凌晓宝|傅明宝|何萌|丹木|苏丽娜·博
内蒙古大学化学与化学工程学院，呼和浩特010021，中国
**摘要**
作为松子的副产品，松子壳的工业和药用价值一直被忽视。近几十年来，松子壳多糖作为松树的重要生物活性成分引起了科学界的广泛关注。通过热水提取和乙醇沉淀后纯化，从松子壳中分离出一种分子量为26 kDa的中性多糖（PNSP）。利用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、气相色谱（GC）、红外光谱、甲基化分析和核磁共振（NMR）对PNSP进行了结构和植物化学表征。结果表明，PNSP是一种杂多糖，由半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）和鼠李糖（Rha）组成，其摩尔比为30.5:28.7:19.4:12.4:5.1:3.9，其主链由β-D-Manp-(1→5)-α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Galp-(1→重复单元构成，在C-6位置有分支，分支通过→5)-α-L-Araf-(1→, →4)-β-D-Glcp-(1→连接。通过菌落计数法和最小抑菌浓度（MIC）分析了PNSP对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）的抗菌活性，结果显示PNSP的MIC为0.8 mg/mL，表现出潜在的抗菌活性。
**1. 引言**
朝鲜松（Pinus koraiensis）广泛分布于中国东北部、俄罗斯、朝鲜和日本，主要分布在中国长白山至小兴安岭一带[1]。由于松子的营养价值和药用价值，中国已成为一个主要的松子消费国[2]。松子的商业加工会产生多种副产品，包括松果、壳、种皮、松子片和面粉或粉。按质量计算，可食用的松子仁约占收获松果鲜重的3%[3]。其中，壳和松果是主要成分，壳本身占总重量的约40%[4]。如果松子壳处理不当，可能会造成严重的环境污染和资源浪费[5]。此外，松子壳的商业和药用价值通常被忽视。
坚果副产品富含植物化学物质——这是一类天然存在于植物中的非营养性生物活性化合物。松子壳的主要生物活性成分包括酚类、黄酮类、原花青素、精油和多糖[6][7][8]。这些化合物在促进健康和预防疾病方面发挥着重要作用。松子副产品（如壳、松果、皮和粉/面粉）的提取物在溶剂、水或匀浆形式下显示出显著的抗氧化能力，显示出作为食品和药品应用的天然抗氧化剂的潜力[9][10]。此外，这些副产品在药物开发方面也具有很大潜力。例如，从松子粉蛋白水解物中分离出的生物活性肽具有免疫保护作用，碱性壳和松果提取物已被证明对癌细胞具有抗增殖作用[11]。此外，松果提取物还被报道具有增强免疫力、抗肿瘤和抗HIV的特性[12][13]。在各种植物化学物质中，多糖是这些副产品中的主要成分。值得注意的是，天然来源的多糖在调节免疫力、抗氧化活性和抗菌活性方面起着重要作用。多糖是由单糖单元通过糖苷键连接而成的长链生物大分子，具有从线性到高度分支的各种结构多样性，并可能包含各种侧链[14]。先前的研究表明，松子壳中的多糖具有出色的抗氧化[15]和免疫调节活性[13]。人们对松子壳中多糖的提取方法和单糖组成给予了相当大的关注[16][17]。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是一种常见的人类致病菌，对高温和低温都具有抗性[18]。S. aureus不仅可引起局部化脓性感染（如疖子、粉刺、毛囊炎、甲沟炎和手术切口感染），还可引起肺炎、肠炎、心包炎甚至败血症等全身性感染[19]。通常使用万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁等抗生素治疗S. aureus感染。不幸的是，抗生素的滥用会导致耐药菌的产生。许多临床使用的抗S. aureus药物来源于天然产物，这得益于它们独特的化学结构、良好的细胞渗透性和靶向性[20]。这些生物活性化合物主要来源于药用植物（如黄酮类、生物碱和萜类）、抗菌肽以及内生菌和海洋生物的代谢产物[21][22]。因此，天然产物仍然是发现新的抗S. aureus药物的有希望的资源，其中多种化合物表现出强烈的抗菌活性。因此，越来越多的研究人员致力于寻找高效且低毒性的新药物来治疗细菌感染。
