摘要
孕产妇肥胖是孕产妇和胎儿健康的风险因素，而白藜芦醇（RES）在我们之前的研究中显示出对不良妊娠结局的保护作用。本研究中发现，高脂饮食（HFD）会降低产仔体重（p < 0.05）、胎儿平均体重（p < 0.01）和胎盘效率（p < 0.01），同时增加孕产妇体重（p < 0.0001）以及胎盘和腹部脂质堆积，但这些影响可以通过补充白藜芦醇得到逆转。高脂饮食通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB/AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）的磷酸化来减少胎盘的血管生成，而白藜芦醇则逆转了磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蛋白激酶B（p-PKB/p-AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶点（p-mTOR）的磷酸化表达（p < 0.05）。体外细胞模型证实，PI3K抑制剂会抑制胚胎滋养层细胞的管状形成，而白藜芦醇可以直接与激酶结合激活PI3K。这些发现表明，孕产妇肥胖会损害胎盘的血管生成，而白藜芦醇可以通过调节PI3K的磷酸化来改善这一状况。
1 引言
全球育龄妇女的肥胖患病率超过20%，在某些发达国家这一比例甚至超过30%（Olerich等人，2022年）。孕产妇肥胖是一个普遍的问题，是孕产妇和胎儿健康并发症的风险因素，包括妊娠糖尿病（GDM）、宫内生长迟缓（IUGR）和胎儿在子宫内死亡。结合临床信息和新生儿出生数据的分析显示，孕产妇肥胖（定义为分娩时BMI > 30）与多种临床特征和胎盘病理显著相关（Zhang等人，2022年）。作为唯一直接与母体环境互动的胎儿组织，胎盘是胎儿从母体吸收营养和排除代谢废物的唯一途径。胎盘血管生成过程受特定调控因素的支配，以优化母婴之间的营养物质、氧气和代谢废物的传输。研究表明，IUGR胎儿的胎盘绒毛和毛细血管的体积、表面积、长度和密度均有所减少（Barapatre等人，2021年；Mayhew等人，2004年），这表明胎盘血管生成是决定胎儿存活和生长的关键因素。孕产妇体内过多的脂肪组织堆积会阻碍滋养层细胞的侵袭，从而影响胎盘发育、脂质代谢和营养转运，进而影响胎儿的发育路径（Yang等人，2023年）。孕产妇肥胖与胎盘中甘油三酯（TG）含量增加有关，导致异位脂肪沉积，进而引起胎盘发育不良、血管生成障碍和功能障碍（Saben等人，2014年），从而限制胎儿的生长和发育（Fowden等人，2021年）。白藜芦醇是一种天然的非黄酮类多酚类化合物，存在于多种植物中，如葡萄、浆果和花生中（Song等人，2024年）。它具有抗氧化和抗炎特性，并被认为有助于缓解肥胖和代谢综合征（Faisal等人，2024年；Meng等人，2023年；Rauf等人，2018年）。据报道，每天摄入低于5克的白藜芦醇是安全的（Boocock等人，2007年）。白藜芦醇的生物利用度很低，在小肠中大部分被结合成葡萄糖醛酸苷后进入血液循环（Patel等人，2011年；Wenzel等人，2005年）。然而，即使在非常低的剂量（0.2–2 mg/kg）下，白藜芦醇也能在体内发挥化学预防作用（Gescher和Steward，2003年）。研究证明白藜芦醇可以通过胎盘直接影响胎儿（Bourque等人，2012年）。跨不同物种和剂量系统的数据分析表明，摄入白藜芦醇可能减少胎盘和胚胎组织的炎症和氧化应激（Ramli等人，2023年）。我们之前的研究表明，200 mg/kg的白藜芦醇可以增加胎盘血管的密度和营养转运基因的表达（Hu等人，2022年）。因此，我们选择了高脂饮食（HFD）诱导的小鼠肥胖模型来研究孕产妇肥胖对胎盘血管生成和后代发育的影响，并进一步探讨补充白藜芦醇后的调控机制。
2 材料与方法
2.1 动物、饮食和实验设计
