卡乌拉·法伊兹（Khaoula Faiz）| 查伊梅·加富利（Chaymae Ghaffouli）| 阿迪尔·鲁克巴尼（Adil Roukbani）| 穆罕默德·切巴伊比（Mohamed Chebaibi）| 穆罕默德·本姆利赫（Mohammed Benlmlih）| 布赫拉·卢阿斯特（Bouchra Louasté）
摩洛哥非斯（Fez）达尔埃尔梅拉兹（Dhar El Mehraz）大学理学院生物技术、环境、农业食品与健康实验室
**摘要**
橄榄油产业每年会产生大量的液态和固态橄榄副产品，包括收获和修剪过程中产生的叶子。这些残留物是未被充分利用的生物活性分子的重要来源。本研究重点关注从这些副产品中提取并化学表征酚类化合物。对提取物的化学分析鉴定出16种不同的酚类化合物，主要来自羟基苯甲酸、羟基肉桂酸、倍半萜类和黄酮类家族。为了评估这些提取物的功能潜力，对其抗氧化和抗菌活性进行了测试。使用四种互补的测定方法全面测定了酚类提取物的抗氧化能力：总抗氧化能力（TAC）、铁还原抗氧化能力（FRAP）、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基阳离子褪色能力。这些方法能够全面评估提取物中和自由基及减少氧化物质的能力。此外，还测试了提取物对多种病原菌的抗菌潜力。抗菌效果分别在革兰氏阴性菌（大肠杆菌K12、铜绿假单胞菌CIP 82.114和肺炎克雷伯菌CIP A22）和革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌ATCC 6633和金黄色葡萄球菌ATCC 29213）上进行了验证。抗真菌活性则针对白色念珠菌ATCC 10231、黄曲霉MTCC 9606、黑曲霉MTCC 282和尖孢镰刀菌MTCC 9913进行了评估。研究结果强调了橄榄副产品作为高价值功能性成分的潜力。本研究还探讨了结合三种副产品提取物（橄榄榨汁厂废水、橄榄渣和橄榄叶）的协同效应，以确定其组合是否能增强已报道的生物特性。结果证实，橄榄副产品中的酚类提取物是宝贵的生物活性化合物来源，为开发天然抗氧化剂和抗菌制剂提供了可能，并在食品、制药和化妆品行业具有广泛应用前景。
**1. 引言**
橄榄树（Olea europaea L.）原产于地中海地区，但在过去二十年里其种植范围已显著扩展到全球。这一全球性的扩展主要得益于人们对橄榄油健康益处的日益认识。橄榄油的益处主要归因于其中富含的单不饱和脂肪酸（MUFAs）以及多种生物活性化合物，如生育酚、类胡萝卜素、磷脂和酚类化合物[[1], [2], [3]]。
摩洛哥是地中海地区的主要橄榄生产国，约有120万公顷的土地用于橄榄种植，占全国果树种植面积的约65%。该国每年的橄榄油产量超过180万吨，主要用于烹饪[[4]]。然而，这种扩张也导致了大量橄榄副产品的产生，主要包括橄榄榨汁厂废水（液态废弃物）、橄榄渣（固态残留物）和橄榄叶。由于这些残留物含有高有机负荷和酚类化合物，若管理不当会对环境造成严重威胁[[5], [6], [7], [8]]。
研究表明，橄榄油中的酚类化合物仅占橄榄总酚类化合物的约2%，而剩余的98%都流失在榨油厂副产品中[[9,10]]。尽管这些副产品富含生物活性分子，但它们仍被忽视，通常仅被视为废物。实际上，它们是羟基酪醇和酪醇等酚类化合物的浓缩和多样化来源，这些化合物具有强大的抗氧化、抗菌和其他生物活性[[11], [12], [13], [14]]。此外，收获和压榨过程中还会产生大量橄榄叶，这些叶子通常被排除在工业流程之外。橄榄叶特别富含橄榄苦苷，这是一种具有明确生物活性的酚类糖苷，包括抗氧化和抗菌特性[[15], [16], [17], [18]]。
