孙星月|李浩然|吴长福|熊炳才|曲欣|宋晓燕|杜红霞|毛巧芝|张德清|李鹏|王定勇|埃夫根尼奥斯·阿加托克勒乌斯|马明
中国西南大学资源与环境学院，重庆400715
**摘要**
尽管空气凤梨（Tillandsia usneoides）被广泛用作大气中汞（Hg0）污染的生物监测指标，但对其剂量依赖性的生理和分子响应知之甚少。本研究整合了二十个生理生物标志物，并结合转录组学和代谢组学分析，揭示了金属螯合分配、激素效应的权衡、能量代谢调节以及膜脂质重塑在汞耐受性中的作用。我们首先确定O2·-和H2O2是敏感的损伤指标，CAT、POD、APX、MDHAR和MT是敏感的响应指标。其中，CAT和POD在广泛的浓度范围内表现出最强的抗性。进一步研究发现，在低汞剂量（5 ng·m−3）下，抗氧化和螯合防御能力得到增强，且没有明显代价。当浓度≤10 ng·m−3时，汞的结合主要由MT介导的隔离作用控制（最多可增加1035倍）。10 ng·m−3的浓度是一个临界点，在此点刺激和抑制作用共存，可能是由于代谢资源的重新分配。相比之下，较高剂量（50–500 ng·m−3）会导致ROS过度产生、细胞氧化还原平衡崩溃和膜脂质过氧化，标志着从适应到损伤的转变。多组学证据还揭示了分阶段的调控策略：在浓度≤50 ng·m−3时，萜类化合物水平升高，可能与ROS解毒有关；而在50–500 ng·m−3的暴露下，植物转向以PC为主的螯合方式（增加285–307倍），并抑制光合作用碳同化。此外，ABC转运蛋白共同介导金属硫醇复合物的运输，可能与解毒和结构防御有关。总体而言，本研究确定了调控氧化还原平衡、能量代谢和汞螯合的浓度敏感窗口，为汞解毒的潜在机制提供了新的见解。
**1. 引言**
自工业时代以来，人类活动（如化石燃料燃烧和金属开采）显著增加了全球汞（Hg）的排放。气态元素汞（Hg0）由于其持久性和长距离大气传输，对生态和健康构成广泛风险[1][2]。植被是汞的主要汇（每年2200–3600 Mg），约占大气中汞总量的40–72.0%（每年5000–5600 Mg）[1][3][4]。叶片吸收占植物总汞吸收量的约62%[5]。
生物标志物是对有毒化合物亚致死暴露的量化生物响应，可在分子、细胞和生理水平上检测到。在植物中，暴露于环境相关浓度的汞会损害光合作用，引发氧化应激并导致基因毒性损伤[6][7]。为了对抗这些毒性效应，植物进化出了多种解毒策略，包括避免金属接触[8]、螯合[9]、隔离[9]和激活抗氧化剂[7][10]。这些协调的响应反映了植物对汞诱导毒性的防御系统的复杂性。
在分子水平上，汞暴露涉及复杂的氧化还原转化和调控过程。大气中的Hg0可以被叶片组织吸收，随后通过ROS相关途径氧化为汞（II）离子Hg2+，其中过氧化氢酶（CAT）等酶通过调节细胞内氧化环境发挥关键作用[11]。这种转化与汞的运输和分布有关，由膜定位的转运蛋白（如ATP结合盒（ABC）转运蛋白和Mer超家族成员介导[7]。此外，转录组学分析表明，汞暴露会抑制与光合作用相关的途径，同时激活应激响应信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[6]。汞暴露还调节苯丙氨酸代谢和木质素生物合成，表明其在细胞壁修饰和结构适应中可能发挥作用[10]。然而，目前的知识主要来自基于土壤的汞暴露系统，植物对大气中Hg0的生理和分子响应仍知之甚少。此外，不同种类的汞在同一植物物种内可引发不同的调控响应[12][13]，这进一步强调了系统研究植物对大气中Hg0响应的必要性。
为填补这一空白，我们选择了T. usneoides作为研究对象，这是一种能够从空气中高效捕获水分和养分的附生凤梨科植物，具有出色的叶片吸收能力。该物种已被确立为汞（Hg2+）污染的生物指示物[14][15][16]，其生理生物标志物在金属暴露下表现出金属特异性和激素效应响应[17][18]。重要的是，我们之前的研究已经探讨了T. usneoides对大气中Hg0的吸收、运输和细胞内转化[9]。激素效应描述了一种双相剂量-响应关系：低剂量的有毒物质可刺激生物性能，而高剂量则产生抑制作用，最终导致不良后果。近年来，激素效应在植物和动物中得到了广泛记录，表明其广泛的生物学相关性[19][20]。这种双相响应意味着潜在的资源重新分配和相关权衡，通常表现为某些特征的增强伴随着其他特征的下降或稳定（权衡类型1/2）[21]。然而，其解毒大气中Hg0的分子和生理机制仍大部分未被探索。
我们假设大气中Hg0的暴露驱动了T. usneoides的剂量依赖性解毒响应，这种响应在生理和分子水平上通过氧化还原调节和代谢资源分配的相互作用进行协调。基于我们之前关于Hg0诱导的细胞壁增厚和结构强化的发现[9]，我们进一步提出：（i）T. usneoides具有有限的、剂量依赖性的缓冲能力，生物标志物在不同的响应范围内发挥作用，包括增强耐受性的激素效应和塑造生物可塑性；（ii）与权衡响应相关的细胞壁重塑在Hg0解毒中起关键作用，通过调控基因表达和代谢重编程实现。为了验证这些假设，我们将植物暴露于模拟实际污染情景的受控Hg0浓度下。通过结合转录组学和代谢组学分析以及20个量化生物标志物（涵盖五个功能类别），我们旨在建立T. usneoides对大气中Hg0的解毒响应谱型。
**2. 材料与方法**
2.1. 研究物种
T. usneoides目前大规模商业化种植，并通过在线市场广泛销售。实验材料为在自然光照条件下温室中生长的四年生T. usneoides。温室的平均昼夜温度为25/20°C，相对湿度为60–80%。每5–7天进行喷雾灌溉，并每3–4个月喷洒500倍稀释的代森锰锌（Stanley Group Co., Ltd., 中国），以控制由Fusarium和Pythium等真菌引起的基部腐烂或叶斑病。
2.2. 汞（Hg0）暴露