**2. 材料与方法**
2.1. 材料与试剂
2022年，我们的实验室在中国内蒙古大兴安岭地区收集了松子壳。不同分子量的葡聚糖标准品（Shodex STANDARD P-82 Pullulan 90601）从昭和电工（东京，日本）购买，标准单糖（半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）和鼠李糖（Rha）从Sigma（圣路易斯，美国）购买。木瓜蛋白酶（P08A9B67156）从远业公司（上海，中国）购买，透析管从Biotopped公司（北京，中国）购买。实验中使用的其他试剂均为分析级。培养基成分（包括胰蛋白胨、牛肉提取物和酵母粉，从广东环凯微生物技术有限公司，上海，中国）和琼脂（Ca. 291533100，Cooler Science & Technology，上海，中国）为生物试剂级。S. aureus（革兰氏阳性ATCC 6538）被用作抗菌实验的模型菌。
2.2. 多糖的提取与纯化
松子壳多糖的提取方法参考了Dong等人的研究[23]并进行了部分修改。将干净的松子壳粉末浸泡在95%乙醇中，室温下放置4小时以去除小分子杂质。过滤后，在37°C下烘干得到预处理后的干燥样品。将干燥样品（500 g）用5000 mL蒸馏水在90°C下提取3次，每次2小时。滤液在5000 rpm下离心15分钟，上清液浓缩至初始体积的1/8，然后用80%（v/v）乙醇在4°C下沉淀24小时。离心后，将沉淀物溶解在蒸馏水中，浓缩并冻干。将松子壳粗多糖再次溶解在蒸馏水中，加入大孔树脂AB-8中，搅拌12小时以去除色素[24]。过滤、浓缩和冻干后，对脱色后的多糖进行处理。为了脱蛋白，将5 g脱色多糖溶解在蒸馏水中，加入2%木瓜蛋白酶，在37°C下振荡24小时。将酶在80°C水浴中失活20分钟。冷却至室温后，以3000 rpm离心15分钟，并通过加入1/4体积的Sevag试剂（氯仿：正丁醇=4:1）多次脱蛋白，直至蛋白质完全去除。沉淀物重新溶解并在蒸馏水中旋转（分子量截留值5 kDa）3天。最后，将透析液浓缩并冻干，得到纯化的PNSP。
2.3. 多糖的结构表征
2.3.1. 均匀性和相对分子量的测定
使用配备Waters 515泵（Milford，MA，美国）和Waters 2410差分检测器（RID）的高效凝胶渗透色谱仪（HPGPC）来确定平均分子量[25]。HPGPC使用Ultrahydrogel 500和Ultrahydrogel 250（7.8 mm × 300 mm，10 μm）柱子，排除范围为0.1–1000 kDa。柱子用醋酸缓冲液（pH 4.5）以0.9 mL/min的流速洗脱。柱温为35°C。使用不同分子量的葡聚糖标准品（5800、11,800、22,800、47,300、10,000、212,000、380,000和788,000 Da）绘制校准曲线。
2.3.2. 单糖组成的分析
单糖组成通过气相色谱（GC）测定，使用GC–MS QP2010 GC系统（岛津，日本）进行，配备Hp-5柱（30 mm × 0.25 mm，320 μm，Agilent 19, 091 J-413，美国），在以下条件下操作：起始温度120°C，然后以3°C/min的速度升至250°C并保持5分钟。进样器和检测器温度均设定为250°C。H2和空气的流速分别为30 mL/min和400 mL/min。载体气体为He，流速为1.0 mL/min。PNSP样品（2 mg）在1 mL 2 M三氟乙酸（TFA）中在120°C下水解2小时。加入甲醇溶解水解物，反复浓缩直至干燥，然后去除剩余的TFA，加入双蒸水（2 mL）和硼氢化钠（100 mg）在室温下反应12小时，再用乙酸中和。还原产物用甲醇（3 mL）反复浓缩直至干燥，然后用1 mL乙酸酐在100°C下乙酰化1小时，冷却后用甲基苯（3 mL）反复浓缩以去除多余的酐。将乙酰化产物溶解在3 mL氯仿中，转移到分离漏斗中。加入少量蒸馏水，充分振荡后去除上层水溶液；此过程重复5次。氯仿层用适量的无水硫酸钠干燥，体积调整至10 mL用于GC–MS分析。
2.3.3. 甲基化分析