多项研究显示，总酚含量与抗氧化能力之间存在显著相关性，特定酚类成分与对食源性病原体的抗菌活性也存在相关性[[19], [20], [21]]。这些相关性突显了橄榄衍生酚类化合物在生物效应中的重要作用。然而，大多数现有研究仅关注单一副产品或分离出的化合物，而对不同橄榄基质组合及其生物活性成分之间的相互作用关注较少。了解不同橄榄副产品组合时的相互作用对于开发有效的天然防腐系统至关重要。
在此背景下，本研究旨在通过靶向提取富含酚类的成分来利用橄榄副产品。对提取物中的生物酚类进行了全面分析，以表征其化学组成和生物活性分子的含量，并通过多种互补测定方法评估其清除自由基的能力。同时，还测试了酚类成分对多种病原菌和真菌的抗菌潜力，以确定其作为天然抗菌剂的效力。鉴于橄榄副产品对环境的影响以及食品和制药领域对天然生物活性化合物需求的增长，此类研究至关重要。
**2. 材料与方法**
**2.1. 样品采集**
2022年12月初，从非斯-梅克内斯（Fez-Meknes）地区的橄榄榨汁厂收集了三种类型的摩洛哥皮乔林（Picholine）橄榄副产品：橄榄榨汁厂废水（OMW）、橄榄叶（OL）和橄榄渣（OP）。
将这三种副产品运送到实验室后，橄榄叶和橄榄渣在40°C下干燥成细粉，并在暗处保存备用。橄榄榨汁厂废水样品则保存在无菌瓶中，置于4°C下待分析。
**2.2. 橄榄副产品表征**
在开始多酚提取之前，对橄榄榨汁厂废水、橄榄渣和橄榄叶进行了表征。测定的参数包括水分含量、干物质含量、灰分含量、有机质含量、pH值、总多酚含量及多酚提取率。采用Rodier等人的标准方法进行表征和计算[[22]]：
- **水分含量（MC, %）**：将已知质量的样品在105°C下干燥至恒重。计算公式为：
$$MC\% = \frac{初始重量 - 干重}{初始重量} \times 100$$
- **干物质含量（DM, %）**：干燥后剩余质量的百分比：
$$DM\% = \frac{干重}{初始重量} \times 100$$
- **灰分含量（Ash, %）**：将2克干燥材料在550°C的马弗炉中焚烧至恒重。计算公式为：
$$Ash\% = \frac{灰分重量}{干重} \times 100$$
- **有机质含量（OM, %）**：总干物质减去灰分后的质量百分比：
$$OM\% = 100 - Ash$$
- **pH值**：使用校准的数字pH计（标准缓冲液pH 4和7）直接测量，固体样品需配成1:10（W/V）的蒸馏水悬浮液后进行测量。
- **多酚含量**：采用Singleton等人描述的Folin–Ciocalteu方法测定。将50 μL样品与500 μL稀释1:10（V/V）的Folin-Ciocalteu试剂混合，孵育5分钟，然后加入400 μL 7.5%（W/V）碳酸钠，继续在暗处孵育2小时。吸光度在760 nm处测量。总多酚含量以每克干物质相当的没食子酸毫克数（mg GAE/g DM）表示。校准曲线显示强线性关系（R² = 0.999，N = 3）。
**2.3. 多酚提取**
橄榄叶（OL）和橄榄渣（OP）的多酚提取采用浸渍法。将10克粉末材料加入100 mL乙酸乙酯中，在室温下搅拌72小时[[24]]。对于橄榄榨汁厂废水（OMW），则按照Romeo等人的方案进行液-液提取（略有修改）[[25]]：首先进行脱脂处理，以去除可能干扰分析的脂溶性化合物，样品用己烷（1:1, V/V）处理30分钟；然后将混合物转移到分离漏斗中分离成两相；此步骤重复三次。回收脂质相后，再用乙酸乙酯（1:2, V/V）提取多酚三次，每次45分钟。所有有机相合并后，以3000 rpm离心5分钟。乙酸乙酯在40°C下使用旋转蒸发器去除。提取率（%）计算为提取物质量与初始干物质质量的比值：
$$Yield\% = \frac{提取物质量}{初始干物质质量} \times 100$$
**2.4. 提取物混合物的设计**
本研究探讨了结合三种橄榄副产品提取物（橄榄榨汁厂废水、橄榄渣和橄榄叶）的协同效应，通过比较混合物与单一提取物的抗氧化和抗菌活性来确定是否具有增强效果。这种研究方法较少见，可能揭示出最大化橄榄副产品生物活性的新策略。
