克里斯塔普斯·鲁贝尼斯（Kristaps Rubenis）|辛赫（Xin He）|厄兹努尔·德米尔（Öznur Demir）|傅兆月（Zhaoyue Fu）|奥拉夫·埃斯特因·西古尔约恩松（Ólafur Eysteinn Sigurjónsson）|托本·希尔德布兰德（Torben Hildebrand）|利伯特·帕雷拉斯·诺盖拉（Liebert Parreiras Nogueira）|莉亚·皮亚亚（Lya Piaia）|雅尼斯·洛克斯（Janis Locs）|达格尼娅·洛克（Dagnija Loca）|陈丽华（Lihua Chen）|哈瓦德·约斯泰因·豪根（Håvard Jostein Haugen）|马倩莉（Qianli Ma）
拉脱维亚里加技术大学自然科学与技术学院生物材料与生物工程研究所，Paula Valdena街3 k-1号，LV-1048
**摘要**
对于临界大小的骨缺损，需要能够支持早期骨形成和可预测的缺损桥接的移植材料。在本研究中，我们评估了源自蛋壳的非晶磷酸钙（ACP）颗粒在大鼠颅骨缺损模型中的效果，并将其与商业羟基磷灰石（HAp）制备的ACP以及单独使用的交联透明质酸（HA）凝胶进行了比较。蛋壳来源和HAp来源的ACP均通过相同的溶解-沉淀方法合成，其组成、非晶相稳定性及体外生物活性已通过先前研究进行了详细表征。大鼠的双侧5毫米颅骨缺损分别填充了HA凝胶（INT/HA）、HA + HAp来源的ACP（对照组ACP）或HA + 蛋壳来源的ACP（蛋壳ACP）。移植材料在植入前使用双注射器系统混合。通过微计算机断层扫描（micro-computed tomography）和组织学分析评估了2周和4周时的骨再生情况。与单独使用HA相比，两种ACP组均增加了骨体积分数并减少了骨小梁分离程度，尤其是在缺损中心区域。蛋壳ACP促进了更一致的缺损桥接，形成了连续的层状骨样结构，并在骨-移植界面处形成了更成熟的胶原和矿化组织。尽管本研究是在非承重的小动物模型中进行的，但这些结果表明，蛋壳ACP与HA结合使用能够支持早期骨再生，并表现出比单独使用HA或HAp来源的ACP更高的骨形成活性，值得进一步研究作为骨移植材料的选择。
**1. 引言**
解决临界大小的骨缺损问题仍是再生医学、骨科和牙科手术中的重大挑战。虽然传统骨移植材料被广泛使用，但它们常常受到供体部位并发症、供应有限、高昂的生物和经济成本、环境污染以及潜在伦理问题的限制[1]、[2]、[3]、[4]。这些挑战推动了合成和仿生移植材料的发展，这些材料可以可靠地支持骨再生，同时避免传统移植材料的缺点。源自蛋壳的非晶磷酸钙（ACP）就是这样一种材料，它将一种丰富的食品副产品转化为高价值的磷酸钙材料，用于骨修复应用[5]、[6]。
蛋壳作为食品废弃物大量产生，主要由CaCO3组成，含有少量的Ca3(PO4)2和MgCO3，以及微量的镁（Mg）、锶（Sr）和钠（Na），使其成为制备含微量元素磷酸钙产品的理想钙源[6]、[7]、[8]。在我们之前的研究中，我们通过碱-酸法将蛋壳转化为ACP，得到了具有高比表面积的纳米结构颗粒，并保持了与天然骨相当的镁和锶含量[5]、[7]、[8]。与商业羟基磷灰石（HAp）制备的ACP相比，蛋壳来源的ACP在水介质中的重结晶动力学较慢，非晶相稳定性更长[5]、[9]、[10]。特别是在模拟生理环境中，HAp来源的ACP在数小时内会转化为结晶磷酸钙，而蛋壳来源的ACP则能在较长时间内保持其非晶特性[5]。这些物理化学差异导致了不同的离子释放模式，并在3D成骨细胞球体模型中表现出更强的骨形成反应，其中蛋壳ACP比HAp来源的ACP更有效地促进了细胞外基质的矿化和骨形成标志物的表达[5]。