根据Feng等人的方法[26]进行甲基化分析；首先将PNSP的羧基还原，然后用NaOH粉末溶解在DMSO-MeI中对其进行三次甲基化[27]。FT-IR光谱中3700–3200 cm−1处的峰消失，表明完全甲基化。甲基化产物在100°C下用2 mol/L TFA（1 mL）水解8小时，然后用NaBH4还原。将pH调整至5.5后，用等量的乙酸酐吡啶进行乙酰化。所得产物用HP-5毛细管柱（30 mm × 0.25 mm，320 μm）进行GC–MS分析，温度程序为：120°C升至250°C，以3°C/min的速度升温并保持5分钟。进样器和检测器温度均设定为250°C。H2和空气的流速分别为30 mL/min和400 mL/min。离子源：EI 70 eV；质谱真空<14.5 psi；质量扫描范围：50–500 au；样品量：1 μL[28]。
2.3.4. 傅里叶变换红外（FT-IR）和紫外-可见（UV–vis）光谱分析
将干燥样品（2 mg）与KBr（200 mg）一起研磨成粉末，并压制成圆盘。使用FT-IR光谱仪（Thermo Nicolet Avater 370，美国）记录4000至500 cm−1的透射率范围。PNSP样品的UV–Vis光谱在U-3900分光光度计（Hitachi U-3900，日本）上测量。中性多糖（2 mg）用6 mL蒸馏水蒸馏后作为空白对照。紫外光谱的扫描波长范围为200至400 nm，室温下进行。
2.3.5. 核磁共振（NMR）分析
使用Bruker Avance III 500核磁共振光谱仪（Bruker（北京）科学技术有限公司，北京）在40°C下，以D2O和3 (trimethylsilyl) 1丙磺酸钠盐（DSS）作为内标，记录PNSP的1H NMR、13C NMR以及二维COSY、HSQC和HMBC光谱。将粉末状PNSP（50 mg）溶解在500 μL氘水中，转移到核磁共振管中进行扫描。
2.3.6. 扫描电子显微镜（SEM）分析
使用环境扫描电子显微镜（Hitachi S-4800，东京，日本）获取样品的扫描电子显微图像。将干燥的粉末样品放在双面胶带固定的样品架上，然后用溅射镀膜机喷涂金粉，在1.00 k、2.00 k、4.00 k和8.00 k放大倍数下观察。热重分析（TGA）：样品（3毫克）被精确称重后放入坩埚中压实，并使用STA 449C热重分析仪（Netzsch，德国）进行分析。温度范围从25°C到800°C，加热速率为10°C/分钟，在氮气保护下进行（流速为100毫升/分钟）。
2.3.8 原子力显微镜（AFM）分析：样品溶解在乙醇中（浓度为20微克/毫升），置于60°C的水浴中振荡120分钟，然后将5微升样品溶液滴在新鲜切割的云母上。之后，样品在室温（25°C）下风干12小时。使用AFM（Dimension Icon，Bruker，美国）技术观察PNSP的超微结构，分辨率为256×256线，扫描速率为1.0赫兹。扫描范围为5×5微米。
2.3.9 康戈红分析：将一毫升样品溶液（浓度为1.0毫克/毫升）与1.0毫升康戈红（浓度为0.1毫摩尔/升）混合。接着，向上述混合物中加入不同体积的NaOH溶液（浓度为1.0摩尔/升），以获得最终的NaOH浓度（0–0.5摩尔/升）。使用UV-Vis分光光度计在300–600纳米范围内扫描溶液，以确定最大吸收波长。
2.4 PNSP的抗菌活性：
2.4.1 抗菌测定：为了评估PNSP的抑菌活性，选择了金黄色葡萄球菌（ATCC6538，革兰氏阳性细菌）作为模型病原菌，并应用平板计数法[29]。实验前，将离心管、培养皿和其他所需材料和仪器在高压灭菌器中以120°C灭菌1.5小时。PNSP溶解在无菌水中，然后用紫外线灭菌。将一毫升PNSP溶液（浓度为5毫克/毫升）加入100微升细菌悬液（浓度为10^5 CFU/毫升），在220转/分钟和37°C下振荡60分钟。通过将100微升上述细菌溶液转移到40毫升液体培养基中并在37°C下振荡60分钟来扩增培养物，之后培养24小时以观察细菌存活情况。对于对照组，在没有多糖样品的情况下重复相同的程序三次。计算每个琼脂平板上的存活菌落数，并使用以下公式计算相应的抗菌率。将不同浓度的多糖（0.25、0.5、1、2、3、4、5和6毫克/毫升）各加入100微升1×10^5 CFU/毫升的溶液中，培养60分钟，然后培养24小时以观察细菌存活情况。本研究进一步探讨了多糖对不同浓度金黄色葡萄球菌的抑制作用。将一毫升5毫克/毫升的多糖溶液加入细菌溶液中（浓度分别为1×10^5、10^6、10^7和10^8 CFU/毫升），然后在37°C下恒温培养24小时以观察金黄色葡萄球菌的存活情况。最终灭菌率根据以下公式计算：