**2.5. 酚类含量和成分的评估**
**2.5.1. 总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）**
采用Folin–Ciocalteu方法测定提取物的总酚含量（TPC），结果以每克提取物干重相当的没食子酸毫克数（mg GAE/g extract）表示。总黄酮含量（TFC）则使用Shraim等人的铝氯化物（AlCl₃）比色法测定[[26]]：将500 μL样品与500 μL AlCl₃（10%, W/V）溶液混合，暗处孵育1小时，然后在420 nm处测量吸光度，结果以每克提取物干重相当的槲皮素毫克数（mg QE/g DW）表示。校准曲线显示高线性（R² = 0.999，N = 3）。
**2.5.2. 高效液相色谱-二极管阵列检测器分析（HPLC-DAD）**
酚类化合物的鉴定和定量采用Ghomari等人的方法[[27]]，使用配备反相柱的Shimadzu HPLC-DAD系统进行。分离使用两种溶剂：溶剂A为含0.2%磷酸的酸化水，溶剂B为HPLC级甲醇和乙腈的50:50（V/V）混合物。梯度洗脱过程如下：开始时A占96%，40分钟内逐渐变为50% A和50% B；随后5分钟内调整为40% A和60% B；再过15分钟调整为0% A和100% B。平衡后系统恢复初始条件。
每种提取物溶解10 mg于1 mL 80% HPLC级甲醇中，通过0.45 μm膜过滤器过滤。然后手动将20 μL样品注入Wakosil C18HG柱（4.6 × 150 mm，5 μm颗粒大小）中进行分析。分离过程在40°C下进行，流速为1 mL/min。标准酚类化合物包括单宁酸、焦性没食子酸、没食子酸、儿茶酚、羟基酪醇、咖啡酸、山柰酚、酪醇、原儿茶酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、香草酸、橄榄苦苷、芸香苷、槲皮素和迷迭香酸，在相同的色谱条件下进行了分析。化合物的鉴定是基于保留时间和紫外-可见光谱与标准品的比较。
2.6. 抗氧化活性
2.6.1. 总抗氧化能力（TAC）
提取物的总抗氧化能力（TAC）是使用Prieto等人[28]描述的氨磷钼酸盐法测定的。简要来说，将25 μL的每种提取物与含有6 M硫酸、28 mM磷酸钠和4 mM氨钼酸盐的试剂溶液混合。混合物在95°C下孵育90分钟，然后在695 nm处测量吸光度。抗坏血酸被用作参考标准，结果以每克提取物干重的抗坏血酸当量（mg AAE/g DW）表示。校准曲线显示出极好的线性（R2 = 0.999，N = 3）。
2.6.2. 铁还原抗氧化能力（FRAP测定）
提取物的铁还原抗氧化能力（FRAP）是根据Benzie和Strain[29]的方法测定的，用于确定提取物的抗氧化能力。FRAP试剂是通过混合25 mL醋酸缓冲液（300 mM，pH 3.6）、2.5 mL 10 mM TPTZ溶液（在40 mM盐酸（HCl）中）和2.5 mL 20 mM FeCl3溶液制备的。对于测定，将3 mL该试剂加入到100 μL的每种提取物中。反应混合物在黑暗中孵育30分钟，然后在593 nm处测量吸光度。使用Trolox作为标准，结果以每克提取物干重的Trolox当量（mg ET/g DW）表示。校准曲线显示出高线性（R2 = 0.999，N = 3）。
2.6.3. 2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）测定
使用Burits和Bucar[30]描述的2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）方法评估提取物的自由基清除活性。简要来说，将50 μL适当浓度的提取物与825 μL DPPH溶液（60 μM）混合。混合物在黑暗中孵育60分钟，然后在517 nm处测量吸光度。使用丁基化羟基甲苯（BHT）作为阳性对照。所有测量均重复三次。
