摘要
芪类化合物是一类具有显著健康益处的生物活性植物化学物质，但其提取过程受到疏水性和对有毒溶剂依赖性的阻碍。本研究介绍了一种使用亲水性天然深共晶溶剂（NADES）的绿色、可持续的芪类提取方法，以鸽豌豆（Cajanus cajan）中的卡詹芪酸（CSA）作为模型化合物。经过筛选，确定了最佳的NADES和超声辅助提取条件，实现了预测的CSA产率为0.832毫克/克。该方法表现出优异的可重复性和可持续性。光谱分析（ATR-FTIR、1H NMR、13C NMR、2D NOESY）、COSMO-RS和分子动力学（MD）模拟表明，NADES-4形成了一个包含甜菜碱、甘油和水的氢键超分子结构。MD模拟进一步阐明了驱动CSA溶解的热力学和协同非共价相互作用。这些发现为基于NADES的芪类提取提供了机制上的见解，并支持了开发用于植物资源利用的环保技术。
1 引言
芪类是一类源自天然植物的酚类化合物，具有特征性的苯乙烯骨架，结构为C6─C2─C6。在过去几十年中，由于其促进健康的功效（包括抗癌、抗炎和抗氧化作用），芪类受到了越来越多的关注（Błaszczyk等人，2019年）。众所周知的芪类化合物，如白藜芦醇（Vikal等人，2024年）、pterostilbene（McCormack和McFadden，2013年）和piceatannol（Banik等人，2020年），在文献中已有大量报道。有充分证据表明这些化合物具有潜在的健康益处，并且对治疗多种人类疾病有效（Teka等人，2022年）。例如，一项为期3个月的临床研究表明，口服白藜芦醇显著改善了2型糖尿病患者的高血糖状况，并降低了他们的血清总胆固醇水平（Bhatt等人，2012年）。我们的研究小组也积极参与这一领域的研究，于2008年从番茄肉汤中鉴定出两种生物活性芪类黄酮，即8-C-(E-phenylethenyl) naringenin（8-CEPN）和6-C-(E-phenylethenyl) naringenin（6-CEPN）（Cheng等人，2008年）。后续研究揭示了6-CEPN的重要功能，特别是它通过抑制环氧化酶-1（COX-1）并阻断晚期糖基化终产物（RAGE）/活性氧（ROS）/核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）信号通路来抑制结直肠癌的生长（Q. Zhou, Xu, Zhao等人，2022年；Y. Zhou, Xu, Cheng等人，2022年；Y. Zhou等人，2024年）。这些发现激发了我们对芪类化合物研究的浓厚兴趣，尤其是白藜芦醇类似物。我们证明2,3′,4,4′,5′-pentamethoxy-trans-stilbene可以通过靶向微管诱导结肠癌细胞的凋亡（Li等人，2009年），并发现pinosylvin具有出色的神经保护作用，这种作用是通过诱导PINK1/Parkin介导的线粒体自噬实现的，这是一种有效清除受损线粒体的机制（Xu等人，2020年）。在研究过程中，我们还从一种可食用的鸽豌豆（Cajanus cajan）的叶子中发现了一种独特的芪类化合物——卡詹芪酸（CSA）。鸽豌豆是全球第六大重要的可食用豆类作物，在农业系统和生态平衡中发挥着关键作用，同时在人类健康方面也具有巨大潜力。关于鸽豌豆的营养成分和健康促进作用已经进行了大量研究（J. Wu等人，2024年）。其中，CSA已被证明具有抗氧化、抗炎和抗病毒活性（You-qiang等人，2018年）。与白藜芦醇相比，CSA在防止DNA氧化损伤方面表现出更强的能力（N. Wu等人，2011年）。在我们之前的研究中，CSA被证明可以通过激活AMP-激活蛋白激酶（AMPK）/Nrf2通路来减少脑缺血/再灌注引起的线粒体功能障碍（Xu等人，2021年）。这些发现突显了CSA作为治疗缺血性中风的有希望的候选物质的潜力。虽然芪类化合物在植物中含量丰富，但通常不溶于水，通常使用传统的工业有机溶剂（如甲醇和乙醇）进行提取和分离（Sun等人，2006年）。在我们最新的研究中，制备了一种高性能有机溶剂纳滤膜，用于从鸽豌豆叶子的75%乙醇提取物中分离CSA（S. Zhang等人，2025年）。尽管我们使用了绿色膜分离技术，但提取过程仍然使用了有机溶剂。此外，有机溶剂暴露可能会影响实验人员的健康并造成严重的环境污染（Lim等人，2022年）。因此，有必要以绿色和可持续的方式用更环保的溶剂替代有机溶剂（Pena-Pereira等人，2015年）。随着对环境保护和可持续发展的日益重视，科学家们正在寻求开发从天然基质中提取生物活性成分的绿色替代方法。这些替代方法包括离子液体、超临界流体、可切换溶剂和深共晶溶剂（DES）（Esteve-Turrillas等人，2024年）。特别是，DES的多功能性和可调性使其在提取植物化学物质方面具有明显优势（Meenu等人，2023年）。