经过1周的适应期后，24只8周大的C57BL/6J雌性小鼠被随机分为两组（每组8只）：对照组（CTL）喂食基础饮食，高脂饮食组（HFD）和高脂饮食加白藜芦醇组（HFD-RES）喂食含有60%脂肪的饮食（总可代谢能量的60%来自脂肪）。9周时，对照组继续喂食基础饮食，高脂饮食组喂食含有60%脂肪的饮食，高脂饮食加白藜芦醇组喂食含有60%脂肪且添加500 mg/kg白藜芦醇的饮食。小鼠单独饲养在笼子中，遵循12小时光/暗周期，实验期间可自由饮水。13周时，将8周大的C57BL/6J雄性小鼠从晚上8点到早上8点放入每组笼子中，直到观察到交配栓。实验在妊娠16天（G16d）时结束。实验期间每周记录小鼠的体重。小鼠饲料的成分如表1所示。
表1. 实验饮食的成分
| 组别 | 蛋白质 % | 碳水化合物 % | 脂肪 % | 总热量 kcal/g |
| CTL | 19.2 | 67.3 | 4.3 | 3.85 |
| HFD | 20 | 70 | 10 | 5.24 |
| HFD-RES | 26.2 | 26.3 | 34.9 | 5.24 |
2.2 分娩记录和样本收集
在G16d处牺牲小鼠之前，让它们禁食12小时并保证自由饮水。牺牲前对小鼠进行称重并麻醉，收集所有样本，记录孕产妇的腹部脂肪重量、胎儿数量、产仔体重和胎盘重量。胎盘样本被收集并在液氮中快速冷冻；部分新鲜肝脏和胎盘组织用4%甲醛固定以供进一步研究。血液样本收集后，在室温下静置30分钟后再进行1500g离心10分钟，然后获取血清并储存在-80°C。
2.3 血清中的生化指标
使用相应的试剂盒（南京健成生物工程研究所，南京，中国）测定血清葡萄糖、总胆固醇（TC，A111-1-1）、甘油三酯（TG，A110-1-1）、低密度脂蛋白（LDL，A113-1-1）和高密度脂蛋白（HDL，A112-1-1）的水平。使用另一试剂盒（北京Solarbio科技有限公司）测定血清中的胰岛素水平（SEKM0141）。
2.4 组织学
胎盘、腹部脂肪和肝脏组织分别用苏木精和伊红（H&E）及油红O（武汉Servicebio科技有限公司，湖北武汉）进行染色。H&E：首先将组织在福尔马林中固定过夜，然后在梯度乙醇（50%，75%，85%，95%，100%）中脱水，接着用二甲苯透明处理，浸入二甲苯/石蜡（1:1）中，最后嵌入石蜡中。切片后，先将切片放在二甲苯I中20分钟，然后是二甲苯II中20分钟，再依次在绝对乙醇I和绝对乙醇II中各浸5分钟，最后分别用95%，85%，75%，50%的乙醇再水化5分钟，最后用自来水冲洗。切片用苏木精染色溶液染色3-5分钟，然后用自来水冲洗，再分化，再次冲洗，用苏木精-伊红复染至蓝色，最后用自来水冲洗。接着用绝对乙醇I，绝对乙醇II，二甲苯I和二甲苯II各浸5分钟，用中性树胶密封。使用MSHOT生物显微镜ML31进行图像采集和长度测量。
2.5 免疫组化染色
胎盘组织在福尔马林中固定过夜进行免疫组化染色。首先将组织嵌入石蜡，切片，脱蜡，修复抗原；然后用血清封闭切片；去除封闭液，随后将切片在4°C的湿盒中与抗体孵育过夜。切片用PBS冲洗三次，每次5分钟，然后用相应的二次抗体覆盖切片，在室温下避光孵育50分钟。使用DAPI染色细胞核，淬灭组织的自发荧光，切片稍干后用抗荧光封闭剂密封。最后拍摄显微镜图像进行观察。
2.6 Western Blotting
将胎盘组织称重（<100 mg），按1:9的质量比与RIPA裂解液混合，在低温下匀浆，然后在4°C下以12,000 g离心10分钟使蛋白质变性，之后测量蛋白质浓度。根据需要，将样本进行SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。转膜后，将膜在4°C下与特异性一次抗体孵育过夜，接着与HRP结合的二次抗体孵育1小时。进一步检测和量化结合抗体的水平。抗β-肌动蛋白和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的抗体购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州丹弗斯）。