非晶磷酸钙被广泛认为是骨矿化过程中的一个过渡前体相，并已被纳入各种合成骨移植材料和复合材料中[9]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。在许多情况下，通过添加柠檬酸、聚合物或特定离子来稳定ACP，以控制其向磷灰石的转化并增强骨形成反应[9]。Müller等人报告称，非晶磷酸钙/多磷酸盐复合材料在体内表现出比结晶材料更强的形态发生和骨形成活性[17]。同时，多个研究团队探索了蛋壳来源的羟基磷灰石及相关生物陶瓷系统作为合成HAp的经济高效、生物活性替代品[8]。尽管对基于ACP的移植材料和蛋壳来源的磷酸钙的兴趣日益增加，但在标准化的临界大小缺损模型中直接比较蛋壳来源ACP与类似HAp来源ACP的体内研究仍然较少。我们之前的工作在体外水平上填补了这一空白，证明了蛋壳来源ACP与HAp来源ACP的生物安全性和骨形成潜力[5]。最近，多孔蛋壳来源ACP支架在兔子的临界大小股骨和颅骨缺损中进行了评估，结果显示其与适当的基于水凝胶的载体结合使用时能够显著促进早期骨形成和骨-支架融合[18]。然而，以颗粒形式存在的蛋壳ACP在临床相关载体中的行为仍需要系统的体内研究。与预成型支架相比，颗粒ACP与水凝胶载体的结合代表了一种临床相关且微创的输送方法，尤其适用于不规则缺损，因为这种组合具有更好的注射性和缺损适应性。虽然蛋壳来源的结晶磷灰石已有充分文献记录，但其颗粒形式的非晶对应物的系统体内证据仍然不足。本研究通过评估颗粒状蛋壳ACP/HA复合材料，提供了与成分更简单的HAp来源ACP的直接“对比”，旨在部分分离非晶相与生物源微量元素的影响，尽管在当前系统中这两种因素仍然是相互关联的。
**2. 材料与方法**
**2.1. ACP颗粒的合成与灭菌**
“对照”ACP是使用先前建立的溶解-沉淀合成方法制备的[10]（图1）。首先，将10克HAp粉末（#04238；Sigma-Aldrich，美国）加入600毫升去离子水（dH2O）中，同时以200 rpm的速度搅拌。10分钟后，加入3 M HCl溶液（64.46毫升）。再过10分钟，将搅拌速度提高到600 rpm，并迅速加入91.5毫升2 M NaOH水溶液，使pH值迅速升高至约11.0，从而形成白色沉淀。5分钟后，过滤沉淀物并用去离子水（dH2O）洗涤，然后浸入液氮中进行冻干。蛋壳ACP颗粒的合成方法已在我们的先前研究中报道[5]。简而言之，蛋壳（“Balticovo”；Lecava，拉脱维亚）在900°C下热处理1小时以去除有机成分，转化为CaO3。接着，向600毫升去离子水（dH2O）中加入5.55克CaO，并以200 rpm的速度持续搅拌，形成白色悬浮液。10分钟后，加入12.47毫升4.76 M H3PO4溶液。从加入HCl溶液开始的后续合成步骤与“对照”ACP的合成步骤相同。为避免不必要的生物和化学污染，ACP颗粒进一步通过30 kGy的E射线照射进行灭菌（由西安杨凌核辐射技术有限公司执行）。