DES是由两种或更多物质按一定比例通过氢键形成的。一种成分是氢键受体（HBA），如季铵盐；另一种是氢键供体（HBD），如醇类、糖类和其他有机配体（Smith等人，2014年）。天然深共晶溶剂（NADES）是一种由两种或更多天然化合物形成的DES，具有低成本、制备简单和绿色可持续性的优点（Raj和Singh，2024年；Wang等人，2024年）。此外，NADES在溶解性方面表现出强优势，能够有效溶解各种有机和无机化合物，并从植物、真菌和藻类等天然来源中提取生物活性化合物（Anmol等人，2023年；Meenu等人，2023年；F.-Y. Wu等人，2025年）。最近的出版物证明了NADES在提取花青素、苷类和多酚化合物方面的有效性（Cui等人，2015年；Meenu等人，2023年）。由于NADES富含氢键，其粘度通常较高，这可能会限制其在提取过程中的应用。然而，通过合理调整成分比例和分子结构，可以有效地调节NADES的关键性质（如溶解性、粘度和电导率），从而为不同的工业和科学研究需求提供灵活的解决方案（Dai等人，2015年；Suthar等人，2023年）。尽管如此，NADES的形成机制及其在辅助提取天然化合物中的作用仍很大程度上尚未得到探索。对可持续提取技术的追求促进了芪类化合物回收的溶剂工程创新，但仍存在关键挑战。虽然疏水性DES（例如百里酚/香豆素系统）在提取芪类化合物方面表现出更高的效率，但它们对挥发性氨溶液的依赖性损害了环境可持续性（Yue等人，2023年）。受到这种极性悖论的启发，我们假设亲水性NADES可能克服极性障碍，实现疏水性植物化学物质的绿色回收。本研究的目的是通过评估NADES介导的溶剂化和提取效率来实验验证这一假设。特别是，我们通过系统筛选22种亲水性NADES配方，以鸽豌豆中的CSA作为试验对象进行了研究。此外，通过多尺度表征（包括光谱证据（ATR-FTIR、1H NMR、13C NMR和2D NOESY）、COSMO-RS和MD模拟），深入研究了NADES的形成机制和CSA的提取过程。这项工作可能通过提供亲水性NADES来提取疏水性生物活性化合物，为可持续的植物化学物质加工创造新的机会。
2 材料与方法
2.1 化学品和试剂
D-果糖（99%）、D-(+)-葡萄糖（AR级）、尿素（99%）、氯化胆碱（98%）、甘氨酸（≥99%）、L-丙氨酸（99%）、L-苏氨酸（99%）、L-赖氨酸（98%）、L-精氨酸（≥98%）、L-脯氨酸（99%）、L-组氨酸（≥99%）、甘油（99%）、乙二醇（98%）和甜菜碱（98%）购自Aladdin Reagent Co. Ltd（中国上海）。用于LC-MS级的乙腈和甲醇购自Thermo-Fisher Scientific Inc.（美国马萨诸塞州）。用于LC-MS级的甲酸购自上海Macklin Biochemical Technology Co., Ltd。MCI GEL CHP-20P聚合物吸附剂购自Merck（德国达姆施塔特）。
2.2 NADES的制备与优化
参考先前的数据（Cui等人，2015年），使用超声辅助加热方法制备NADES。制备NADES和提取过程的示意图见图1。将HBA和HBD按一定的摩尔比和含水量混合在带塞的玻璃瓶中（表1）。然后将瓶子放入KQ-500E超声仪器（500 W，40 kHz，昆山超声仪器有限公司）中，在80°C下加热，直到形成均匀稳定的液体（大约2~4小时）。本研究中制备了二十二种NADES，它们的外观记录在表1中。
表1. 本研究中NADES的初始组成及其外观。
| 编号 | HBA | HBD | 摩尔比（HBA:HBD） | 含水量（%） | 外观 |
|------|-----|---------|-----------|--------|
| NADES-1 | 甜菜碱 | D-果糖 | 1:2 | 20% | 橙黄色透明液体 |
| NADES-2 | 甜菜碱 | D-(+)-葡萄糖 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-3 | 甜菜碱 | 尿素 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-4 | 甜菜碱 | 甘油 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-5 | 甜菜碱 | 乙二醇 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-6 | 氯化胆碱 | D-果糖 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-7 | 氯化胆碱 | D-(+)-葡萄糖 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-8 | 氯化胆碱 | 尿素 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-9 | 氯化胆碱 | 甘油 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-10 | 氯化胆碱 | 乙二醇 | 1:2 | 20% | 透明无色液体 |