本研究设置了五个大气中Hg0暴露水平：（1）0 ng·m−3（无汞空气），（2）5 ng·m−3（低汞污染）[22]，（3）10 ng·m−3（中等汞污染）[22]，（4）50 ng·m−3（中国年平均环境汞浓度限）[23]，（5）500 ng·m−3（高汞污染）[24]。暴露实验使用由高硼硅酸盐玻璃制成的Hg0暴露系统进行，体积为0.08 m³（图S1）。实验前，根据公式CHg = V1 × CHg2+ / V2计算初始Hg2+浓度，其中V1是Hg2+溶液的流速（1 mL·h−1），V2是零空气流速（3 L·min−1）。密封的暴露室两端分别连接Hg0发生器和排气处理单元。Hg0通过SnCl2溶液还原生成。连接到零空气发生器的气泵提供连续的无汞载气，以确保稳定的Hg0输送。气体在进入暴露室前由在线大气汞浓度监测系统（LUMEX RA-915+, 美国）检测。出口侧首先连接硅胶干燥管以去除水蒸气，然后连接金阱以浓缩废气中的汞。通过精确控制流速（使用双通道注射泵和安装在室两端的流量计）实现不同的Hg0浓度。
每种处理选择三株健康的T. usneoides个体，使用0.1 mg精密天平（HZ-124/85SE, Huazhi, 美国）称重。样品用去离子水彻底冲洗并在室温下风干30分钟。然后将分组后的植物悬挂在暴露室内，暴露于Hg0中15天。为防止干燥，每3天运行一次加湿器10分钟。实验室温度白天保持在25°C，夜间保持在20°C。实验从6月持续到9月，根据先前的报告，重庆夏季平均日照时间为515小时[25]，平均总太阳辐射为1476.50 MJ·m−2[26]。
2.3. 植物生物标志物分析
分析的损伤标志物包括相对电导率、过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2·-）。抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）。抗氧化物质包括氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）、脱氢抗坏血酸（DHA）和抗坏血酸（AsA）。金属螯合物质包括非蛋白质硫醇（NPTs）、植物螯合素（PCs）和金属硫蛋白（MTs）。信号分子包括一氧化氮（NO）、水杨酸（SA）和脯氨酸（Pro）。测定方法详见补充信息（Text S1）。
2.4. 转录组学分析
使用RNA测序（RNA-Seq）来表征T. usneoides叶片在不同大气Hg0暴露水平下的基因表达变化。从无Hg0（CK）和暴露于50或500 ng·m−3 Hg0的植物中收集叶片组织（每种处理三个生物学重复，每个样本0.5 g）。样品立即在液氮中冷冻并储存待分析。高通量测序在Illumina平台上进行（上海个人生物技术有限公司，上海，中国）。
为了识别T. usneoides对Hg0的转录响应，系统分析了这些处理的转录组。将|log2 FoldChange| > 1且p < 0.05的基因/转录本定义为差异表达基因（DEGs）。使用Gene Ontology（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行功能注释和富集分析。详细的数据处理和分析程序见Text S2。原始测序数据已存放在NCBI数据库（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/）（SUB15941424）。
2.5. 代谢组学分析
收集暴露于CK、50 ng·m−3 Hg0或500 ng·m−3 Hg0 15天的T. usneoides叶片组织（n = 3），立即在液氮中冷冻。精确称取每个样本100 mg，放入2 mL离心管中，用500 μL预冷的甲醇/乙腈/水（2:2:1, v/v/v）提取，其中含有5 ppm 2-氯苯丙氨酸作为内标，然后涡旋30秒。使用高通量组织研磨机以55 Hz研磨2分钟，超声处理10分钟，然后在−20°C下孵育30分钟。混合物在4°C下以12,000 rpm离心10分钟，上清液通过0.22 μm膜过滤。最终产物转移到自动进样小瓶中，进行超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析。T. usneoides叶片提取物的代谢组谱型分析在正离子和负离子模式下进行。测量和数据分析的详细信息见Text S3。原始代谢组数据已存放在MetaboLights仓库（https://www.ebi.ac.uk/metabolights）（MTBLS13772）。
2.6. 统计分析
使用Dr Fit软件[27]根据模型拟合对每个终点的剂量-响应关系进行分类。模型分为四类：（1）单相抑制响应；（2）具有两个减少阶段的双相响应；（3）由一个减少阶段和一个增加阶段组成的双相响应；（4）多相响应。多相响应包括减少和增加阶段的组合，例如两个减少阶段加一个增加阶段，或一个减少阶段加两个增加阶段。根据赤池信息量准则（AIC）选择最佳模型，AIC值越低表示模型拟合越好。使用IBM SPSS Statistics 23.0（国际商业机器公司，美国）进行单因素方差分析（ANOVA）。显著的ANOVA后进行Fisher最小显著差异（LSD）检验。当不满足正态性和方差同质性的假设时，应用非参数Kruskal-Wallis检验。图表使用GraphPad Prism（版本9.5.1，圣地亚哥，CA，美国）和Origin 2021（OriginLab公司，美国）生成，最终布局和整合在Adobe Illustrator 2019中完成。代谢组数据的可视化使用在线平台（https://www.genescloud.cn）进行。所有处理均重复三次，数据以平均值±标准差（SD）表示。