**2.2. 移植材料的制备**
INT/HA凝胶的制备方法如前所述[19]。简而言之，将药用级高分子量透明质酸（HA，MW = 1.5 MDa，IV = 22.2 m3/kg；SyrHA，瑞士日内瓦）以10 w/v%的浓度溶解在0.3 M NaOH溶液中，并加入1.6 v/v%的1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE；Merck KGaA，德国），然后搅拌。溶液在40°C下封闭容器中孵育4小时。之后，将凝胶转移到纤维素膜（MWC = 14 kDa）上，并在蒸馏水（dH2O）中透析18小时。通过130 μm孔径的筛网将凝胶挤出成颗粒状，最终浓度达到20 mg/mL。所有制造步骤均在符合ISO 13485:2016标准的良好实验室规范（GLP）条件下进行。样品装入注射器中，并在121°C下高压灭菌15分钟，然后进行生物测试。对于体内实验，INT/HA凝胶单独使用或与对照组或蛋壳ACP颗粒混合使用，即在应用前向1毫升INT/HA凝胶中加入40毫克ACP颗粒（2毫克/50微升）（图1）。
**2.3. 大鼠模型中的颅骨临界缺损制备**
从第四军医大学实验动物中心获得了43只8周大的雄性Sprague–Dawley大鼠（无特定病原体等级），体重在180至220克之间。所有大鼠均接受异氟醚全身麻醉和利多卡因局部麻醉（Sigma–Aldrich）。手术步骤详见研究流程图（图1）。为了暴露颅顶板，通过皮肤和肌肉做了一个2.5厘米的中矢状切口，然后分离骨膜，同时避免损伤眼眶区和硬脑膜。使用W&H Planter（W&H Dentalwerk，奥地利）和trephine钻头（Ø5.0毫米；Neodent，Straumann集团，巴西）在冷（4°C）生理盐水中制造了两个临界大小的骨缺损（Ø5.0毫米）。移除缺损区域的全部骨组织，并将移植材料放入缺损处（INT/HA组：每缺损50微升；ACP组：每缺损2毫克）。Bio-Gide（Geistlich，瑞士）引导骨再生（GBR）膜被切割成1.0×1.0厘米的形状，放置在带有移植材料的缺损处。伤口分层闭合后，停止异氟醚吸入并恢复大鼠的生命体征。在伤口上涂抹赛替吡啶软膏（1.0毫克/克；Karo Pharma，挪威），以防止术后感染，持续3天（每天两次）。随后3天内，大鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（10毫克/100克体重；Sigma–Aldrich）进行镇痛。2周和4周后，所有大鼠在CO2室中全身麻醉状态下被处死，并采集颅骨样本，置于4%福尔马林（PFA）溶液中固定24小时。
**2.4. 微CT分析**
所有固定样本均使用SkyScan 1172（Bruker，Kontich，比利时）进行微CT扫描，参数为74 kV、124 µA、0.5毫米Al滤光片、曝光时间680毫秒、角度步长0.43°。扫描结果生成了10.5 µ米的体素大小和约30分钟的扫描时间。使用NRecon软件（版本1.7.4.6）重建图像，随后通过CTAn软件（版本1.23.0.2）对感兴趣区域（ROI）进行骨再生指标分析，包括骨体积与总体积比（BV/TV）、骨表面与骨体积比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）。不同ROI在图4中示出，包括缺损区域。
**2.5. 组织学染色与观察**
微CT分析后，所有样本用双蒸馏水（ddH2O）冲洗三次（每次1小时），然后用不同浓度的乙醇（70%、70%、95%、95%、100%、100%，每次1小时）脱水，随后嵌入甲基丙烯酸甲酯树脂（Technovit 7200 VLC，Exakt，德国）中。使用切割研磨装置（EXAKT 300和EXAKT 400 CS研磨机，Advanced Technologies，德国）将组织块切割并研磨至最终厚度约为40微米。切片经过苏木精和伊红（HE）、Masson Goldner Trichrome（MT）和Von Kossa（VK）染色。所有染色的组织切片在AxioScan Z1（Carl Zeiss，德国）下以10倍放大率扫描，并使用Zen3软件（Carl Zeiss，德国）进行分析。