| NADES-11 | L-赖氨酸 | D-果糖 | 1:2 | 20% | 深棕色粘稠不透明液体 |
| NADES-12 | L-赖氨酸 | D-(+)-葡萄糖 | 1:2 | 20% | 深棕色粘稠不透明液体 |
| NADES-13 | L-赖氨酸 | 尿素 | 1:2 | 20% | 黄色透明液体 |
| NADES-14 | L-赖氨酸 | 甘油 | 1:2 | 20% | 黄色透明液体 |
| NADES-15 | L-赖氨酸 | 乙二醇 | 1:2 | 20% | 黄色透明液体 |
| NADES-16 | L-脯氨酸 | D-果糖 | 1:2 | 20% | 紫红色透明液体 |
| NADES-17 | L-脯氨酸 | D-(+)-葡萄糖 | 1:2 | 20% | 橙红色透明液体 |
| NADES-18 | L-脯氨酸 | 尿素 | 1:2 | 20% | 浅黄色透明液体 |
| NADES-19 | L-脯氨酸 | 甘油 | 1:2 | 20% | 浅黄色透明液体 |
| NADES-20 | L-脯氨酸 | 乙二醇 | 1:2 | 20% | 浅黄色透明液体 |
| NADES-21 | L-精氨酸 | D-果糖 | 1:2 | 20% | 深棕色粘稠不透明液体 |
| NADES-22 | L-精氨酸 | D-(+)-葡萄糖 | 1:2 | 20% | 深棕色粘稠不透明液体 |
从表1中，通过评估CSA的提取效率筛选出具有更好提取效率的DES类型。同时，还分别优化了该溶剂的水含量和HBA/HBD摩尔比，以提高CSA的提取效率。分别改变DES的水含量（从0%到90%）和摩尔比（HBA/HBD从5:1到1:5），并使用上述方法进行制备。根据CSA的提取效率优化了NADES的制备条件。
2.3 使用NADES提取CSA的过程
2023年11月，从中国广东省揭阳采集了鸽豌豆叶。收集的鸽豌豆叶在阴凉处风干至恒定重量后，用粉碎机粉碎。粉碎后的鸽豌豆叶在室温下干燥并避光保存。在提取过程中，准确称量叶子，然后将表1中列出的NADES加入带塞的锥形烧瓶中，固液比为1:30。随后，将混合物在55°C下进行超声处理30分钟。使用离心机（4000 rpm，Esco Technologies, Inc.，美国）将提取物与残渣分离，收集所得提取物以供后续使用。此外，水和甲醇也在与NADES相同的条件下用于提取。
2.4 通过LC-MS分析进行定量
样品使用Shimadzu LCMS 2050进行分析，该仪器配备了XBridge C18柱（4.6 × 250 mm，5 µm）。流动相由0.1%甲酸/去离子水（A）和乙腈（B）组成，梯度洗脱程序为：0 ∼ 20 min，2% ∼ 55% B；35 ∼ 39 min，98% B；40 min，2% B。进样体积为8 µL，流速为0.6 mL/min，柱温为35°C。样品分析采用负离子扫描模式，扫描范围为100至800 m/z以鉴定CSA。通过0.22 µm滤膜过滤后，滤液可用于LC-MS分析。五种不同浓度的CSA标准溶液（从0.01至1 mg/mL）在259 nm下进行LC-MS分析。CSA的校准曲线基于峰面积（y）和CSA浓度（x）绘制：y = 143281.88x + 1117.33（R2 = 0.9999）。线性范围为10至1000 µg/mL。检测限（LOD）为0.18 µg/mL，定量限（LOQ）为0.52 µg/mL。
2.5 提取条件的优化
2.5.1 完全随机试验的设计
在初步筛选出最有效的NADES提取CSA后，确定天然化合物甜菜碱和甘油为最佳成分（NADES-4）。为了获得最佳的CSA提取条件，采用了完全随机设计实验。完全随机设计中每个变量的水平是根据初步的单因素实验和相关文献报告确定的，以确保有效实验范围的适当覆盖。研究了三个关键因素，包括提取温度、时间和SLR（固液比）。完全随机试验的实验设计列在表2中。
2.5.2 响应面方法学的实验设计
根据完全随机设计实验的结果，进一步使用响应面方法学（RSM）来优化提取方法。研究了三个独立变量（即提取温度、时间和SLR），以确定最佳的超声波辅助提取条件，从而最大化从鸽豌豆叶中提取CSA的产量。采用Design Expert 13.0软件（Stat-Ease, Inc.）进行了Box–Behnken设计（BBD）。如表3所示，共进行了17次实验，包括在中心值的5次重复实验。结果用于拟合方程模型，并通过Origin 2019b软件（OriginLab Corporation）进行可视化。