**3. 结果**
3.1. T. usneoides叶片的生长和生理变化在不同类别的生物标志物在Hg0压力下的剂量-反应模式方面，关于损伤生物标志物，在5和50 ng·m−3的Hg0处理下，T. usneoides没有显示出任何明显的症状，而10和500 ng·m−3的处理导致T. usneoides叶片尖端轻微发黄。然而，在所有Hg0处理中，植物都没有观察到明显的死亡症状（图S2）。剂量-反应曲线的拟合结果表明，相对电导率和O2·-含量最好用单相剂量-反应模型来描述，而H2O2含量则更适合用具有增加和减少两个阶段的双相模型来描述（图1；表S4）。下载：下载高分辨率图像（620KB）下载：下载全尺寸图像图1. (a) 相对电导率，(b) O2·-，(c) H2O2含量，(d) SOD，(e) CAT，(f) POD，(g) APX，(h) MDHAR，(i) DHAR，以及(j) GR活性在T. usneoides叶片暴露于不同Hg0处理后的变化。不同的小写字母表示不同处理之间的显著差异（p < 0.05），根据Fisher的最小显著差异检验；ANOVA主效应对所有参数均显著（p < 0.05）。百分比数字显示了不同处理组之间的变化幅度。O2·-，超氧阴离子；H2O2，过氧化氢；SOD，超氧化物歧化酶；CAT，过氧化物酶；APX，抗坏血酸过氧化物酶；MDHAR，单脱氢抗坏血酸还原酶；DHAR，脱氢抗坏血酸还原酶；GR，谷胱甘肽还原酶。抗氧化酶和代谢物也显示出不同类型的剂量-反应关系。CAT、POD、DHAR和GR活性在Hg0暴露下主要表现出单相反应模式。相比之下，SOD、APX和MDHAR活性在Hg0浓度梯度上表现出具有增加和减少两个阶段的双相剂量-反应模式（图1；表S4）。T. usneoides的GSH含量符合单相剂量-反应模型，而DHA和AsA的含量则更适合用双相模型来描述，GSSG的含量更符合三相剂量-反应模型（图2；表S4）。下载：下载高分辨率图像（612KB）下载：下载全尺寸图像图2. (a) GSSG，(b) GSH，(c) DHA和(d) AsA含量，(e) NPTs，(f) PCs，以及(g) MT含量，(h) NO，(i) SA，和(j) Pro含量在T. usneoides叶片暴露于不同Hg0处理后的变化。不同的小写字母表示不同处理之间的显著差异（p < 0.05），根据Fisher的最小显著差异检验；ANOVA主效应对所有参数均显著（p < 0.05）。百分比数字显示了不同处理组之间的变化幅度。GSSG，氧化型谷胱甘肽；GSH，还原型谷胱甘肽；DHA，脱氢抗坏血酸；AsA，抗坏血酸；NPTs，非蛋白质巯基；PCs，植物螯合素；MT，金属硫蛋白；NO，一氧化氮；SA，水杨酸；Pro，脯氨酸。所有三种金属螯合化合物（NPTs、PCs、MTs）的含量最好用涉及增加和减少两个阶段的双相模型来描述（图2；表S4）。至于信号分子，NO含量随着Hg0浓度的增加而显著下降（p < 0.05），其反应最好用单相剂量-反应模型来描述。相比之下，SA和Pro含量的反应则更适合用双相模型来描述（图2；表S4）。通过传统的零假设显著性检验（ANOVA后跟进行事后比较）确定的不同类别的生物标志物的反应，在文本S4.3.1.2中有描述。Hg0压力下不同类别生物标志物之间的相关性主成分分析（PCA）显示，从所有样本中的20个生物标志物中得出的前两个主成分共同解释了总方差的59.8%。来自不同处理的样本被清晰地分开。来自CK和5 ng Hg0·m−3的样本聚集在PC2的正侧，并与抗氧化相关指标和信号分子（包括MDHAR、GR、AsA和Pro）有很强的关联。相比之下，暴露于中等Hg0浓度（10 ng·m−3）的样本聚集在PC2的负侧，并与MTs有密切关联。暴露于更高Hg0浓度（50–500 ng·m−3）的样本向PC1的正方向移动。这些样本与相对电解质、POD活性、PCs含量和GSSG水平相关（图S3）。3.2. T. usneoides叶片的转录组分析3.2.1. DEGs分析及基因表达变化在这项研究中，我们比较了CK、50 ng Hg0·m−3和500 ng Hg0·m−3组之间的上调和下调DEGs。结果显示，500/CK组中的DEGs数量明显高于50/CK组（详细信息见SI，文本S5；图3A，B）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图3. (A) Venn图和(B) 不同Hg0暴露组（CK、50和500 ng·m−3 Hg0）之间的DEGs火山图。(C) 通过STEM分析推断出的Hg0处理下的DEGs表达模式；在每个框架中，彩色线条代表所有DEGs的表达趋势（相同颜色表示相同趋势）；属于每个模式的DEGs数量标记在框架上方。在下降趋势（D）下差异表达的基因中显著富集的KEGG通路最初上升，然后变得稳定或下降（E），再上升（F）。3.2.2. DEGs的GO和KEGG功能富集分析为了研究T. usneoides在Hg0暴露下的转录变化，我们对DEGs进行了GO功能注释（图S4）。DEGs被分为三个主要的GO领域，即生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。在所有比较组中，上调基因在代谢和蛋白水解过程中富集。许多这些功能与膜运输和细胞运输有关。例如，液泡和溶酶体组分是离子和代谢物交换的关键部位，而高尔基体相关术语通常伴随货物分类和囊泡介导的运输。因此，这些上调基因的富集模式总体上指向运输相关过程的显著参与（图S4A）。相比之下，下调的DEGs主要富集在光合作用相关功能中（详细信息见SI，文本S5；图S4B）。所有在不同Hg0暴露浓度下识别的DEGs都使用Short Time-series Expression Miner（STEM）软件（卡内基梅隆大学，匹兹堡，PA，美国）进行了聚类分析。