抗血管内皮生长因子A（VEGF-A）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、AKT、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶点（p-mTOR）和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）的抗体购自华安生物科技有限公司（中国杭州）。抗磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）和p-AKT的抗体购自Zen Biotechnology有限公司（中国成都）。HRP连接的抗体购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州丹弗斯）。使用GE ImageQuant LAS 4000设备检测结合的抗体。所有抗体信息和孵育条件见表2。
表2. 抗体信息及孵育条件稀释比例
加载量（µg）
孵育条件
暴露时间（秒）
p-PI3K
341468
1:1000
20
4°C过夜
90
PI3K
ET1608-70
1:1000
18
4°C过夜
50
p-AKT
341790
1:1000
20
4°C过夜
80
AKT
ET1709-47
1:1000
16
4°C过夜
60
p-mTOR
HA600094
1:1000
22
4°C过夜
120
mTOR
ET1608-5
1:1000
18
4°C过夜
100
eNOS
#9572
1:1000
20
4°C过夜
60
VEGF-A
#ER30607
1:1000
20
4°C过夜
75
β-Actin
#4967
1:1000
10
4°C过夜
1
HRP连接的抗体
#7074
1:5000
—
室温1小时
#7076
1:5000
—
室温1小时
缩写：eNOS，内皮型一氧化氮合酶；mTOR，雷帕霉素靶蛋白；PI3K，磷脂酸3-激酶；p-mTOR，雷帕霉素靶蛋白的磷酸化形式；p-PI3K，磷脂酸3-激酶的磷酸化形式；VEGF-A，血管内皮生长因子A。
2.7 拉下实验（Pull-Down Assay）
准备方法参考先前的研究（Yang等人2024年；Wu等人2017年；Hu等人2024年）。将5毫克RES加入1.5毫升试管中，并用适量的DMSO溶解。接着，在4°C下将混合物与CNBr活化的Sepharose 4B珠子结合过夜。在4°C下以1000g离心3分钟后，弃去上清液，加入相当于珠子体积五倍的结合缓冲液，再次以1000g离心3分钟，再次弃去上清液，然后加入相当于珠子体积五倍的0.1 M Tris-HCl（pH 8.0），室温下旋转2小时。用含有0.5 M NaCl的0.1 M醋酸缓冲液洗涤三次，再用含有0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲液洗涤。将预溶解的胎盘组织（浓度为500 mg/mL）与Sepharose 4B珠子或Sepharose 4B RES结合珠子（100 µL，50%悬浮液）在反应缓冲液中孵育过夜。洗涤五次后，使用特异性抗体进行Western blot检测结合在珠子上的蛋白质。
2.8 细胞培养和处理
HTR-8/SVneo细胞购自Aoyinbio（上海）。细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，培养条件为5%二氧化碳和37°C。
2.9 管道形成实验（Tube Formation Assay）
准备条件培养基：将HTR-8/SVneo细胞接种到T25组织培养瓶中，让其生长至30%-40%的细胞密度，然后用无血清的RPMI 1640培养基替换培养基24小时（细胞密度达到70%-80%），之后以1000 rpm离心5分钟，并通过0.22 µm滤膜过滤。24孔板预先涂覆120 µL Matrigel（Corning公司产品），在37°C下放置30-60分钟使其凝胶化。将105个HTR-8/SVneo细胞分别接种到含有20 µM LY294002（PI3K抑制剂，购自Selleck）、20 µM RES或20 µM LY294002和30 µM RES的条件培养基中（每个孔1毫升）。在37°C下孵育4-6小时后，用显微镜观察并拍照，使用Image J软件统计分支数量。