**2.6. 伦理批准与参与同意**
对于动物体内研究：所有动物实验均在空军医科大学（原名为第四军医大学）动物实验伦理委员会批准的伦理批准（编号KY20194055）下进行和监督。所有实验动物均按照第四军医大学《实验动物护理与使用指南》（2018年）进行照料。参与研究无需获得同意。2.7 统计分析 所有数据均使用Prism 10.4.0软件（GraphPad Software，美国）进行绘图和分析。连续变量的数据以平均值±标准差（SD）表示。组间显著差异通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后对参数数据进行Student-Newman-Keuls事后检验，或对非参数数据进行Kruskal-Wallis检验，再通过Dunn的多重比较检验。当p < 0.05时，认为差异具有统计学意义。图例中也提供了详细的显著性水平。统计比较在每个时间点独立进行，以关注定义的愈合阶段内的治疗特异性效应。虽然双因素ANOVA可以提供关于治疗与时间之间交互作用的额外见解，但由于当前样本量较小，未采用这种方法。未来的研究可能会纳入此类分析。3. 结果 本节中研究的样本分别标记为INT/HA、INT + Control ACP和INT + Eggshell ACP，简称为INT、Control ACP和Eggshell ACP。如图2 A-C所示，重建的MicroCT图像显示INT缺陷内的骨组织极少，而两个ACP组则表现出更强的新骨形成（图2A–C，2周）。在冠状和矢状视图中，INT缺陷中仅含有少量骨组织（图2D和G）。Control ACP增加了骨组织的存在，但未形成连续的层状结构（图2E和H）。相比之下，Eggshell ACP产生了强烈的骨信号，形成了与缺陷边缘相连的连续层（图2F和I）。4周时，各组均显示出部分缺陷填充（图3A）。冠状和矢状切片显示从边缘向内的生长以及桥状结构（图3D和G）。INT未形成连续的层状结构。两个ACP组均显示出比INT更完整的层状骨组织，只有Eggshell ACP在整个缺陷上形成了连续的骨层（图3F和I）。下载：下载高分辨率图像（429KB）下载：下载全尺寸图像图2. 2周时大鼠颅骨关键骨缺陷的MicroCT图像和虚拟切片。(A-C) 大鼠颅骨缺陷中骨再生的重建；(D-F) 骨缺陷冠状面的骨再生和矿化；(G-I) 骨缺陷矢状面的骨再生和矿化。比例尺 = 2.0毫米；红色虚线框：骨缺陷。下载：下载高分辨率图像（406KB）下载：下载全尺寸图像图3. 4周时大鼠颅骨关键骨缺陷的MicroCT图像和虚拟切片。(A-C) 大鼠颅骨缺陷中骨再生的重建；(D-F) 骨缺陷冠状面的骨再生和矿化；(G-I) 骨缺陷矢状面的骨再生和矿化。比例尺 = 2.0毫米；红色虚线框：骨缺陷。为了减少偏差，使用BV/TV、BS/BV和Tb.Th以及Tb.Sp三个感兴趣区域（ROI）来量化骨形成：ROI-1被定义为直径为5.5毫米的圆柱形区域，以检查整体骨再生情况（图4A-E）。分析结果清楚地表明，与INT组相比，Eggshell ACP移植在术后2周促进了更多的骨形成（图4B）。然而，Control ACP在2周和4周时似乎都没有增加骨体积。ACP移植（Control和Eggshell）很少影响BS/BV和Tb.Th的变化（图4C和D），但可以显著降低Tb.Sp（图4E）。