境从促炎状态转变为促进修复状态（图10b）。这些发现一致表明，GF-CMW具有强大的抗炎和免疫调节功能，为其在促进组织修复中的有效性提供了机制支持。下载：下载高分辨率图像（3MB）下载：下载全尺寸图像图10. 研究溃疡中的炎症因子和巨噬细胞极化。(a) 溃疡组织中的TNF-α和IL-6免疫组化分析。(b) 显示溃疡组织中CD86和CD206免疫荧光的荧光显微镜图像。(c) IL-6免疫组化染色的定量分析。(d) TNF-α免疫组化染色的定量分析。(e) CD206阳性M2型巨噬细胞的定量分析。刻度尺：(a) 100μm，(b) 50μm。显著性水平如下：*P < 0.05，***P < 0.01，***P < 0.001。4. 结论总之，本研究开发了一种多功能GF-CMW平台，集成了协同再生信号传导和抗菌控制。结果表明，该制剂同时促进了细胞迁移、血管生成和胶原蛋白沉积，同时在体内有效恢复了促愈合的免疫环境。与主要针对单一杀菌或止痛效果的传统漱口水不同，GF-CMW提供了一种全面的方法，涵盖了微生物清除和组织再生两个方面。尽管据报道，水凝胶和微针等先进的递送系统能够提高药物在黏膜上的停留时间[51]，但它们通常会面临患者不适、制造复杂或使用后引起刺激等挑战。我们的配方提供了一种更加实用且对患者友好的替代方案，通过简化、非侵入性的冲洗程序实现治疗效果。
GF-CMW的临床可行性还得到了其保护机制的支持。为了应对口腔内的蛋白水解环境，配方中加入了0.1%的BSA作为防护层，确保生长因子在关键的应用窗口期内保持生物活性。目前该液体系统在4°C下可保持8天的物理化学稳定性，未来通过利用脂质体封装技术将生长因子与抗菌成分物理分离，有望显著延长其工业保质期[52,53]。尽管有这些成果，但仍存在一些局限性。本研究使用了标准的大鼠模型，由于缺乏灵长类动物实验，因此还需进一步验证该产品在高等哺乳动物中的系统安全性和有效性。此外，目前的评估主要针对急性创伤性溃疡，而GF-CMW在治疗复发性口腔溃疡（涉及更复杂的系统性免疫失调）方面的效果仍有待研究。
未来的研究应重点利用脂质体封装或纳米粒子载体等技术来优化蛋白质的长期稳定性。同时，应采用基于荧光的方法定量追踪该配方在生理唾液冲洗条件下在溃疡部位的实时停留情况。解决这些不足将有助于进一步完善GF-CMW，使其成为一种更可靠且具有临床转化潜力的先进口腔护理方案。
**作者贡献声明：**
彭育飞：撰写——初稿
周 Fanshao：撰写——审阅与编辑
何黎明：撰写——审阅与编辑
李双江：撰写——审阅与编辑
杨玉洁：撰写——审阅与编辑
江桐：撰写——初稿
徐树森：撰写——审阅与编辑
谢晓燕：撰写——审阅与编辑