2.10 分子建模
使用软件对RES与PI3K蛋白（来自PDB的3HIZ）的相互作用进行建模。
2.11 统计分析
数据使用GraphPad Prism 9进行单因素ANOVA分析，随后进行Tukey的多重比较检验。统计显著性标准设为p < 0.05。
3 结果
3.1 RES对高脂饮食（HFD）诱导小鼠脂肪沉积的影响
图1A展示了小鼠实验的设计。图1B显示了HFD诱导后小鼠的体重变化。图1C显示，8周时HFD组和HFD-RES组的体重显著高于CTL组（p < 0.0001）。图1D显示，添加RES四周后可以显著降低高脂饮食引起的体重增加（p < 0.0001）。图1E显示，HFD组妊娠第16天的母体体重显著高于CTL组（p < 0.0001）；然而，添加RES后效果有限（p > 0.05）。HFD组的腹部脂肪比例显著高于CTL组（p < 0.0001），HE染色显示腹部脂肪细胞体积增大，添加RES后显著减少（p < 0.05）（图1F,G）。图1G显示了肝脏组织的油红O染色结果，添加RES可以减轻HFD引起的脂质聚集。上述结果表明，妊娠期间母体体重增加的差异主要与脂肪沉积的变化有关。
3.2 RES对高脂饮食诱导小鼠生殖性能的影响
图3A表明各组之间的胎儿数量无显著差异（p > 0.05）。图3B显示HFD组的窝仔体重显著低于CTL组（p < 0.05）。图3C显示HFD组的胎儿平均体重显著低于CTL组（p < 0.01），添加RES后显著改善（p < 0.05）。此外，图3D显示HFD组的胎盘效率显著低于CTL组（p < 0.01），添加RES后显著提高（p < 0.05）。
3.3 RES对HFD诱导小鼠胎盘血管生成及相关蛋白的调节
图4A显示了小鼠胎盘的油红O染色结果，HFD组的脂滴染色程度更深，表明HFD诱导后胎盘内脂肪沉积更多，添加RES可以减少胎盘中的异常脂肪沉积。图4A,B显示HFD组的胎盘血管数量较少，CD31荧光强度低于CTL组（p < 0.0001），而添加RES后CD31荧光强度和视野中的胎盘血管数量均增加（p < 0.0001）。
3.4 RES与PI3K的直接结合及其在血管生成中的作用
分子建模结果显示RES可以特异性结合PI3K（图5A）。基于我们的先前研究（Hu等人2024年；Yang等人2024年），进一步进行了体外拉下实验（pull-down assay）以评估RES与PI3K的直接结合活性。图5B显示在结合了RES的Sepharose 4B珠子中检测到PI3K（75.3%）；而在未添加RES的对照组（仅有Sepharose 4B珠子）中未检测到PI3K。这种直接相互作用为体内和体外实验中观察到的RES诱导的PI3K磷酸化提供了分子基础。
3.5 RES对HFD诱导小鼠血清生化指标的影响
图2显示HFD组的TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）和葡萄糖水平显著高于CTL组（p < 0.0001）；添加RES后TC水平有所下降（p = 0.0592）。
3.6 RES对HFD诱导小鼠生殖性能的影响
图3A显示各组之间的胎儿数量无显著差异（p > 0.05）。图3B显示HFD组的窝仔体重显著低于CTL组（p < 0.05）。图3C显示HFD组的胎儿平均体重显著低于CTL组（p < 0.01），添加RES后显著改善（p < 0.05）。这种情况还与胎盘功能受损、线粒体功能障碍、炎症和氧化应激有关（Rasool等人，2022年；Wu等人，2023年）。研究表明， maternal肥胖会导致肥胖母亲的胎盘中TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）和磷脂的浓度升高，可能影响膜的流动性以及向胎儿的养分运输（Calabuig-Navarro等人，2017年）。胎盘组织具有高度密集的血管，充分的胎盘血管生成对于妊娠成功和胎儿最佳生长至关重要。研究显示，在低出生体重的情况下，胎盘的血管密度会减小（Song等人，2018年）。