灭菌率 = (A - B) / A × 100%，
其中A和B分别代表原始细胞数和存活细胞数。
2.4.2 最小抑菌浓度（MIC）测定：PNSP的MIC通过Song等人[30]和Jridi等人[31]描述的双倍肉汤稀释法进行分析。首先，将不同浓度的100微升PNSP样品（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0毫克/毫升）过滤通过96孔微孔板，然后加入100微升细菌悬液（浓度为10^6 CFU/毫升）并充分混合；不加细菌悬液的微孔板作为对照。随后将微孔板在37°C下培养24小时。没有细菌生长的抑菌剂浓度被记录为实验细菌的最小抑菌浓度。
2.5 统计分析：所有实验重复三次。抑菌活性数据以平均值±标准差（SD）表示。使用SPSS 20.0软件（IBM公司，美国阿蒙克）进行单因素方差分析（one-way ANOVA）来分析显著性。p<0.05的比较被认为具有显著差异。
3. 结果：
3.1 PNSP的提取和纯化：通过热水提取和酒精沉淀法，从松子壳中提取的总多糖产量为1.6%。随后使用AB-8大孔吸附树脂脱色，并通过木瓜蛋白酶和Sevag方法的组合去蛋白，得到纯化的PNSP。通过酚-硫酸法测定，PNSP的总糖含量为48.89%。此外，使用Coomassie brilliant blue方法评估的去蛋白率为70.5%。元素分析显示PNSP含有42.40%的碳、4.719%的氢和0.21%的氮。
3.2 PNSP的结构表征：
3.2.1 均匀性和相对分子量的测定：使用HPGPC和葡聚糖标准品测定PNSP的分子量。构建了分子量标准曲线，公式为lgMw = 26.5–3.81tR + 0.236tR^2–0.00522tR^3（R^2 = 0.9917），其中tR是洗脱时间。根据该公式，PNSP的平均分子量为26 kDa，多分散指数（Mw/Mn）为1.6（图1A）。这些结果表明PNSP是一种分子量分布相对均匀的多糖。
下载：下载高分辨率图像（254KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. (A) 通过高效凝胶渗透色谱法测定PNSP的分子量。(B) 单糖组成的GC色谱图。(C) PNSP的傅里叶变换红外（FT-IR）光谱。(D) PNSP的紫外（UV）光谱。
3.2.2 单糖组成分析：通过三氟乙酸水解和GC分析确定多糖组分中的单糖组成。结果表明PNSP是一种杂多糖，由Gal、Man、Glu、Ara、Xyl和Rha组成，比例为30.5:28.7:19.4:12.4:5.1:3.9（见图1B）。
3.2.3 FT-IR光谱：PNSP的FT-IR光谱如图4C所示，显示出典型的多糖吸收峰（3439、2923、1741、1613和1443厘米^-1）。3439厘米^-1的宽峰归因于糖基羟基的伸缩振动，这在碳水化合物中很常见[32]。2923厘米^-1的弱峰对应于CH的不对称伸缩和弯曲振动[33]。1741厘米^-1和1613厘米^-1的吸收峰对应于-COOR基团的振动[34]、[35]。1443厘米^-1的峰归因于CH的可变角度振动[36]。1200–1000厘米^-1的范围特别有趣，因为在这个区域显示了环的振动、C-O-H伸缩振动以及吡喃环的C-O-C和CO伸缩振动[37]。大约550–770厘米^-1的弱吸收带可能归因于糖环骨架和羟基的振动。大约809.1厘米^-1的弱吸收带归因于α-D-Galp[38]。FT-IR对PNSP的表征显示了典型的多糖吸收带。