根据基因表达模式的相似性，这些DEGs被分类为16个不同的表达谱型（谱型0–15）（图3C）。结果表明，谱型0、2、3、8、11、12、13、14和15显著富集（p < 0.01），代表了三种主要的表达趋势（详细信息见SI，文本S5）。为了进一步阐明转录反应模式，对代表三种不同表达趋势的九个表达谱型中的基因进行了KEGG通路富集分析（图3D-F）。分配给下降表达谱型（谱型0、2和3）的DEGs在主要代谢通路中显著富集。这些包括光合作用、淀粉和蔗糖代谢、氨基酰-tRNA生物合成、糖胺聚糖降解、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及卟啉代谢（图3D）。对于初始增加后稳定的表达模式，谱型11和14中的DEGs在几个通路中共同富集。这些包括氧化磷酸化、倍半萜和三萜生物合成以及吞噬体通路（图3E）。相比之下，表达趋势持续增加的DEGs主要与代谢过程和遗传信息处理相关。在3.2.3. 与物质运输和光合作用相关的关键DEGsGO和KEGG富集分析显示，受Hg0影响最大的通路是与物质运输和光合作用相关的通路（图S4，3DF）。结果显示，50/CK组中的运输相关DEGs数量明显高于500/CK组（文本S5；图S5）。进一步鉴定与光合作用相关的基因发现，上调基因的数量明显低于下调基因的数量（文本S5；图S6）。3.2.4. 通过定量RT-PCR（qRT-PCR）验证DEGs为了验证RNA-Seq数据的可靠性，根据先前的研究随机选择了八个DEGs[9]。这些代表了不同的功能类别：主动运输（TRINITY_DN1077_c0_g3，TRINITY_DN1197_c7_g1）、氧化还原酶（TRINITY_DN17331_c0_g1，TRINITY_DN1149_c0_g1）、金属和金属-硫簇结合（TRINITY_DN28132_c0_g1，TRINITY_DN7132_c1_g2）以及细胞壁增厚（TRINITY_DN12199_c0_g1，TRINITY_DN909_c0_g4）。通过qRT-PCR测量的这些DEGs的相对表达趋势与RNA-Seq结果大体一致（图S7）。这证实了RNA-Seq数据的可靠性，并支持其用于后续分析。3.3. T. usneoides叶片的代谢组学分析3.3.1. 差异代谢物（DMs）的聚类分析代谢物的鉴定和分析在文本S7和图4A、S8、S9C中有详细说明。使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，VIP > 1，p < 0.05）筛选差异代谢物峰值（图S9AB），以可视化DMs的变化（图S9D）。每个组中的前十个DMs也根据它们的相对变化进行了识别（图S9D）。Venn图（图S9A）展示了不同比较组之间共享和独特的DMs，有83种代谢物在所有比较中都表现出差异表达。下载：下载高分辨率图像（729KB）下载：下载全尺寸图像图4. (A) PCA和PLS-DA模型对于不同Hg0暴露组（CK、50和500 ng·m−3 Hg0）之间识别的DMs的得分散点图。散点形状和颜色代表不同的实验组。PC1：第一主成分得分；PC2：正交主成分得分。(B) DMs的KEGG富集通路。(C) 不同处理下DMs的代谢通路分析。横坐标表示代谢通路的影响值。在50/CK比较中，共检测到531种DMs，包括331种上调和200种下调的代谢物。上调的代谢物主要包括生物碱、萜类化合物如皂苷和脂肪酸。相反，下调的代谢物包括杀菌剂（外源施用的代森锌的代谢产物）、还原型谷胱甘肽以及黄酮醇和黄酮苷类如槲皮素。在500 ng Hg0·m−3下，与对照组相比，识别出479种DMs，包括278种上调和201种下调的代谢物。氧化脂肪酸、甘油磷脂、萜类化合物和聚酮衍生物的水平显著增加，而还原型谷胱甘肽、黄酮醇和黄酮苷类显著减少。随着Hg0压力的增加，500/50比较组中下调DMs的比例更高，其中萜类化合物最为丰富，而上调DMs主要由脂肪酸和芳香族衍生物主导（图S9D）。3.3.2. DMs的KEGG富集分析Hg0暴露诱导的DMs主要富集在包括氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成、ABC转运蛋白、单酰甘油生物合成、辅因子生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、苯丙烷生物合成以及谷胱甘肽代谢的通路中（图4B）。除了这种总体富集模式外，50/CK比较组还显示出鞘脂代谢和α-亚麻酸代谢的富集。对于500/CK比较，嘧啶代谢、葡萄糖苷生物合成和赤霉素生物合成进一步富集。随着Hg0压力的增加，500 ng Hg0·m−3下的植物还显示出甜菜碱和生物碱生物合成通路的显著富集（图4C）。4. 讨论4.1. 不同类别生物标志物的敏感性和抗性作为一种专门的附生空气植物，T. usneoides能够快速有效地积累空气中的Hg2+，如先前所展示的[9]，[15]。值得注意的是，在这项研究中，即使在连续15天暴露于500 ng Hg0·m−3之后，T. usneoides也没有表现出死亡（图S2）。这些发现表明T. usneoides具有很强的抗Hg能力[9]，强调了其作为可靠Hg指示植物的地位[9]，[15]，[16]。在正常生长条件下，植物中ROS的生成和清除保持动态平衡。然而，金属压力会破坏这种平衡，导致ROS过度积累和随之而来的氧化损伤。生物标志物的变化通常与这种动态平衡和植物的应激反应策略相关。在这项研究中，Hg0暴露显著增加了T. usneoides叶片中与损伤相关的生物标志物水平，包括相对电解质泄漏、O2·-和H2O2（p < 0.05；图1），表明Hg0积累引起了氧化损伤。其中，O2·-和H2O2对Hg0压力的反应迅速，作为细胞损伤的敏感指标。