2.6 NADES-4的回收和再利用
在使用新鲜NADES-4进行第一次提取过程后，提取物经过CHP-20P树脂（75∼150 µm）柱层析来回收NADES-4。柱层析过程如下：首先用酒精活化CHP-20P树脂，然后用大量水冲洗以替换树脂中的酒精。接着，将5 mL的NADES-4提取物加载到柱中，并在CHP-20P柱中平衡2到4小时，采用湿柱法。CHP-20P柱依次用不同的溶剂进行洗脱。最初使用大量水洗脱HBA和HBD，大约用了3个柱体积的水来确保完全去除HBA和HBD。所得到的组分在减压下蒸馏以去除多余的水并回收NADES-4。随后，用1.5个柱体积的酒精洗脱柱子以收集该组分。回收的NADES-4用于下一次提取。
2.7 NADES-4的物理化学性质
2.7.1 减衰全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）
在室温下，使用ATR-FTIR（Nicolet iS10光谱仪，Thermo-Fisher Scientific，美国）获得了NADES的FTIR光谱。使用ATR附件，将少量液体样品倒在垫子上。光谱记录在4000至400 cm−1的范围内，分辨率为1 cm−1。FTIR光谱使用Origin 2019软件（OriginLab，美国）绘制。
2.7.2 密度和粘度
使用落球粘度计（Anton-Paar Lovis 2000 M）在10°C（283.15 K）–90°C（363.15 K）的温度范围内检测了NADES的粘度和密度变化趋势。将NADES样品注入测量池，并确保没有气泡。通过记录球在不同温度下穿过液体的时间来自动计算液体的粘度，然后获得密度。
2.7.3 核磁共振光谱（NMR）
准确称量20毫克的甜菜碱和甘油标准品，并溶解在0.6 mL的氘氧化物（D2O）中。使用D2O代替水来制备NMR NADES样品。NMR样品经过过滤后转移到带有塑料端盖的硼硅酸盐玻璃NMR管中。在室温下，使用Bruker AVANCE 600 MHz光谱仪（Bruker，德国）进行了1H NMR、13C NMR和核奥弗豪泽效应光谱（NOESY）测量。化学位移数据由MestReNova 15.1软件程序处理和分析。
2.8 甜菜碱的sigma轮廓预测
sigma轮廓显示了分子表面电荷密度（σ）的概率分布，这是通过量子化学计算获得的（Huang等人，2023年）。为了探索表面电荷分布，使用Materials Studio软件（版本2019）的DMol3模块对甜菜碱结构进行了几何优化。通过COSMO-RS（Conductor-like Screening Model for Real Solvents）模型模拟了溶剂效应，并将介电常数设置为78.54以模拟水溶剂环境（Pensini等人，2024年）。通过导入COSMO-RS数据并运行sigma轮廓分析来预测甜菜碱的sigma轮廓。使用Origin 2019软件（OriginLab，美国）对溶剂相互作用分析的sigma轮廓进行了可视化。
2.9 分子动力学模拟方法学
开发了分子动力学（MD）模拟来探索最佳NADES-4的形成和提取过程。使用Gaussian 16 A.03软件（Grimme等人，2011年）优化了HBA和HBD的结构。MD模拟使用GROMACS 2021.7软件进行。键合相互作用的参数是通过量子化学计算获得的。长程静电相互作用使用Particle Mesh Ewald（PME）方法（Essmann等人，1995年）处理，范德华（vdW）相互作用使用力切换方法（Steinbach和Brooks，1994年）处理。所有模拟系统的能量都进行了最小化。在所有模拟过程中，温度保持在298.15 K，压力保持在1 bar。模拟盒的初始尺寸为6.5 × 6.5 × 6.5 nm，并使用了三维周期性边界条件。结果使用VMD 1.9.3软件（Humphrey等人，1996年）进行可视化。系统1模拟了由甜菜碱、甘油和水制备的NADES-4的形成。系统2模拟了CSA在NADES-4中的溶解和扩散，初始结构是在盒子中心构建一个球形簇，模拟时间长达1.0 µs。
3 结果与讨论
3.1 NADES制备条件的优化
3.1.1 HBA和HBD的筛选