ROI-2被定义为直径为4.0毫米的圆柱形区域，以检查缺陷中心的骨形成情况，而不受周围缺陷区域的影响（图4F-J）。由于ROI较小，BV/TV值低于ROI-1（图4B vs. F）。两个ACP组的BV/TV趋势均较高，其中Eggshell ACP在2周时与INT相比有显著差异（图4G）。在这个中心ROI中，两个ACP组在两个时间点都显示出Tb.Sp的显著下降（图4J）。ROI-3呈环形（图4K），旨在明确缺陷边缘的新骨形成情况。BV/TV的趋势与ROI-1和ROI-2一致（图4B、G和L）。4周时，各组之间的Tb.Sp趋于一致，表明缺陷边缘区域的骨小梁间距相当（图4O）。下载：下载高分辨率图像（686KB）下载：下载全尺寸图像图4. 术后2周和4周不同感兴趣区域（ROI）的骨再生MicroCT体积分析。(A) 直径为5.5毫米的圆柱形区域内ROI选择的示意图；(F) 直径为4.0毫米的圆柱形区域内的ROI；(F) 直径相差0.75毫米的环形区域内的ROI；(B, G, L) 骨体积/总体积比，(C, H, M) 骨表面/骨体积比，(D, I, N) 骨小梁厚度，以及(E, J, O) 不同ROI选择中的骨小梁间距。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。尽管MicroCT提供了关于愈合缺陷的足够空间信息，但仍需要组织学观察来明确与新骨形成相关的结构组织变化。本研究采用了三种不同的染色方法，提供了关于一般组织再生（HE染色）、细胞外基质和类骨形成（MT染色）以及骨矿化（VK染色）的组织学信息。2周时，HE染色显示INT的再生情况较差，边缘之间有一层薄而不连续的胶原层（图5A和C）。Control ACP为骨生长提供了空间，但在胶原支架内显示出炎症浸润（图5D）。与INT和Control ACP相比，Eggshell ACP显示出多孔的、新形成的层状骨样组织，其中散布着残留的磷酸钙颗粒（图5E）。MT和VK染色证实INT中的胶原沉积有限且没有矿化骨（分别为绿色和黑色；图5F和I），而两个ACP组增强了胶原沉积和矿化（图5G–H, J–K），其中Eggshell ACP显示出更成熟的结构和活跃的类骨形成。4周时，所有组的组织生成均有所增加。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图5. 术后2周和4周颅骨缺陷中骨再生的代表性组织学染色。术后2周（C, D, E）和4周（L, M, N）的HE染色；术后2周（F, G, H）和4周（O, P, Q）的Masson Trichrome染色；术后2周（I, J, K）和4周（R, S, T）的Von Kossa染色。比例尺 = 1.0毫米。Control ACP和Eggshell ACP显示出比INT更完整的愈合（图5M, L和N）。Control ACP中的炎症减轻，两个ACP组促进了胶原和矿化骨的形成。尽管INT的骨化程度较低，但其骨厚度和矿化程度在4周时相比2周有所改善（图5L vs. C, O vs. F, R vs. I）。Eggshell ACP缺陷含有最高的骨体积，这与MicroCT指标一致（图4）。4. 讨论 在我们之前的研究中，我们合成了HAp衍生的（Control）和蛋壳衍生的ACP颗粒，并在3D成骨细胞球体模型中评估了它们的生物性能[5]。体外研究表明，这两种配方都具有生物相容性和成骨性，其中蛋壳衍生的ACP表现出更强的细胞外基质矿化和成骨标志物表达。详细的物理化学分析显示，蛋壳衍生的ACP含有比HAp衍生的ACP更高的Mg和Sr含量，并且这些微量元素在合成过程中大部分得以保留[5]，[7]，[8]。