植物可以通过抗氧化防御、能量代谢和激素信号通路来增强其对重金属的耐受性[7]。在这里，O2·-和H2O2的剂量依赖性增加伴随着5 ng Hg0·m−3时上游抗氧化酶（CAT、POD、APX和MDHAR）的诱导（图1）。这表明这些酶作为敏感的抗氧化生物标志物，在早期ROS解毒中起关键作用。此外，细胞能量和代谢状态影响脂质生物合成和抗氧化通路，从而调节对氧化应激的耐受性（文本S6；图1a，i-k，图）。S5) [28] 已经明确证实，半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）在许多植物中金属积累和解毒过程中起着关键作用，这归因于它们结合金属离子的能力 [29]。此外，Cys 和 GSH 还是富含硫醇的蛋白质（包括金属硫醇复合物（MTs）和过氧化物酶体（PCs）合成的前体 [30]。本研究的转录组分析显示，在暴露于逐渐增加的汞（Hg0）浓度下，表达显著上调的差异表达基因（DEGs）主要集中在 Cys 和硫代谢途径中（图 3F），这与 Cys、GSH 和 PCs 的生物合成密切相关。代谢组学分析进一步证实了谷胱甘肽代谢途径的显著富集（图 4B、6、S9D）。有趣的是，T. usneoides 的金属螯合系统表现出剂量依赖性的差异：在 ≤10 ng Hg0·m−3 的暴露下，总 PCs 水平低于对照组，而 MT 含量则显著增加（1035 倍；图 2g）。相反，在 50–500 ng Hg0·m−3 的暴露下，PCs 水平增加了 285–307 倍，而 MT 含量显著降低（p < 0.05；图 S2f）。这些结果表明，在汞暴露的早期阶段，T. usneoides 更倾向于使用基因编码的 MTs 作为快速、高亲和力的防御机制 [30]，而较少依赖酶介导的、依赖 GSH 的 PCs 生物合成途径 [31]。这可能反映了在这一阶段 GSH 被优先用于清除氧化应激反应（ROS），从而限制了 PCs 的合成底物供应，并形成了以 MTs 为主导的代谢分流模式。转录组数据还显示，许多初级和次级转运蛋白基因以及氨基酸转运蛋白的表达显著上调（图 S5），这可能与金属-配体复合物的转运有关。先前的研究表明，MTs 可以强烈结合汞，从而增强植物的耐受性，而 PCs 的合成则依赖于充足的 GSH 和代谢通量 [31]。这表明 MTs 是 T. usneoides 中汞胁迫的敏感指标。与先前的研究结果一致，对油菜（Brassica rapa）中镉耐受性基因的功能筛选显示，MTs 基因的富集程度高于 PCS 基因（图 S5）。在鉴定出的 200 个基因中，MT1、MT2a、MT2b 和 MT3 分别占 35.5%、28.5%、4.0% 和 11.3%，而 PCS1 和 PCS2 分别占 18.7% 和 2.0% [31]。
某些信号分子在增强植物抗性方面也起着重要作用。然而，在重金属胁迫下，信号分子的响应因金属类型、浓度和植物特异性特征而异，有时会促进 [10]、[32]，有时会抑制 [33]，没有一致的模式。本研究显示，在汞暴露下，一氧化氮（NO）和SA 的含量显著降低，而脯氨酸（Pro）的水平基本保持不变（图 2）。NO 的减少可能是因为其在植物防御和适应过程中被消耗，例如刺激氧化应激耐受性和调节细胞壁组成 [34]。此外，重金属可以抑制产生 NO 的酶，如硝酸还原酶（NR）。先前的研究表明，Pro 的合成由吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）催化，并需要 NADPH 作为电子供体 [35]。SA 的合成依赖于异构酸途径 [36]，其完整性与叶绿体功能密切相关 [37]。汞暴露会导致线粒体损伤，降低膜电位 [9] 并抑制光合作用 [3D、S4、S6]，从而抑制 NADPH 的生成和能量供应。
综合生物标志物测量结果（图 1、图 2）、剂量-响应建模（表 S4）和 PCA 结果（图 S3），过氧化氢酶（CAT）和过氧化物歧化酶（POD）的活性与高浓度汞（50–500 ng·m−3）处理相关。CAT 的活性随着汞浓度的升高而持续增加，而 POD 的活性在 50 ng·m−3 时线性增加，尽管在 500 ng·m−3 时有所下降，但仍显著高于 10 ng·m−3 时的水平。这表明这两种酶在 T. usneoides 对汞胁迫的抵抗中起着重要作用，可以作为耐受性的指标。
4.2 不同类别生物标志物的兴奋效应、权衡和阈值行为
生物体对胁迫的响应是复杂且多变的。三种广泛认可的响应模式包括线性无阈值（LNT）模型、阈值线性响应和兴奋效应 [19]、[38]。兴奋效应通常表现为 J 形或 U 形（或其反向形式）的剂量-响应曲线，具体取决于响应特征；兴奋效应反映了低剂量下的生物刺激（特征的增强或减少应该是生物上的积极效应）随后是抑制（生物上的负面效应）[39]。目前普遍认为，生物对胁迫的响应偶尔是单相的（线性的），但通常是多相和非线性的 [40]。本研究的结果表明，在不同汞暴露水平下，T. usneoides 的生物标志物表现出三种剂量-响应模式。单相响应（40.0%）和双相响应（55.0%）占大多数（图 S10；表 S4），表明双向效应非常普遍。当生物标志物按类型分类时，损伤指标和抗氧化酶主要表现出单相响应模式，分别占 66.7% 和 57.1%（图 S10）。相比之下，抗氧化剂（50.0%）、金属螯合化合物（100.0%）和信号分子（66.7%）表现出最高比例的双相响应，既有增加也有减少。兴奋效应背后的机制尚未完全阐明 [20]。提出的解释包括过度补偿、过度校正、DNA 损伤修复、受体介导的机制和氧化应激响应 [39]、[41]。需要注意的是，建模软件仅基于数学原理对双相兴奋效应进行分类（识别出一个增加阶段和一个减少阶段）。因此，尽管这些响应是双向的，但并非所有都符合兴奋效应的生物学定义。根据公认的生物学定义，兴奋效应是一种促进植物适应胁迫的刺激响应。在本研究中，只有抗氧化酶 APX 和 MDHAR 以及金属螯合化合物 MTs 符合真正的双相兴奋效应的标准。