为了有效地从鸽豌豆叶中提取CSA，选择NADES成分和提取条件至关重要。通常，固液-液液提取过程基于“相似相溶”的原则。因此，NADES的极性会影响目标成分的提取率。在其他方面，溶剂的性质如粘度和密度也会影响溶剂的应用。例如，基于糖的NADES通常比基于氯的NADES具有更高的粘度，这导致了传质限制，成为其实际应用的一大障碍（Dai等人，2015年）。在本研究中，目标化合物CSA的极性较低，可能适合低极性NADES的提取。如表1所示，使用相同的方法成功制备了22种不同组成的NADES，并用于CSA的提取。通过LC-MS对提取物中的CSA进行定量分析来评估NADES的效果。特别是，有5种NADES组成未能提取CSA，包括NADES-11、NADES-12、NADES-20、NADES-21和NADES-22。剩余17种NADES提取物中的CSA含量（mg/g）显示在图2a中，其中NADES-4（甜菜碱-甘油）的提取率最高。因此，甜菜碱和甘油被认为是制备NADES的良好选择，并被选为后续条件优化的对象。
3.1.2 水含量的优化
NADES是由HBA和HBD通过分子间相互作用力形成的超分子结构。在本实验中，检测了不同水含量（0% ∼ 90%）的甜菜碱-甘油（NADES-4）提取物中的CSA含量。结果显示在图2b中。值得注意的是，当水含量低于10%时，无法成功制备NADES-4。相反，当水含量超过20%时，可以成功合成NADES-4。随着水含量的增加，CSA含量逐渐降低。20%的水含量是合适的。添加少量水可以降低深共晶系统的粘度而不破坏它（Rahman等人，2018年）。但是过量的水会破坏氢键系统，导致深共晶系统分解成水系统（Chen等人，2023年；Dai等人，2015年）。水是一种极性溶剂。随着水的添加，NADES-4的极性增加，这反过来降低了低极性CSA的提取效率。
3.1.3 HBA和HBD摩尔比的优化
研究了不同的甜菜碱/甘油摩尔比（从5:1到1:5）从鸽豌豆叶中提取CSA。当甜菜碱/甘油的摩尔比超过2:1时，无法形成均匀稳定的液体（NADES）。如图2c所示，当摩尔比为2:1时，CSA含量最高。当甜菜碱/甘油的摩尔比从2:1变为1:5时，提取物中的CSA含量降低。随着甜菜碱/甘油的摩尔比增加到2:1，甜菜碱的质量增加，可能降低了NADES-4的整体极性。因此，这种极性的降低增强了溶剂对低极性化合物CSA的亲和力。摩尔比为2:1的NADES具有比其他NADES配方更高的CSA提取率。
3.2 CSA提取条件的优化和NADES-4的回收
3.2.1 完全随机实验
在完全随机实验中，固定两个变量，同时逐步调整第三个变量，从而分离出各个效应，但忽略了潜在的因子相互作用。最佳条件是根据CSA含量（mg/g）确定的。三个变量的测试范围分别是LSR（1:10∼1:60 g/mL）、温度（20°C ∼ 60°C）和时间（10 ∼ 60 min）。分别获得了CSA提取的最佳条件（图3a）。这些参数被指定为RSM实验的中间水平，以进一步细化优化过程。
3.2.2 RSM实验
对于每个因素，围绕中间水平（在第3.2.1节确定）设置了高水平和低水平，总共设计了17次实验（表3）。通过检测NADES-4提取物中的CSA含量来绘制响应面（图3b）。从非线性回归模型得出的平面和3D响应面用于可视化因素之间的相互作用及其对CSA提取的影响。3D图直观地表示了回归方程。CSA的预测值使用以下编码方程计算：
其中Y代表提取物中的CSA含量；A代表温度/°C（−1, 0, 和 1）；B代表提取时间/min（−1, 0, 和 1）；C代表SLR/(mL/g)（−1, 0, 和 1）。如图3a所示，当温度从20°C升高到60°C，提取时间从10分钟增加到40分钟时，CSA含量增加。更高的温度和更长的提取时间有助于使用NADES提取CSA。然而，更高的温度和更长的时间需要更多的能量消耗。SLR的进一步增加最初提高了CSA的含量。但是超过某个阈值后，CSA含量的增加变得不显著。特别是在SLR和时间达到1:40和50分钟时，没有观察到CSA产量的显著增加。从绿色和能源效率的角度来看，温度和提取时间不宜过高。方差分析（ANOVA）被用来评估超声波介导的NADES的最佳提取条件，响应值的变化记录在表4中。结果表明，这些模型是显著的，并且适合进行合理的预测。综合来看，使用Design-Expert软件（版本13）确定的最大化CSA产量的最佳条件如下：温度62.5°C，时间54.5分钟，SLR 1:53.3。预测的CSA含量为0.832毫克/克。在响应面模型预测的最佳条件下进行了验证实验，结果为0.812毫克/克，与预测值非常吻合。
表4. 提取物中CSA含量的二次模型的ANOVA统计结果。
模型 均方 F值 p值
A-温度 0.1057 173.31 <0.0001 显著
B-时间 0.1017 166.71 <0.0001 显著
C-SLR 0.0653 107.05 <0.0001 显著
AB 0.0218 35.80 0.0006 不显著
AC 0.0251 41.23 0.0004 不显著
BC 0.0105 17.16 0.0043 不显著
A2 0.1130 185.32 <0.0001 显著
B2 0.1787 292.99 <0.0001 显著