3.2.4 UV–vis光谱和SEM图像：在U-3900分光光度计上测量了PNSP样品的UV–Vis光谱（图1D）。PNSP的UV光谱分析显示在260和280纳米处没有吸收；因此，PNSP不含明显的核酸或蛋白质[30]、[39]，这与其元素组成分析一致。不同放大倍数（1.00 k、2.00 k、4.00 k和8.00 k）下的PNSP SEM图像如图2A所示。PNSP呈现出不规则的松散片状外观。1.00 k放大倍数下的图像（图2A）显示了纤维之间的无序纤维结构，形成网状图案。纤维的直径和长度各不相同，但整体外观细腻且一致。2.00 k、4.00 k和8.00 k放大倍数下的细节分别显示了纤维的连接和交织，表面观察到一些不规则的突起和凹陷，表明其具有复杂的微观结构和三维网状结构。Lonicera japonica Thunb. [40]和Mirabilis himalaica (Edgew) heim [25]中的多糖表面形态已有报道。这些结构特征可能意味着多糖中活性基团的溶解性增强，从而导致多样的生物活性。
下载：下载高分辨率图像（789KB）
下载：下载全尺寸图像
图2. (A) 不同放大倍数（1.00 k、2.00 k、4.00 k和8.00 k）下的PNSP扫描电子显微照片。(B) PNSP的AFM图像。左：5微米尺度的高度图像；右：3D AFM图像。(C) PNSP的TG-DSC曲线。(D) PNSP的康戈红测试。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）
3.2.5 AFM分析：使用AFM分析了多糖的纳米结构，2D和3D AFM图像如图2B所示。2D图像的分析显示存在亮区。这些区域的存在可以归因于样品制备过程中的聚合物聚集以及多糖分子之间的强相互作用[41]。如图2B所示，PNSP的高度约为11.9纳米，并表现出火焰聚集特性，这可能与PNSP的线性结构有关。许多球形和不规则的片状结构的存在表明发生了分子聚集，且PNSP的结构是分支和缠结的。P. eryngii酶残基多糖（PERP）表现出类似的纳米结构，表面粗糙，覆盖着许多不规则分布的颗粒，并具有良好的抗氧化活性[42]。
3.2.6 TG-DSC：PNSP的热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）分为三个主要阶段，如图2C所示。由于多糖中吸收的水或氢结合水的损失，PNSP在第一个阶段的重量损失约为7.8%，发生在26.9–108.8°C的温度范围内[？]。在第二降解阶段（108.9–569.1°C），多糖的分解导致重量损失在55.3%到58.0%之间。DSC表明这是多糖损失率最高的时期。最后一个重量损失阶段发生在569.1°C到806.5°C之间，质量减少可能在58.0%到81.4%之间。在这个阶段没有获得恒定的质量，因为明显有质量损失，但过程直到800°C才完成。这些结果表明PNSP经历了几乎连续的热解过程，残留物形成最少，热稳定性较低，使其成为需要在高温下彻底热降解或严格无残留条件下的应用的有希望的候选者。
3.2.7 康戈红分析：已知具有三螺旋结构的多糖样品在弱碱性条件下会与康戈红形成复合物[43]。这种相互作用通常会导致康戈红的紫外吸收发生红移。然而，如图2D所示，康戈红和与PNSP混合溶液的最大吸收波长随着碱浓度的增加而逐渐减小，没有观察到明显的红移。这些发现表明在测试的实验条件下，PNSP没有与康戈红形成复合物。此外，没有红移表明制备的PNSP样品没有表现出三螺旋结构。一些研究表明杂多糖不能形成三螺旋结构[44]，这与PNSP的单糖组成结果一致。
3.2.8 甲基化分析：在将 uronic 酸还原为相应的氘标记中性醛糖醇醋酸盐后，通过甲基化分析确定单糖连接类型。甲基化分析用于进一步推导PNSP中的糖基连接类型，如表1所示。结果表明PNSP含有六种糖基连接：Araf-(1→, →5)-Araf-(1→, →4)-Xylp-(1→, →4)-Galp-(1→, →4)-Glcp-(1→, →3,4)-Rhap-(1→, →4,6)-Manp-(1→, (1→3,6)-Manp 和 (1→)Manp。PNSP的主要连接类型为 →4)-Galp-(1→ 和 →4)-Glcp-(1→。这些发现大致与单糖组成的结果一致。
表1. PNSP甲基化产物的GC–MS分析。
甲基化糖
RT
质量片段 (m/z)
摩尔比%
连接类型
2,3,5-Me
3-Araf
11.43
44
3,7
1,87,10
1,11
7,12
9,14
5,16
16.28
Araf-(1→
2,3-Me
2-Araf
17.69
24
3,7
1,87,99,10
1,11