抑制百分比（PI，%）根据以下公式计算：
\[PI\% = \(\frac{A_{\text{control}} - A_{\text{sample}}{A_{\text{control}} \times 100}\)
其中\(A_{\text{control}}\)是对照溶液的吸光度，\(A_{\text{sample}}\)是测试提取物的吸光度。
半最大抑制浓度（IC50）定义为抑制50% DPPH自由基所需的浓度，通过绘制的抑制百分比曲线来确定，以评估每个样品的清除效力。
2.6.4. 自由基阳离子脱色（ABTS测定）
使用RE等人[31]描述的2,2'-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS•+）测定法确定提取物的自由基阳离子清除能力。简要来说，通过将7 mM ABTS储备溶液与2.45 mM过硫酸钾反应生成ABTS•+自由基阳离子溶液。混合物在室温下黑暗中放置12-16小时后再使用。对于测定，将50 μL每种提取物加入到825 μL ABTS•+溶液中。反应混合物在黑暗中孵育30分钟，然后在734 nm处测量吸光度。使用Trolox作为参考抗氧化剂，所有测量均重复三次。
ABTS•+自由基的抑制百分比（PI，%）根据公式（6）计算。为了确定IC50值，基于观察到的抑制百分比评估抑制曲线。半最大抑制浓度（IC50）定义为抑制50% ABTS•+自由基所需的浓度，以评估每个提取物的抗氧化效力。
2.6.5. 协同抗氧化活性：组合指数（CI）
使用组合指数（CI）评估单个提取物及其混合物之间的相互作用，该指数基于每个提取物对抗氧化活性的贡献比例。这种方法量化了混合物的实验效果与预期加性效果之间的偏差[32]。
CI使用以下公式计算：
\[CI = \frac{E_{\text{mix}}{E_{\text{exp}}\]
其中\(E_{\text{mix}}\)是指混合物的实验抗氧化活性，\(E_{\text{exp}}\)是根据单个提取物计算出的预期抗氧化活性。
预期活性是使用根据它们在混合物中的比例计算的各个提取物效应的加权和来确定的：
\[E_{\text{exp}} = E_1 \times P_1 + E_2 \times P_2 + E_3 \times P_3\]
其中\(E_1\)、\(E_2\)和\(E_3\)是单个提取物的抗氧化活性值，\(P_1\)、\(P_2\)和\(P_3\)是它们在混合物中的相应比例。
CI值的解释如下：CI < 1表示协同效应，CI = 1表示加性效应，CI > 1表示拮抗效应。这种方法允许直接比较测量的抗氧化响应和理论预期响应，适用于不同测定中的二元和三元混合物。
2.7. 抗微生物活性
2.7.1. 微生物菌株
对抗微生物和抗真菌活性是在多种微生物菌株上评估的，包括细菌和真菌种类。细菌菌株包括五种：三种革兰氏阴性菌：大肠杆菌K12、铜绿假单胞菌CIP A22和肺炎克雷伯菌CIP A22，以及两种革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌ATCC 29213和枯草芽孢杆菌ATCC 6633。真菌菌株包括一种酵母菌株：白色念珠菌ATCC 10231，以及三种丝状真菌：黄曲霉MTCC 9606、黑曲霉MTCC 282和镰刀菌MTCC 9913。这种选择使得能够全面评估测试混合物对细菌和真菌病原体的广谱抗菌潜力。
2.7.2. 最小抑制浓度（MIC）