C2 0.2038 334.19 <0.0001 显著
缺乏拟合 0.0009 2.10 0.2425 不显著
R2 0.9955 C.V. % 4.99
调整后的R2 0.9898 预测R2 0.9535
使用优化后的条件，比较了不同溶剂（即水、甲醇和NADES-4）提取CSA的效率。如图3c所示，CSA是一种低极性化合物，可溶于甲醇。由于叶绿素含量高，甲醇提取物呈现绿色。过量低极性和脂溶性的叶绿素使得CSA的纯化变得复杂。相比之下，水无法有效溶解CSA。而NADES-4（一种亲水性溶剂）产生的提取物呈黄色，叶绿素含量最低，这有助于简化CSA的纯化过程。色谱分析显示，NADES-4提取物的成分与甲醇提取物非常相似。NADES-4提取物和甲醇提取物中的CSA含量分别为0.812毫克/克和0.836毫克/克。我们的发现表明，亲水性溶剂可以作为传统有机溶剂的有效且环保的替代品，用于提取低极性、不溶于水的化合物。
3.2.3 NADES-4的重复使用性
溶剂的回收对于可持续和经济可行的化学过程至关重要（Liang等人，2023年）。因此，评估甜菜碱-甘油（NADES-4）的回收性是必要的。NADES-4通过CHP-20P柱色谱法回收，并通过LC-MS进行分析（图3c）。在回收实验中，含有甜菜碱和甘油的组分用大量去离子水从柱子中洗脱出来。随后，在减压条件下蒸馏以重新制备NADES-4。值得注意的是，在回收的NADES-4中未检测到CSA。回收的NADES-4（R1）被重新用于提取鸽子豌豆叶，R1提取物中的CSA含量为0.748毫克/克，与新鲜NADES-4相比提取率降低了7.88%。R1再次被回收得到R2，并用于提取鸽子豌豆叶，R2提取物中的CSA含量为0.697毫克/克，比使用新鲜NADES-4提取的降低了14.16%，比R1降低了6.81%。R2再次被回收得到R3，并被重新使用。R3提取物中的CSA含量为0.556毫克/克，比使用新鲜NADES-4提取的降低了31.52%，比R1降低了25.66%，比R2降低了20.2%。NADES-4在回收后仍保持其提取CSA的能力，证明了其可回收性和可持续应用的潜力。然而，经过多次循环后提取效率的下降可能是由于氢键网络的逐渐破坏或重组、溶剂回收过程中组分的轻微损失以及残留基质杂质的积累，这些因素共同影响了传质和溶解能力。
3.3 NADES-4的物理化学性质和结构
3.3.1 密度
密度是NADES的一个重要性质，通常其密度高于水（Tang和Row，2013年）。NADES的密度受其组分类型（HBA和HBD）、摩尔比以及温度的影响（Martín等人，2023年）。如图4a所示，NADES-4的密度从283.15 K升高到363.15 K时，从1.17克/立方厘米降低到1.12克/立方厘米。NADES-4在不同温度下的密度趋势符合以下方程（1）：
(1) 其中ρ（克/立方厘米）是NADES-4的密度，T（开尔文）是温度，a和b是从NADES-4密度和温度的拟合曲线中获得的拟合参数。根据拟合曲线，a为1.1771，b为-0.0006，R2为0.9999，表示拟合曲线的良好线性。NADES-4的密度与温度之间存在强烈的线性关系，如方程（1）所述。根据Hole理论（Omar和Sadeghi，2022年），热能可以引起溶剂局部密度的波动，增加NADES系统中HBA和HBD组分之间的自由体积。通常，NADES的密度高于水和传统有机溶剂，这与它的氢键系统有关（Zhao等人，2015年）。在加热过程中，NADES中的HBA和HBD之间的相互作用导致孔洞和空位的变化，从而引起密度变化。这些分子间距的变化会显著影响NADES的提取性能。
3.3.2 粘度
NADES的粘度与其分子间力密切相关，包括氢键、范德华相互作用以及其他组分间的相互作用。温度显著影响粘度。随着温度的升高，分子动能和移动性增加，分子间力减弱，粘度降低（Mitar等人，2019年）。图4b显示了NADES-4的粘度变化，随着温度从283.15 K升高到363.15 K，粘度从223.99毫帕秒降低到7.08毫帕秒。普遍认为，氢键的数量决定了溶剂的粘度（Koh等人，2023年）。NADES-4的粘度变化符合以下阿伦尼乌斯方程（2）：
(2) 其中η（毫帕秒）是粘度，Ea（千焦/摩尔·开尔文）是活化能，R（8.314焦耳/摩尔·开尔文）是气体常数，T是温度。图4c是lnη对1/T的拟合曲线。根据阿伦尼乌斯方程（方程2），计算得到Ea为2.20E+04毫帕秒，R2为36101.88千焦/摩尔·开尔文。NADES的粘度对温度非常敏感。粘度的急剧下降可能是由于随着温度升高，溶剂内部由氢键构建的超分子结构迅速崩溃。热能转化为动能，使分子能够克服分子间相互作用，从而自由移动。对于NADES-4来说，较高的温度对应较低的溶剂粘度，从而有利于传质过程的进行，并为提取温度的优化提供了依据。需要进一步研究来解决这一粘度的限制。