7,12
9,16
1,18
98.58
→5)-Araf-(1→
Arabinose
14.56
2,3-Me
2-Xylp
19.27
44
3,7
1,87,99,10
1,11
7,12
9,16
1,18
98.58
→4)-Xylp-(1→
Xylose
3.96
2,3,6-Me
3-Galp
24.34
34
3,87,99,10
1,11
3,11
7,12
9,13
1,16
1,17
3,23
34
1.00
→4)-Galp-(1→
Galactose
41.00
2,3,6-Me
3-Glcp
24.63
34
3,87,99,10
1,11
3,11
7,12
9,13
1,16
1,17
3,23
34
1.00
→4)-Glcp-(1→
Glucose
19.58
2,6-Me
2-Rhap
28.38
84
3,87,99,117,129,15
9,17
3.26
→3,4)-Rhap-(1→
Rhamnose
3.26
2,3-Me
2-Manp
30.64
84
3,71,85,87,99,10
1,11
7,127,15
9,16
1,20
18.48
→4,6)-Manp-(1→
2,3,4,6-Me
4-Manp
20.57
43,71,87,10
1,11
7,129,145,16
1,20
57.11
Man-(1→
2,4-Me
2-Manp
33.32
74
3,71,87,99,10
1,11
7,129,139,15
9,18
1.75
→3,6)-Manp-(1→
Mannose
17.35
注：→4)-Galp-(1→ 表示被还原的Gal的糖苷连接。
3.2.9 NMR光谱分析：获得1H和13C NMR光谱以进一步表征PNSP的结构。根据1D/2D NMR光谱的结果以及单糖组成和甲基化分析的结果，1H和13C化学位移被仔细分配为9种类型的糖单元，编码为A–I，如表2所示。通常，δH 4.3–5.3范围内的质子信号归因于异头质子，其中δH 4.3–4.8的信号是β-糖苷的H1，δH 4.8–5.3的信号归因于α-糖苷的H1[45]、[46]。δH 3.2–4.5范围内的质子信号归因于糖环的H2–H6。δC 98–112范围内的共振信号归因于异头碳原子，其中δC 103–106和δC 98–103的信号通常分别归因于β-糖苷和α-糖苷的C1[46]。然而，δC 65–87范围内出现的峰通常被归因于C2–C5。表2. PNSP的1H NMR和13C NMR光谱归属（ppm）。
空单元
残基
H1/C1H2/C2H3/C3H4/C4H5/C5H6/C6
参考文献
AT-α-L-阿拉伯糖（→5.07/107.05
4.18/79.17
3.90/76.69
4.10/82.32
3.69/60.46 [48], [49]
B→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→4.98/107.51
4.02/80.88
3.98/78.20
4.17/84.78
3.72/69.57 [38], [50]
C→3,4)-α-L-鼠李糖-(1→5.18/97.43
4.05/81.24
4.18/79.17
3.69/76.44
3.78/66.57
1.21/16.68 [51]
D→4)-β-D-木酮糖-(1→4.41/102.59
3.25/72.93
3.45/73.63
3.33/76.21
4.01/62.84 [52]
E→4)-β-D-葡萄糖醛酸-吡喃糖-(1→4.37/101.69
3.18/72.71
3.46/73.63
3.29/75.06
3.55/72.49
3.64/60.98 [53]
F→4)- α-D-半乳糖醛酸-吡喃糖-(1→5.01/99.29
3.89/69.09
3.74/70.89
3.97/83.86
3.45/73.63
3.79/60.44 [54]
G
β-D-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→4.63/100.14
4.01/70.03
3.83/71.85
3.87/69.11
3.90/73.11
3.46/61.60 [55]