根据NCCLS和CLSI[33,34]的指南确定提取物对细菌或真菌菌株的最小抑制浓度（MIC）。简要来说，将Mueller-Hinton肉汤（用于细菌）或Sabouraud葡萄糖肉汤（用于真菌）分配到无菌的96孔微量滴定板中。然后加入提取物以达到所需的测试浓度，范围从0.039到10 mg/mL和0.195到50 mg/mL，使用两倍系列稀释。随后，将含有大约10^5 CFU/mL细菌细胞或真菌孢子的微生物悬浮液（对于丝状真菌为等效孢子浓度）引入每个孔中。平板在每种微生物的适当温度下孵育，根据resazurin（0.01%）作为指示剂来确定MIC。所有测定均重复三次以确保可重复性。
2.7.3. 最小杀菌浓度（MBC）和最小杀菌浓度（MFC）
在确定最小抑制浓度（MIC）后，从没有可见微生物生长的孔中无菌转移等分液（10–20 μL）到Mueller-Hinton琼脂（用于细菌）或Sabouraud葡萄糖琼脂（用于真菌），具体取决于所测试的微生物。然后将接种的平板在适当的温度和时间内孵育，直到阳性对照板中出现可见生长。最小杀菌浓度（MBC）和最小杀菌浓度（MFC）定义为在琼脂表面没有观察到可见微生物菌落的最低提取物浓度，表明微生物被完全灭活[35,36]。所有实验均重复三次以确保可重复性。
2.7.4. 混合物的协同活性（FIC指数）
为了评估三种橄榄副产品之间的协同效应，计算了分数抑制浓度指数（FICI）[37]。对于组合中的每种提取物，FIC值是通过将组合中提取物的MIC除以单独测试的提取物的MIC来确定的。然后通过将所有涉及提取物的FIC值相加得到总FICI：
\[FICI = FIC_1 + FIC_2 + FIC_3\]
其中每个组分的FIC定义如下：
\[FIC = \frac{MIC_{\text{of the component in combination}}{MIC_{\text{of the component alone}}\]
总FICI的解释允许将观察到的相互作用分类为：协同（FICI < 0.5）、加性（0.5 ≤ FICI ≤ 1.0）、中性（1.0 < FICI ≤ 2.0）或拮抗（FICI > 2.0）。这种方法适用于所有SynExt 1–10组合，以确定橄榄副产品组合对抗菌活性的整体效果。
2.8. 分子对接
2.8.1. 配体制备
通过HPLC在SynExt 1、SynExt 2和SynExt 3中鉴定出的所有植物化合物都从PubChem数据库中以SDF格式检索。使用Maestro v11.5（Schrödinger Suite, LLC）的LigPrep模块进行配体制备。使用OPLS3力场进行几何优化，以确保能量最小化和结构稳定性。对于每种化合物，在pH 7.0 ± 2.0下生成可能的离子化状态，并生成每个分子最多32个立体异构体，以考虑潜在的构象多样性[38,39]。
2.8.2. 蛋白质制备
使用以下标识符从蛋白质数据库（PDB）检索选定的目标蛋白质的三维结构：人NADPH氧化酶（PDB ID：2CDU）、大肠杆菌β-酮酰-[酰基载体蛋白]合成酶（PDB ID：1FJ4）、金黄色葡萄球菌核苷二磷酸激酶（PDB ID：3Q8U）、黑曲霉β-1,4-内葡聚糖酶（PDB ID：5I77）和白色念珠菌中的固醇14-α-脱甲基酶（CYP51）（PDB ID：5FSA）。使用Schrödinger Suite中的蛋白质制备向导准备蛋白质结构。制备过程包括添加氢原子、校正键序、去除晶体水分子、优化氢键网络、分配适当的质子化状态，并使用OPLS3力场进行能量最小化[40,41]。
2.8.3. Glide标准精度（SP）配体对接
使用Schrödinger-Maestro版本11.5中的Glide模块在标准精度（SP）模式下进行分子对接。在对接过程中，对偏离其优选顺式/反式构象的酰胺键施加了惩罚。配体原子的范德华半径缩放为0.80，部分电荷截止值为0.15，以考虑非极性相互作用。对接结果基于GlideScore进行评估，GlideScore是一个以kcal/mol表示的分子对接评分函数，用于估计配体与目标蛋白质之间的结合亲和力。GlideScore考虑了多种能量贡献，包括氢键、疏水相互作用、范德华力和静电相互作用。更负的GlideScore值表示更强和更有利的预测配体-蛋白质相互作用。对于每个配体，具有最低GlideScore值的构象被认为是最有利的结合姿势[38,42]。