3.3.3 甜菜碱的表面电荷分布
sigma曲线描述了溶质或溶剂分子中表面电荷密度的分布，横轴表示表面电荷密度（σ），纵轴表示具有该特定电荷密度的表面积比例（Mullins等人，2008年）。具体来说，横轴上的正值表示分子表面正电荷的浓度较高，而负值表示表面负电荷的浓度较高（Pensini等人，2024年）。峰值高度表示具有给定电荷密度的分子表面积的比例。甜菜碱是一种两性离子，具有正电荷（N+）和负电荷（O═C─O−）。由于同时存在阴离子和阳离子，甜菜碱表现出比氢键更强的离子-离子相互作用。然而，围绕氮原子（N+）的三个甲基基团屏蔽了其正电荷，导致甜菜碱中的电荷不平衡，这可能抑制并限制了甜菜碱分子间的离子-离子相互作用（Abranches等人，2020年）。图4d中的sigma曲线显示，正峰的高度低于负峰，证实了三个甲基基团对N+正电荷的屏蔽效应。季铵氮带正电荷，但周围的甲基基团部分遮挡了氮原子，阻止了正电荷直接暴露在分子表面。这种空间屏蔽减少了正氮离子与其他带负电荷的分子或溶剂分子之间的直接静电相互作用，使得甜菜碱分子更倾向于与水分子形成间接的氢键网络。
3.3.4 ATR-FTIR光谱
研究了NADES-4及其组分（甜菜碱和甘油）的ATR-FTIR光谱，以揭示甜菜碱和甘油中的官能团，并确认它们在NADES-4制备过程中形成的氢键相互作用（图4e）。甜菜碱在1610和3290厘米^-1处有特征性的C═O伸缩振动峰，而在3360厘米^-1处有N原子的相关峰。甘油在3300厘米^-1处有特征性的O─H伸缩振动峰，在2880厘米^-1和2930厘米^-1处有C─H伸缩振动峰（分别代表─CH─和─CH2─）。NADES-4是由甜菜碱和甘油相互作用形成的，其红外光谱在1620厘米^-1处有C═O伸缩振动峰，在3200至3600厘米^-1处有一个宽峰，这与甜菜碱和甘油略有不同。C═O伸缩带的位移可以归因于NADES系统内的氢键相互作用。这些相互作用改变了羰基的电子分布，从而改变了C═O键的键强度和振动能量。观察到的红移和宽峰清楚地表明了NADES-4中形成了氢键网络（Jurić等人，2021年；Wang等人，2024年）。光谱显示NADES-4中的组分（甜菜碱和甘油）之间没有化学反应性，只有分子间的相互作用。
3.3.5 1H和13C核磁共振光谱
为了进一步探讨甜菜碱和甘油之间的相互作用，使用了1H NMR和13C NMR（图5）。NMR信号分配和化学位移（δ）列在表5中。NADES-4的1H NMR显示了来自甘油的3.40–3.70 ppm峰，来自甜菜碱的3.81和3.20 ppm峰（图5a）。快速的分子间质子交换形成了氢键，导致化学位移（δ）的变化（J. Zhang等人，2010年）。13C NMR的化学位移（δ）范围从169.07 ppm到168.38 ppm，对应于羰基（C═O）。从1H NMR可以得出，甜菜碱的─CH2─组的化学位移从3.87 ppm移动到高场的3.81 ppm，甜菜碱的─CH3组从3.21 ppm移动到3.20 ppm，甘油的─CH─组从3.73 ppm移动到3.66 ppm，甘油的─CH2─组从3.60/3.51 ppm移动到3.55/3.46 ppm。这些位移共同反映了甜菜碱-甘油和甘油-甘油之间的相互作用，如氢键等。
表5. 甜菜碱、甘油和NADES-4的NMR信号分配和化学位移（δ）。结构
位置
δH（ppm）
δC（ppm）
甜菜碱
1
—
169.07
2
3.87 (s, 2H)
66.15
3, 4, 5
3.21 (s, 9H)
53.32
甘油
1, 3
3.60 (dd, J = 11.8, 4.5 Hz, 2H)
3.51 (dd, J = 11.8, 6.6 Hz, 2H)
62.49
2
3.73 (tt, J = 6.5, 4.4 Hz, 1H)
72.04
NADES-4
C═O
甜菜碱 1-C
—
168.38
C─H
甜菜碱 2-C
3.81 (s, 2H)
72.12
CH2
甘油 2-C
3.66 (td, J = 6.1, 3.1 Hz, 1H)
66.04
甘油 1, 3-C
3.55 (dd, J = 11.6, 4.6 Hz, 2H)
3.46 (dd, J = 11.6, 6.3 Hz, 2H)
62.54
CH3
甜菜碱 3, 4, 5-C
3.20 (s, 9H)
53.17
3.3.6 核奥弗豪泽效应光谱（Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy）