此外，我们发现HAp衍生的ACP在水溶液中8小时内迅速重结晶为结晶磷酸钙，而蛋壳衍生的ACP在16小时内仍主要保持无定形状态[5]。这种延长的无定形窗口与持续的Ca/P离子释放有关，这被认为是体外观察到的更强成骨反应的基础。当前的体内研究旨在直接扩展这些发现，使用相同的合成路线和材料批次，测试两种ACP配方之间的组成和动力学差异是否会在关键大小的缺陷中转化为可测量的骨再生差异。在本研究中，选择HA凝胶作为对照处理，而不是假手术，这是基于颅骨的强大血管性。颅骨骨组织从外颈动脉和内上颌动脉的分支获得血液供应[20]，理论上支持缺陷创建后的快速血液填充。HA特异性地与血液中的纤维蛋白结合，并能影响血凝块的稳定性[21]。在骨再生过程中，HA与CD44的结合会触发信号传导（例如FAK/AKT），从而驱动间充质干细胞的迁移、粘附、增殖和成骨细胞分化[22]，[23]，[24]。HA–CD44轴进一步支持新骨的形成和矿化组织的修复。值得注意的是，分子量对HA的免疫生物学有重要调节作用：高分子量的HA通过CD44和次要受体（例如TLR2、TLR4、LAYN、ICAM-1）介导抗炎信号传导，而HA寡糖则可能引发促炎反应[25]。因此，稳定HA以减少降解对于维持适当的免疫微环境至关重要。通过与BDDE交联和网状挤出，HA凝胶颗粒具有更高的硬度和对快速酶降解的抵抗力，优于线性HA[19]，从而为骨愈合提供了空间支持和有利的微环境。此外，颗粒状HA凝胶使得与颗粒状移植物的均匀混合和空间加载成为可能。当与结晶磷酸钙（CCP，例如羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐等）移植物结合时，HA凝胶可以在体外和体内提高CCP移植物的凝聚力、机械强度和成骨诱导性[26]，[27]。相比之下，HA-ACP组合受到的关注较少，主要是因为ACP的无定形状态在水环境中不稳定。为了在植入前保持无定形相，我们在手术前立即使用类似BoostTM牙齿美白系统（Opalescence，美国）中的组装注射系统将Control和Eggshell ACP颗粒与HA凝胶混合。鉴于有报道称ACP在成骨诱导性和血管化方面优于CCP[17]，我们的主要目的是通过相同的溶解-沉淀路线制造HAp衍生的（Control ACP）和蛋壳衍生的ACP颗粒进行对照比较[5]，[10]。这种设计使我们能够具体评估在其他条件相当的情况下，蛋壳前体（包括其微量元素含量和重结晶行为）的影响。我们的发现推进了当前的研究水平，证明了蛋壳前体的生物“记忆”，特别是镁和锶稳定的无定形相，提供了比合成ACP更显著的成骨优势。这超出了对ACP生物活性的普遍理解[9]，[17]，强调了废物回收如何产生具有内在优越动力学的材料，用于关键大小的缺陷桥接。排除结晶HAp组是一个故意的战略选择，以保持严格的“相位匹配”比较。引入结晶性作为额外变量会混淆对蛋壳衍生物微量元素所产生生物效应的具体解释。我们认识到，柠檬酸稳定的或故意掺杂离子的ACP配方广泛用于骨再生研究[9]，[17]，但它们代表化学和动力学上不同的系统，因此没有包括在当前的比较中。与理论假设相反，在手术准备后立即观察到的颅骨缺陷内的血液填充很少。这种较差的血液填充可能阻碍了血凝块的形成，减少了纤维蛋白和HA颗粒之间的机械缠结，并影响了早期的空间维持。仅使用HA的对照组在2周和4周时的结果不佳（图2A、D、G和3A、D、G）。组织学显示，仅使用HA的对照组在2周时形成的骨组织非常薄且呈层状（图5A），表明HA凝胶本身不足以提供足够的骨生成空间。