有趣的是，T. usneoides 对大气中汞的剂量依赖性响应表现出四个不同的阶段：刺激阶段、兴奋效应阈值阶段、补偿阶段和失调阶段，表明其兴奋效应模式受到多阶段代谢权衡的调节。在本研究中，5 ng·m−3 的汞处理引发了低剂量刺激，维持了细胞内的氧化还原平衡。然而，在 10 ng·m−3 的暴露下观察到的现象类似于生物体暴露于亚致死水平但高于毒理学阈值的胁迫时的情况（位于兴奋效应刺激区之外）。在这种亚致死水平下，虽然会发生损伤，但其程度有限，而负面效应（权衡）超过了正面效应 [42]。这从关键防御成分（如 APX、SA 和 AsA）的下降中得到证实（图 2）。在本研究中未观察到死亡现象，表明没有达到致死浓度（LCx）；然而，10 ng·m−3 的处理导致了可见的损伤（图 S2），这是损伤的症状。这进一步表明它可能位于真正的兴奋效应刺激区之外，因为文献中没有证据表明真正的兴奋效应刺激会导致毒性症状，这表明存在组织损伤。在亚毒性但代谢需求较高的胁迫下，有限的能量和生化资源优先分配给与适应性最相关的防御途径，而不是生长或信号传导过程，而不是抗氧化系统的失败 [21]。表现出双向响应的生物标志物在 10 ng Hg0·m−3 时通常显示出拐点，表明这一浓度可能对环境风险评估和生态阈值的确定特别重要（图 S10；表 S4）。然而，需要注意的是，观察到的双向响应可能需要更精细的剂量测定（或时间依赖性测量）来确定它们是否产生生物学上的显著效应。此外，在 50 ng·m−3 时出现了补偿阶段。在这个剂量下，能量密集的过程（如萜类化合物的生物合成和金属螯合）被强烈激活，而 GSH、黄酮类化合物和几种核心代谢物则减少（图 2、S9）。这表明碳骨架和还原当量从基础抗氧化剂重新分配到膜修复。尽管存在内部代谢负担，植物仍保持了完整的表型（图 S2）。在最高浓度（500 ng·m−3）下，补偿能力被超出：ROS 水平激增，抗氧化网络开始不稳定，还原当量池耗尽，膜结构完整性下降，叶绿素缺乏重新出现（图 1、图 2、S2、S3）。这种失调阶段代表了真正的抑制效应。从保护到损伤的转变符合兴奋效应理论，表明植物具有有限的胁迫缓冲窗口。在这个窗口内，汞的毒性通过 ROS 清除、金属螯合和能量重新分配暂时得到缓解，但超过这个阈值会导致功能失衡和不可逆的细胞损伤。
4.3 综合组学响应
4.3.1 剂量依赖性响应
需要注意的是，10 ng·m−3 的值是基于连续的生理剂量-响应建模得出的过渡点，而不是一个离散的实验状态。因此，在代表性的暴露水平（0、50 和 500 ng·m−3）进行了多组学分析，以表征超阈值毒性暴露下的状态依赖性生物响应。这些水平分别代表基线状态、早期响应/过渡状态（位于建模阈值区域之上）和高压力状态，而不是直接解析每个阈值。植物可以通过调节基因表达和代谢物水平来共同减轻重金属的毒性。在本研究中，与运输相关的差异表达基因（DEGs）是最显著富集的功能途径（图 S4A）。在 50 ng·m−3 的汞处理下，与运输相关的基因（特别是编码离子转运蛋白、载体蛋白和囊泡运输组分的基因）显著上调。相比之下，在 500 ng·m−3 下，调控基因的数量显著减少。这表明，在中等到高汞胁迫下，T. usneoides 可能增强了与运输相关的过程，如囊泡运输和 ABC 转运蛋白，这可能与汞的重新分布和隔离有关。然而，在过度胁迫下，有限的能量可用性和膜损伤阻碍了这些活跃过程。这些结果支持了我们之前的观察，即在 ≤50 ng·m−3 的暴露下，T. usneoides 中的汞积累大致呈线性，但在 50–500 ng·m−3 的暴露下趋于平稳，表明 T. usneoides 在这种浓度范围内可以缓冲汞。
值得注意的是，随着汞暴露量的增加，与昼夜节律途径相关的 DEGs 显著下调（p < 0.05；图 3C）。研究表明，植物具有通过时钟调控的转录模块（CCA1/LHY/TOC1）控制气孔开闭的昼夜调节机制 [43]，以及调节水力和生理节律 [44]。最近的证据进一步表明，PHYTOCHROME-INTERACTING FACTORS（PIFs）介导了强蓝光诱导的气孔开闭响应 [45]。这间接支持了 T. usneoides 在高浓度汞暴露下优先吸收脂质的观察 [9]。本研究结合了转录组分析和非靶向代谢组学，阐明了 T. usneoides 在剂量依赖性汞胁迫下的分子响应机制，表明能量流动和膜稳态可能参与了汞响应。结果显示，轮廓 14 中的 DEGs 在 MAPK 信号通路中显著富集（图 3E），表明 MAPK 信号可能参与了与能量胁迫相关的代谢重编程，可能使代谢从生长转向能量补偿和防御相关过程。具体来说，与光合作用相关的 DEGs（包括作为碳储存成分的淀粉和蔗糖代谢）被抑制（图 S4、S6），轮廓 0、2 和 3 显示出明显的下调趋势（图 3C），这与 T. usneoides 在 500 ng·m−3 汞暴露下观察到的轻度叶绿素缺乏相符（图 S2）。在 50 ng Hg0·m−3 下，植物表现出可见损伤的暂时缓解，这可能是由于代谢资源向结构保护的转移。然而，这种补偿发生的具体机制尚不清楚，需要进一步研究。先前的研究表明，在胁迫下，植物通过减少光捕获和电子传输来主动下调碳固定，同时增强热耗散，从而限制 ROS 的积累并激活金属运输和抗氧化系统 [46]。