2.9. 统计分析
所有实验均重复三次，结果以平均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism软件（版本9.0；GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析。使用单因素方差分析（ANOVA）评估实验组之间的差异，然后进行Tukey的事后多重比较测试。P值小于0.05被认为是统计学上显著的。
3. 结果和讨论
3.1. 橄榄副产品的表征和多酚提取产量
三种橄榄副产品（即SynExt 1（橄榄厂废水）、SynExt 2（橄榄果渣）和SynExt 3（橄榄叶）的物理化学表征显示了它们在水分含量、干物质、灰分含量、有机物、pH值、总多酚和多酚提取产量方面的明显差异（表2）。
表2. 橄榄副产品的表征和多酚提取产量。
指标 SynExt 1 SynExt 2 SynExt 3
水分含量（%） 82.18 ± 0.27 46.66 ± 1.62 40.71 ± 0.53
干物质（%） 17.82 ± 0.27 53.34 ± 1.62 59.29 ± 0.53
灰分含量（%） 17.28 ± 1.65 5.35 ± 0.23 7.34 ± 0.17
有机物（%） 82.72 ± 1.65 94.65 ± 0.23 92.66 ± 0.17
pH值 4.77 ± 0.28 5.59 ± 0.33 7.09 ± 0.33
多酚（mg GAE/g DM） 58.31 ± 0.73 11.07 ± 0.52 142.99 ± 0.52
提取产量（%） 15.44 ± 0.58 9.75 ± 0.18 10.62 ± 0.31
关于水分含量（MC）和干物质（DM），SynExt 1显示出最高的水分含量（82.18% ± 0.27%），与其作为液体废物的性质一致，而SynExt 2和SynExt 3的水分含量较低（分别为46.66% ± 1.62%和40.71% ± 0.53%），反映了果渣和叶子的固体组成。因此，干物质含量呈相反趋势，SynExt 1最低（17.82% ± 0.27%），SynExt 3最高（59.29% ± 0.53%）。这些值与文献中的橄榄副产品一致，并证实了液体和固体基质之间的预期差异[43]。
SynExt 1的灰分含量最高（17.28% ± 1.65%），可能是由于废水中矿物质浓度较高，而SynExt 2和SynExt 3的灰分含量较低（分别为5.35% ± 0.23%和7.34% ± 0.17%）。相应地，固体样品中的有机物比例最高，SynExt 2和SynExt 3分别为94.65% ± 0.23%和92.66% ± 0.17%，而SynExt 1为82.72% ± 0.27%。固体基质富含有机化合物，这是多酚和其他生物活性化合物的主要来源[44]。
pH值从SynExt 1的酸性（4.77 ± 0.28）到SynExt 3的中性（7.09 ± 0.33）不等，反映了每种基质的性质。OMW的酸性pH值可能影响多酚的稳定性和溶解度，而橄榄叶的接近中性的pH值为酚类化合物的提取提供了有利的环境。