即使在4周时，对照组中也只有软组织（而非矿化骨桥）跨越了缺陷边缘（图5B）。相比之下，Control ACP和Eggshell ACP颗粒促进了强大的骨形成。与仅使用HA时的“薄层”模式不同，ACP颗粒促进了胶原沉积和原位生物矿化，在2周时周围形成了活跃的类骨结构（图5G和H）。4周时，Eggshell ACP组显示出矿化的骨小梁桥接了缺陷（图5Q和T）。相比之下，对照组ACP在缺陷边缘附近显示出较少的骨组织以及一个小的未矿化间隙（图5P和S），这与我们之前的体外研究结果一致[5]。一个合理的机制解释是，在Eggshell ACP的合成过程中加入的较高含量的镁（Mg）和锶（Sr）稳定了非晶相并减缓了再结晶过程[28]、[29]、[30]、[31]。在天然骨形成过程中，ACP作为一个过渡相，沉积在胶原纤维间隙中，以促进磷灰石的形成[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。因此，ACP的持续存在以及Ca2+和PO43−的持续释放预计可以增强体外和体内的骨生成[5]、[9]。颗粒大小也可能起到了作用：Eggshell ACP颗粒的直径较小（13.23 ± 9.66 μm vs. 63.54 ± 61.66 μm），这为细胞-材料相互作用提供了更大的比表面积，并增加了组织整合的生物界面，包括更多的细胞附着位点和改善的营养/废物交换[32]。与我们的球形模型[5]一致，Eggshell ACP颗粒表面支持了ECM成分（OPN、胶原I）的直接沉积，从而增强了生物活性的细胞-材料界面，为生物矿化提供了空间网络和成核核心。然而，需要指出的是，在当前的大鼠研究中，我们没有直接量化Mg和Sr的释放曲线，也没有将局部离子浓度与骨形成指标相关联。因此，我们将观察到的部分效应归因于这些微量元素是基于之前的体外数据以及Mg和Sr在磷酸钙结晶和骨代谢中的已知作用[7]、[28]、[29]、[30]、[31]。重要的是，这些组成效应在当前研究中与颗粒大小差异是内在相关的。Eggshell ACP表现出更小且更均匀的颗粒大小分布，这可能也通过增加比表面积和促进更广泛的细胞-材料相互作用来增强生物活性[5]。因此，观察到的生物学优势应被视为组成因素和形态因素的综合效应，而不仅仅是单一机制的结果。
区域性的骨结构差异是显而易见的。微CT和组织学显示，由ACP颗粒形成的缺陷中心的骨组织是多孔的，并富含类骨组织，而外围的缺陷骨组织则更致密且呈层状（图2、图3、图5）。基线BV/TV在圆柱形ROI（直径4.0毫米）和环形ROI（宽度0.75毫米）之间有显著差异（<5% vs. >20%；图4G和L）。尽管ACP颗粒在两个ROI中都降低了Tb.Sp（图4J和O），但基线和变化幅度存在很大差异。这些数据表明，新形成的中心骨可能需要更长的时间进行重塑，才能达到与天然颅骨相似的层状结构。在微CT得到的定量指标和组织学发现之间也存在明显差异，特别是在中心缺陷区域（ROI-2）。虽然两组ACP在BV/TV和Tb.Sp方面显示出相似的趋势，但组织学分析显示Eggshell ACP组形成了更连续和结构更有序的层状骨组织。这种差异可能反映了基于微CT的指标的固有局限性，这些指标主要量化骨体积和骨小梁结构，但未能完全捕捉组织的组织化、成熟度或胶原结构。相比之下，组织学分析对层状连续性、类骨组织形成和矿化模式等定性特征具有更高的敏感性。因此，Eggshell ACP的组织学优势应被视为骨质量的改善，而不仅仅是骨体积的增加。尽管如此，ACP，特别是Eggshell ACP，提供了一个有效的早期支架和矿化核心，显著增强了这种非承重模型中关键尺寸颅骨缺陷的再生。