在 ≤50 ng·m−3 的汞暴露下，与植物-病原体相互作用、MAPK 信号以及倍半萜和三萜生物合成相关的 DEGs 显著上调（图 3E）。MAPK 级联，特别是 MPK3/MPK6，形成了一个保守的信号中心，将 ROS 信号转化为用于防御和次级代谢的转录重编程 [47]，无论是通过生物合成酶的直接转录调控，还是通过激素（如茉莉酸（JA）和 SA 途径的间接调控，这些途径调节萜类化合物的生物合成 [48]。萜类代谢物是植物化学防御的核心效应物，可作为组成型或诱导型植物毒素和挥发性信号 [49]。特别是三萜代谢物表现出极高的抗氧化能力，据报道其对 1,1-二苯基-2-吡啶基肼（DPPH）自由基的清除率高达 90% [50]。在本研究中，汞暴露导致 ROS 积累增加，从而显著增加了氧化脂肪酸的含量，包括三羟基亚油酸异构体和 18,18,18-三羟基-C18:0 酸（图 S9D），这与表型上的膜损伤一致（图 1）。有趣的是，这些化合物既作为损伤标志物也作为信号分子。据报道，能量胁迫会诱导植物中的自噬介导的膜脂质重塑 [51]。在500 ng·m−3的Hg0暴露下，T. usneoides表现出甘油磷脂的显著增加，尤其是1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱（图S9D），这一过程在多种生物体中都有很好的记录。磷脂的更新和修复通过磷脂酶（PLA/PLD）介导的水解以及通过Kennedy途径和Lands循环进行的甘油磷脂重新合成来调节[52]。最近在水稻中的功能研究表明，PLDα1在金属诱导的ROS、磷脂酶活性和磷脂重塑之间提供了直接的机制联系[53]。先前的研究已经证明，T. usneoides的细胞壁在Hg解毒中起着关键作用，表现为细胞壁厚度的增加和功能基团的结合[9]。一致地，在500 ng·m−3与50 ng·m−3处理之间，与微管动态和细胞壁生物合成相关的DEGs显著富集（图S4A）。此外，相应的代谢物显示出苯丙素途径衍生物水平的增加（图S9D）。这些发现表明，Hg暴露可能与细胞骨架的重塑有关，通过干扰能量代谢来改变对脂质过氧化的耐受性。微纤丝是细胞壁的主要承重聚合物。纤维素由纤维素合成酶复合体（CSCs）合成，在聚合过程中移动[54]。这种移动是由微纤丝聚合和结晶产生的力驱动的，方向性由皮层微管提供。因此，微管-CSC耦合的破坏可以改变纤维素的沉积和细胞壁的机械性能[55]。
4.3.2 关键代谢途径分析
通过整合代谢组学和转录组学的KEGG富集分析（图3，图4），确定了三种在Hg0压力下的关键代谢途径（图5，图6，图7）。ABC转运蛋白是能够主动跨膜转运多种底物（包括重金属）的膜整合蛋白。在这项研究中，鉴定了56个与ABC转运蛋白途径相关的DEGs。ABCB1（TRINITY_DN20097_c0_g1，TRINITY_DN15471_c0_g1，TRINITY_DN23717_c0_g1，TRINITY_DN34915_c0_g1，TRINITY_DN2269_c0_g5，TRINITY_DN36344_c0_g1，TRINITY_DN4939_c0_g2，TRINITY_DN37980_c0_g1，TRINITY_DN24132_c0_g1，TRINITY_DN11109_c0_g2，TRINITY_DN22011_c0_g1），ABCC1（TRINITY_DN29490_c0_g1）和ABCC10（TRINITY_DN2244_c0_g1）家族的成员随着Hg0浓度的增加而强烈诱导（图5）。先前的研究表明，某些B型ABC转运蛋白（ABCBs）具有广泛的底物特异性，包括苹果酸的吸收[56]，并且可以独立于PIN-FORMED（PIN）家族介导生长素的外流[57]。此外，苔藓Physcomitrium patens中的ABCB14可以通过调节角质层沉积来影响细胞壁特性，从而控制各向异性的细胞生长[58]。几个ABCC亚家族成员被公认为是植物中的核心液泡膜转运蛋白，它们主动将GSH和PC金属复合物隔离到液泡中，这是金属区室化和持续解毒的关键步骤[59]。我们之前的研究表明，在50 ng·m−3和500 ng·m−3的Hg0暴露下，T. usneoides液泡中的Hg含量分别增加了24.4%和7.30%。
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图5. 在Hg0暴露的T. usneoides中参与ABC转运蛋白途径的DEGs和DMs的表达谱。矩形中的颜色刻度表示每百万片段的片段数（FPKM）值，而圆圈中的颜色刻度表示代谢物的丰度，基因和代谢物的表达水平通过z分数进行了标准化（此后类似）。
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图6. 在Hg0暴露的T. usneoides中参与谷胱甘肽代谢途径的DEGs和DMs的表达谱。
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图7. 在Hg0暴露的T. usneoides中参与苯丙氨酸生物合成途径的DEGs和DMs的表达谱。
GSH是由γ-谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（由GSH1编码）和谷胱甘肽合成酶（由GSH2编码）催化的连续酶促反应合成的。GSH不仅能够螯合与蛋白质巯基结合的重金属离子，还能通过其巯基清除细胞内的自由基，从而增强植物对重金属的耐受性。此外，GSH还是PC的前体，PC形成的金属复合物被运输到液泡中进行解毒。本研究鉴定了83个与GSH代谢途径相关的DEGs（表S7）和3个DMs（表S8）。包括GSH1、GSH2和GCLC在内的基因在Hg0压力下显著诱导，大多数表现出上调表达（图6）。然而，相应的代谢物水平显示GSH显著下降，而在50 ng·m−3 Hg0下GSSG增加，在500 ng·m−3 Hg0下再次下降。结合观察到的PC含量显著增加（图2），这表明在高Hg0暴露下，T. usneoides经历了细胞氧化还原稳态的破坏（GSH/GSSG失衡），PC-金属螯合作用成为主要的解毒机制。光谱和电位滴定研究表明，金属-配体复合物的稳定性几乎与PC链长度成线性增加，从对GSH的微摩尔亲和力（log K7.4 = 4.8–5.93）到对PC4的飞摩尔亲和力（log K7.4 = 7.5–13.39），表明PC比GSH更有效地螯合金属[60]，[61]。此外，与谷胱甘肽S转移酶（GST）相关的DEGs最为丰富（33个基因），并且主要上调。GSTs是多功能蛋白，其功能包括：（i）解毒外源物质和细胞内的氧化分子如脂质过氧化物[62]；（ii）催化花青素生物合成[63]；以及（iii）作为次级代谢物的“载体/储存”功能，例如色素的液泡运输[64]。