H→3,6)-α-D-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→4.91/98.76
3.69/71.12
3.78/76.57
3.52/72.49
3.44/71.21
3.19/66.79 [56]
I→4,6)-β-D-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→4.86/100.35
3.62/74.58
3.93/73.11
4.10/82.32
3.69/69.90
3.78/66.82 [57]
图3A中的非对映质质子信号位于δH 5.07、4.98、4.91、4.86、4.52、4.51、4.41和4.37 ppm，图3B中的非对映质碳信号位于δC 107.51、107.05、104.22、102.59、101.69、101.56、101.45、100.35和98.76 ppm，表明PNSP含有9种类型的单糖残基。根据COSY（图3C）和HSQC（图3D）光谱，δ 5.07/107.05、4.98/107.51、5.18/97.43、4.41/102.59、4.37/101.69、5.01/99.29、4.63/100.14、4.91/98.76和4.86/100.35 ppm处的信号分别归属于α-L-阿拉伯糖-(1→, →5)-α-L-阿拉伯糖-(1→, →3,4)-α-L-鼠李糖-(1→, →4)-β-木酮糖-(1→, →4)-β-葡萄糖醛酸-吡喃糖-(1→, →4)-α-D-半乳糖醛酸-吡喃糖-(1→, β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→, →3,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→, →4,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→)残基的H-1/C-1 [47]。
例如，对于残基A（即α-L-阿拉伯糖-(1→, →5)），通过图3C中的COSY确定了δH/H 5.07/4.18、4.18/3.90、3.90/4.10和4.10/3.69 ppm处的交叉峰，表明δ5.07、4.18、3.90、4.10和3.69 ppm处的信号分别对应于H-1、−2、−3、−4和−5。残基A的HSQC光谱（图3D）中的碳信号可以根据COSY光谱中的交叉峰轻松归属。δH/C 5.07/107.05、4.18/79.17、3.90/76.69、4.10/82.32和3.69/60.46 ppm处的交叉峰分别对应于H-1/C-1、H-2、H-3/C-3、H-4/C-4和H-5/C-5 [48], [49]。类似地，可以推断出其他残基的信息：残基B是→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→ [38], [50]；残基C是→3,4)-α-L-鼠李糖-(1→ [51]；残基D被鉴定为→4)-β-木酮糖-(1→ [52]；残基E被鉴定为→4)-β-葡萄糖醛酸-吡喃糖-(1→ [53]；残基F被确认为→4)-α-D-半乳糖醛酸-吡喃糖-(1→ [54]；残基G、H和I分别被鉴定为β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→, →3,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→和→4,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→ [55], [56], [57]。