NOESY 谱被用来阐明质子之间的相互作用。NOESY 谱显示甜菜碱-甘油（图 6a；图 S1）和甘油-甘油（图 6b；图 S2）之间存在强烈的 NOE 耦合。通过 NOE 耦合可以观察到脂肪氢的分子间 H–H 相互作用，即甜菜碱的 2-H 与甘油的 1, 3-H 之间的相互作用，以及甜菜碱的 ─CH3 与甘油之间的相互作用。同时，甘油中的脂肪氢与水之间没有 NOE 信号。甜菜碱的负电荷基团（O═C─O−）和甘油的羟基（─OH）容易与水形成氢键，图 S2 中观察到了 ─OH（甘油）与水之间的 H–H 相互作用。图 6c 展示了从上述 NMR 谱中推断出的相互作用示意图，显示了由甜菜碱和甘油构成的亲水性 NADES-4 中的 H–H 相互作用（氢键）和静电相互作用。总体而言，形成 NADES-4 的主要相互作用包括甜菜碱 ··· 甘油、甜菜碱 ··· 水、甘油 ··· 水以及甘油本身。
3.4 MD 模拟以揭示 CSA 的提取机制
在本节中，模拟了 NADES-4 的形成过程，并分析了组分间的氢键寿命和数量。模拟系统 1 最初是通过将水、甜菜碱和甘油分子放入模拟盒中建立的。图 7a 显示了系统 1 在结构稳定时的快照。表 6 中显示了氢键寿命（皮秒，ps）和数量（个，pcs）的统计数据。值得注意的是，没有检测到甜菜碱分子之间的氢键。甘油分子（708.054 个）形成了最多的氢键，其次是甜菜碱-甘油（523.127 个）。然而，甘油分子之间的氢键寿命（87.44 ps）比甜菜碱-甘油（149.45 ps）短。这些发现表明存在大量寿命相对较长的组分间氢键，证实了 NADES-4 的形成以及稳定的氢键网络的建立。
3.4.1 NEDAS-4 的形成机制
在本节中，模拟了 NADES-4 的形成过程，并分析了组分间的氢键寿命和数量。模拟系统 1 最初是通过将水、甜菜碱和甘油分子放入模拟盒中建立的。图 7a 显示了系统 1 在结构稳定时的快照。表 6 中显示了氢键寿命（皮秒，ps）和数量（个，pcs）的统计数据。值得注意的是，没有检测到甜菜碱分子之间的氢键。甘油分子（708.054 个）形成了最多的氢键，其次是甜菜碱-甘油（523.127 个）。然而，甘油分子之间的氢键寿命（87.44 ps）比甜菜碱-甘油（149.45 ps）短。这些发现表明存在大量寿命相对较长的组分间氢键，证实了 NADES-4 的形成以及稳定的氢键网络的建立。
3.4.2 MD 模拟揭示 CSA 的提取机制
为了探索 CSA 在 NADES-4 中的溶解和扩散过程，设计了系统 2 来模拟 CSA 分子从系统 1 盒中心向各个方向的移动。随着模拟时间从 0 延长到 1.5 微秒，最初作为球形簇放置在盒中心的 CSA 分子逐渐扩散到整个溶剂中，表明 CSA 与 NADES-4 之间存在强烈的相互作用。这种行为可以预测从鸽子豌豆叶中提取 CSA 的过程。此外，氢键的数量和寿命反映了它们的强度。根据氢键统计数据（表 6），CSA 与甘油之间的氢键数量最多（36.82461 个），其次是 CSA-甜菜碱（5.52503 个）和 CSA-水（2.60341 个）。然而，CSA-甜菜碱（104.95 ps）的氢键寿命最长，其次是 CSA-甘油（69.99 ps）和 CSA-水（30.27 ps）。结果表明，CSA 与甜菜碱/甘油之间的氢键很强，在 CSA 的提取过程中起着重要作用。
4 结论
本研究证明了亲水性 NADES 提取疏水性化合物的可行性，开发了可持续的天然产物提取工艺。以鸽子豌豆中的 CSA 作为模型化合物。通过评估提取物中的 CSA 含量，并通过完全随机设计和 BBD 实验优化了提取方法，筛选出了最佳溶剂 NADES-4。根据色谱图，甲醇提取物和 NADES-4 提取物在相同提取方法下的峰形非常相似，这表明亲水性 NADES-4 可以作为甲醇等有机溶剂的良好替代品。COSMO-RS 和 MD 模拟阐明了形成的氢键类型和数量以及其他相互作用能量，以及各组分对 NADES-4 形成的贡献。结合 NMR 光谱分析，结果表明甜菜碱-甘油和甘油-甘油之间的分子间相互作用在稳定 NADES 系统中起着关键作用。值得注意的是，当 CSA 分子引入 NADES-4 时，CSA 与甜菜碱/甘油/水之间形成了氢键。疏水性 CSA 逐渐溶解并被有效提取，这也得益于熵效应（系统自发追求最大无序状态）以及 CSA 本身具有的氢键位点。
作者贡献
张珊珊：研究、方法论、数据整理、初稿撰写、审阅和编辑。吴军：研究、软件使用。牛仁杰：研究、方法论、数据整理。周倩：指导、概念化、资金获取、审阅和编辑。王明富：撰写、审阅和编辑、指导、项目管理、资金获取、概念化。
本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金会（编号 2024A1515010489）和深圳市科技创新计划（编号 ZDSYS20220117155800001）的资助。
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