苯丙素途径起源于芳香族氨基酸，由关键入口酶：苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸：CoA连接酶（4CL）催化。木质素是地球上第二丰富的聚合物，约占生物圈有机碳的30%，沉积在所有维管植物的次生细胞壁中[65]。天然木质素聚合物的三个基本单木质素单元是p-羟基苯（H）、桂酰（G）和丁香酰（S），分别来源于p-香豆醇、松油醇和芥子醇，由肉桂醇脱氢酶（CAD）催化[66]，[67]。在这项研究中，Hg0暴露显著改变了参与苯丙素途径的101个DEGs的表达（表S9）。其中，过氧化物酶基因占最大比例（36个基因），其次是17个CAD基因，还包括前体供应基因（PAL，4CL）和分支/末端途径基因（咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）），大多数都上调（图7）。相应地，代谢物分析显示苯丙氨酸、香豆酸和芥子酸的水平增加（表S10），表明前体可用性和向木质素单体生物合成的下游通量增加[68]。这些基因的协调上调和苯丙素中间体的积累表明，Hg0暴露可能促进T. usneoides细胞壁中木质素的聚合和沉积，可能增强结构刚性并提供额外的Hg隔离位点[9]。
4.3.3 综合剂量依赖性调控网络
这些发现描绘了一个剂量分段的调控网络，协调大气Hg0压力下的氧化还原稳态、螯合塑性、能量重新分配和结构防御。在低剂量刺激阶段（5 ng·m−3），快速的微管（MT）诱导和抗氧化酶（CAT，POD，APX，MDHAR）的激活以最小的代谢成本维持氧化还原平衡。超过10 ng·m−3的阈值会触发代谢权衡，将资源从生长和光合作用重新分配到防御，表现为AsA、SA和光合基因表达的下降。在补偿阶段（50 ng·m−3），MAPK信号传导整合ROS信号以上调ABC转运蛋白和萜类生物合成，用于金属-巯基运输和膜保护，而苯丙素途径的激活促进木质素沉积和细胞壁增厚。在高剂量失代偿阶段（500 ng·m−3），GSH的耗尽导致从MT向PC主导的转变，伴随着甘油磷脂的重塑和细胞骨架的调整以减轻脂质过氧化。
与大多数土壤-根系Hg2+系统中的主要以PC为中心的解毒机制不同[69]，[70]，这种附生植物中的大气Hg0暴露引发了一个明显的浓度依赖性螯合切换，在环境相关的低浓度下（≤10 ng·m−3，诱导高达1035倍），只有在更高剂量下（氧化还原平衡崩溃时）才转变为PC主导（增加285–307倍）。基于先前将T. usneoides确立为基于积累动力学和激素效应生物标志物反应的可靠大气Hg生物监测器的研究[14]，[18]，当前的多组学分析提供了对潜在调控过程的更深入的机制洞察。这个网络与地衣和苔藓中观察到的主要被动细胞外结合和有限的转录重编程不同[71]，[72]。此外，与典型的根系导向的Hg解毒模型[73]相比，这里识别的叶特异性和剂量分段的特征强调了大气生物积累器中解毒策略的暴露途径依赖性塑性。
5. 结论
本研究提供了对T. usneoides对大气Hg0暴露的剂量依赖性反应的综合性生理和多组学理解。通过测量多种类型的生理生物标志物，我们观察到多个指标中广泛的非单调剂量-反应模式。这些模式揭示了Hg0暴露下的权衡效应，拐点定义了一个以环境相关阈值浓度（10 ng·m−3）为中心的调控窗口。敏感的压力指标包括O2·-、H2O2、CAT、POD、APX、MDHAR和MT，其中CAT和POD被确定为抗性生物标志物，在广泛的Hg0浓度范围内表现出强大的耐受性。从机制上讲，Hg解毒主要在环境相关浓度（≤ 10 ng·m−3）下由MT介导的隔离控制。在更高水平的Hg0下，诱导了向PC主导的螯合转变。这种转变伴随着氧化还原稳态的破坏、光合作用碳同化的抑制和膜脂质过氧化。多组学证据进一步表明，在整个暴露梯度上，能量代谢、MAPK信号传导和膜脂质重塑的协调调控。总体而言，这些发现建立了一个剂量分段的调控框架，将金属螯合策略、氧化还原平衡和代谢分配联系起来。这一框架为T. usneoides中大气Hg0解毒的潜在机制提供了见解，推进了对大气Hg污染生物监测反应的生理解释。
CRediT作者贡献声明
孙星月：撰写——原始草稿，可视化，资源，项目管理，方法学，调查，正式分析，数据管理。
李浩然：验证，方法学。
熊炳才：验证，方法学。
曲欣：验证，方法学。
宋晓燕：验证，方法学。
杜红霞：撰写——审阅与编辑，正式分析。
毛巧枝：验证，资源，方法学。
张德清：验证，方法学。
李鹏：验证，资源，方法学。
王定勇：验证，资源，方法学。
Evgenios Agathokleous：撰写——审阅与编辑，验证，资源，项目管理，资金获取，概念化。
马明：撰写——审阅与编辑，验证，资源，项目管理，资金获取，概念化。
资助
这项工作得到了中国国家自然科学基金（42177198）；中国国家自然科学基金（32271699）；以及重庆研究生科学研究创新项目（CYB23121）的支持。资助者没有参与研究设计、数据收集、手稿准备或决定发表的机构。作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