在确定了A–I残基的1H和13C化学位移后，分析了HMBC光谱以推断残基间的连接性（图3E）。在HMBC光谱中，A的H1（δH 5.07）与F的C4（δC 83.87）有交叉峰，表明T-α-L-阿拉伯糖-(1→4)-α-D-半乳糖醛酸-吡喃糖-(1→)之间的连接性；F的H1（δH 5.01）与I的C4（δC 82.09）有交叉峰，表明→4)-α-D-半乳糖醛酸-吡喃糖-(1→4,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→)之间的连接性；I的C1（δC100.35）与D的H4（δH 3.33）有交叉峰，表明→4,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→4)-β-木酮糖-(1→)之间的连接性；D的D1（δC 102.59）与H的H6（δH 3.16）有交叉峰，表明→4)-β-木酮糖-(1→3,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→)之间的连接性；H的H1（δH 4.91）与F的C4（δC 83.86）有交叉峰，表明3,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→4)-α-D-半乳糖醛酸-吡喃糖-(1→)之间的连接性。此外，B的H1（δH 4.98）与I的C6（δC 66.82）有交叉峰，表明→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→4,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→)之间的连接性；G的H1（δH 4.63）与B的C5（δC 69.57）有交叉峰，表明β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→)之间的连接性；E的H1（δH 4.37）与H的C3（δC 76.57）有交叉峰，表明→4)-β-葡萄糖醛酸-吡喃糖-(1→3,6)-β-甘露糖醛酸-吡喃糖-(1→4)-β-木酮糖-(1→)之间的连接性；C的C1（δC 97.23）与E的H4（δH 3.29）有交叉峰，表明→3,4)-α-L-鼠李糖-(1→4)-β-葡萄糖醛酸-吡喃糖-(1→)之间的连接性；C的C1（δC 101.54）与E的H3（δH 4.18）有交叉峰，表明→4)-β-葡萄糖醛酸-吡喃糖-(1→3,4)-α-L-鼠李糖-(1→)之间的连接性；B的H1（δH 4.98）与C的C4（δC 76.21）有交叉峰，表明→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→3,4)-α-L-鼠李糖-(1→)之间的连接性。根据NMR和甲基化结果，PNSP的 proposed 结构如图4所示。
3.3 PNSP的抗菌活性
3.3.1 测量PNSP的抗菌活性
使用平板计数法评估PNSP的抗菌活性。将浓度为5 mg/mL和10^5 CFU/mL的PNSP样品涂布在培养皿上，观察细菌存活情况。如图5A所示，PNSP在5 mg/mL浓度下对金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出明显的抗菌活性 [58]。
3.3.2 PNSP对不同浓度金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抗菌效果
通过将不同浓度的细菌悬浮液与不同浓度的PNSP一起孵育，系统地评估了PNSP的抗菌活性。研究了该多糖在1×10^5–1×10^8 CFU/mL浓度范围内对金黄色葡萄球菌的抑制效果。如图5B所示，接种了10^5和10^6 CFU/mL金黄色葡萄球菌的培养皿上没有观察到存活的菌落，表明在5 mg/mL多糖处理下细菌被完全消灭 [59], [60]。而在接种了10^8 CFU/mL金黄色葡萄球菌的培养皿上出现了少量菌落，表明在该细菌密度下多糖的抗菌效果不足。结合结构调控、绿色合成和体内验证技术，基于多糖的抗菌材料在研究和工业应用方面具有广阔的前景。
作者贡献声明：
鲍凌霄：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学设计、实验研究、概念构建。
鲍福明：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学设计、实验研究、概念构建。
孟贺：撰写——审稿与编辑、数据可视化、项目管理工作、实验研究、资金筹措、概念构建。
穆丹：撰写——审稿与编辑、数据可视化、实验研究、概念构建。
博苏丽娜：撰写——审稿与编辑、数据可视化、项目管理工作、实验研究、资金筹措、概念构建。