大鼠颅骨模型的非承重性质限制了我们的发现可以推广到功能性承重重建的程度。为了解决这一差距，最近在兔子的关键尺寸股骨（负荷分担）和颅骨缺陷中评估了多孔的蛋壳衍生ACP支架[18]。在那项研究中，具有大约60%孔隙率的ACP支架，特别是与富含生物活性蛋白的透明质酸水凝胶结合使用时，在机械活性和非承重条件下都支持了大量的骨形成，减少了骨小梁分离，并产生了高度整合的骨-支架融合区[18]。结合当前的大鼠数据，这些结果表明蛋壳衍生的ACP可以在不同的解剖部位和机械环境中促进骨再生。本研究中使用颗粒状ACP反映了逐步转化的方法。虽然预形成的支架提供了结构完整性和机械稳定性，但颗粒系统具有更大的灵活性、可注射性和对不规则缺陷几何形状的适应性。评估颗粒状ACP允许独立于支架结构来评估材料的固有生物活性，从而为未来的支架设计奠定了基础。然而，需要更大的承重段缺陷模型和与结晶HAp基移植物的直接比较，以充分定义其转化潜力。
5. 局限性和未来方向
颅骨缺陷是一个非承重模型。虽然适合于隔离骨生成效应，但它不能预测在循环负荷、微运动或长骨或下颌骨的复杂机械生物学环境下的表现。虽然颅骨模型为评估早期骨生成提供了一个标准化平台，但我们认识到其生物力学环境与承重临床情况有显著差异。因此，未来的研究应包括承重部位，以评估空间维持、疲劳行为和功能性骨整合。此外，当前的研究没有包括生命周期评估或与合成路线相关的能量消耗和排放的定量分析。蛋壳在900°C下煅烧以去除有机成分，这是一个能耗较高的步骤。因此，基于我们目前的数据，不能声称该过程具有减少碳足迹或整体可持续性的优势。任何关于蛋壳升级利用的潜在环境效益都需要专门的生命周期评估研究，以量化与传统合成路线相比的完整能量平衡和排放概况。此外，本研究没有包括HA + HAp或蛋壳衍生的HAp对照组。这样的比较在未来的工作中是必不可少的，以确定在体外和体内支架形式中观察到的蛋壳衍生ACP相对于结晶HAp的优势是否会在相同的缺陷模型中转化为更好的体内骨再生。未来的体内研究还应包括与柠檬酸稳定的或故意掺杂离子的ACP配方的比较，这些配方在文献中经常被用作基准，以便更全面地定位蛋壳衍生ACP在临床相关ACP基骨移植材料谱系中的位置。还需要标准化评估术中灌注和早期血栓质量，这是早期愈合的关键决定因素，但在小缺陷中技术上具有挑战性。此外，没有量化Eggshell与对照组ACP中微元素（特别是Mg和Sr）的体内释放时间分辨。此外，由于合成路线的原因，当前研究中颗粒大小和组成差异是内在相关的。Eggshell ACP更小且更均匀的颗粒大小可能独立地促进了生物活性。因此，在当前的实验设计中，无法完全分离颗粒大小与组成因素（例如，Mg/Sr稳定的非晶相）的相对贡献。未来的研究应旨在分离这些变量，例如通过尺寸分级或制备具有控制颗粒大小分布的组成匹配的ACP。最后，尽管ACP颗粒显示出强烈的生物活性，但过渡到预形成的支架可以改善处理性、空间稳定性和缺陷特定的形状，同时保持ACP的非晶性质。
6. 结论
在一个非承重的关键尺寸颅骨缺陷模型中，两种ACP移植都显著增强了骨形成，与单独使用HA相比，蛋壳衍生的ACP在缺陷桥接和类骨组织激活方面表现出更好的性能。这种增强的性能可能是多种因素共同作用的结果，包括其Mg/Sr稳定的非晶结构和更小的颗粒大小，这些因素共同促进了生物活性和细胞-材料相互作用。蛋壳衍生的ACP将食物废物转化为一种升级利用的高价值生物材料，其中富含有益的微量元素，使其成为早期骨再生和未来临床应用的有前景的骨诱导移植材料。
打赏