白藜芦醇（RES）已被证明可以有效下调胎盘炎症因子的转录，同时增强胎盘内抗氧化酶的基因表达和运输功能（Hu等人，2022年）。有研究报道，在妊娠期间补充白藜芦醇可以提高胎盘的抗氧化状态并促进胎盘血管生成（Hu等人，2022年；Meng等人，2018年）。在本研究中，发现白藜芦醇能够增强后代的体重和胎盘效率，这两者都因高脂肪饮食（HFD）的诱导而降低。高脂肪饮食诱导导致脂滴增多，并减少了胎盘中的血管生成标志物CD31的表达和胎盘中的血管数量。胎盘中新血管的形成依赖于血管生成和血管新生过程（Pardali等人，2010年），这些过程直接或间接地受到VEGF及其相关信号通路的调节（Huang等人，2021年；Umapathy等人，2019年）。eNOS-VEGF信号通路是参与血管新生的经典通路（Yang等人，2021年）。在本研究中，不同组别胎盘组织中VEGF蛋白的表达水平并未达到统计学上的显著性。VEGF下游的PI3K/AKT/mTOR通路是细胞中的一个重要信号转导网络，参与胚胎发育、组织稳态和代谢调节，在血管生成中也起着关键作用（Yang等人，2026年）。生长因子与细胞膜上的受体酪氨酸激酶（RTKs）结合，使受体磷酸化并招募PI3K（Wiese等人，2023年）。激活的PI3K催化膜磷脂PIP2转化为PIP3，PIP3促进AKT的招募，然后通过抑制TSC1/TSC2复合体来激活mTORC1，这已被认为是滋养层细胞发育中的一个关键通路（Hu等人，2016年；Prabhu等人，2025年）。在生理条件下，AKT的激活通常是短暂的，并依赖于生长因子或胰岛素等刺激（Huang等人，2018年）。与胰岛素抵抗相关的代偿性高胰岛素血症可能会延长激酶（如AKT）的磷酸化和激活。这种持续激活会改变细胞代谢、存活信号传导和炎症反应，从而促进病理过程，包括代谢功能障碍和血管异常（Bertacca等人，2005年；Liu等人，2009年）。先前的研究表明，AKT基因的破坏会导致胎盘功能不全、胎儿生长受损和新生儿死亡率增加（Yang等人，2003年）。mTOR已知可以促进内皮细胞的增殖和血管生成（Karar和Maity，2011年）。PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化的上调与整体胎盘代谢改变和养分运输增强有关（Cui等人，2022年）。本研究表明，小鼠的高脂肪饮食会导致胎盘血管生成减少以及PI3K、AKT和mTOR的磷酸化降低。相反，添加白藜芦醇可以增加胎盘血管生成并减轻高脂肪饮食对PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化的抑制作用。此外，白藜芦醇可以特异性地结合PI3K激酶，拉下实验表明白藜芦醇可以结合PI3K，从而进一步调节下游信号通路；这种激活机制可以抵消母体肥胖对胎盘血管生成的抑制作用，从而促进胎儿发育和胎盘效率。另外，有报道称LY294002可以抑制白藜芦醇对小鼠胎盘的影响（Huang等人，2022年）。在本研究中，即使在添加白藜芦醇的情况下，抑制PI3K表达后也会抑制细胞管状结构的形成。
**5 结论**
总之，本研究表明，过多的脂肪积累会对小鼠的生殖性能产生不利影响，表现为产仔体重、后代平均体重和胎盘效率的下降。白藜芦醇通过调节胎盘中的血管生成信号通路具有缓解生殖性能下降的潜力，其中PI3K通路可能起着关键作用。
**作者贡献**
杨希兹：概念化、初稿撰写、审稿和编辑。胡瑞志：概念化、撰写、审稿和编辑。史明坤：研究工作。袁旭鹏：研究工作。刘明：监督、数据管理。陈亮：监督、数据管理。张洪富：监督、数据管理。范志勇：方法学设计。何曦：资金筹集。何建华：资金筹集和资源获取。吴淑松：资金筹集和验证。
**资助**
本研究部分得到了国家自然科学基金（U25A20706和U22A20515）和中国博士后科学基金会（GZC20251664和2025M770256）的资助。
**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。
**数据可用性声明**
所有支持本研究结果的数据可在合理请求下从相应作者处获取。