三种橄榄副产品之间的多酚浓度有明显差异（表3）。SynExt 1（橄榄榨汁废水）表现出最高的总酚含量（TPC）值（58.31 ± 0.73 mg GAE/g DM），其次是SynExt 3（橄榄叶，29.79 ± 0.52 mg GAE/g DM）和SynExt 2（橄榄果渣，11.07 ± 0.14 mg GAE/g DM）。这一趋势突显了橄榄榨汁废水相对于干物质的强大酚类潜力，反映了亲水性酚类化合物在橄榄油提取过程中高溶解度和向水相的迁移。尽管橄榄叶传统上被认为是多酚的丰富来源，但其酚类浓度基于干物质计算仍低于橄榄榨汁废水，因为叶子中含有更高比例的结构和纤维成分[45]。橄榄果渣的TPC值最低，这与它作为提取和清洗后酚类物质耗尽的残留固体基质的特点一致[46,47]。
表3. 橄榄副产品提取物中鉴定出的酚类化合物。
| 标准 | 保留时间（分钟） | SynExt 1 | SynExt 2 | SynExt 3 |
| --- | --- | --- | --- |
| 单宁酸 | 2.93 | ND | 0.09 ± 0.00 | ND |
| 吡咯烷醇 | 3.41 | 0.38 ± 0.01a | 0.02 ± 0.00b | 0.06 ± 0.05b |
| 没食子酸 | 5.41 | 4.70 ± 0.11a | 2.25 ± 0.19b | 2.44 ± 0.00b |
| 酚醛 | 6.24 | 0.38 ± 0.09a | ND | 2.44 ± 0.00b |
| 羟基酪醇 | 7.00 | 80.46 ± 0.02a | 3.80 ± 0.01b | 1.72 ± 0.00c |
| 咖啡酸 | 8.99 | 8.79 ± 0.22a | ND | 1.68 ± 0.37b |
| 山柰酚 | 10.68 | 0.96 ± 0.00a | 0.93 ± 0.45a | 1.91 ± 0.85b |
| 酪醇 | 11.23 | 3.93 ± 0.04a | 0.45 ± 0.11b | 2.50 ± 0.02c |
| 原儿茶酸 | 12.54 | 1.05 ± 0.09a | 0.01 ± 0.00b | 0.47 ± 0.07c |
| 樟脑酸 | 13.25 | 0.39 ± 0.35a | 3.67 ± 0.01b | 0.21 ± 0.00c |
| 香豆酸 | 15.16 | 1.54 ± 0.01a | ND | 0.36 ± 0.01b |
| 香草酸 | 17.56 | 0.22 ± 0.01a | 0.12 ± 0.00b | 0.35 ± 0.09c |
| 橙皮苷 | 18.56 | 0.28 ± 0.00a | 0.05 ± 0.00b | 1.05 ± 0.21c |
| 橄榄苦苷 | 20.12 | 0.31 ± 0.08a | 0.21 ± 0.01b | 21.03 ± 0.09c |
| 芦丁 | 22.47 | 22.00 ± 0.01a | 0.03 ± 0.00b | 10.02 ± 0.94c |
| 山柰酚 | 27.49 | 3.27 ± 0.45a | 0.10 ± 0.35b | 1.30 ± 0.00c |
注：数值以平均值±标准差（mg/g提取物）表示。同一行中带有相同字母的结果根据Tukey多重范围检验在统计上没有差异（P < 0.05）。ND：未检测到。
提取物的产量在不同基质中有所不同，SynExt 1的产量最高（15.44% ± 0.58%），这可能是由于废水的液态性质有利于多酚的回收。固体基质的产量略低：果渣为9.75% ± 0.18%，叶子为10.62% ± 0.31%。
3.2. 酚类含量和谱型的评估
3.2.1. 总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）
提取物的总酚含量（TPC）和黄酮含量（TFC）如图1所示。在三种橄榄副产品提取物中，SynExt 1的酚类和黄酮含量最高，分别为717.38 ± 0.82 mg GAE/g提取物和242.18 ± 0.17 mg QE/g提取物。其次是SynExt 3（423.10 ± 1.65 mg GAE/g提取物，122.08 ± 0.34 mg QE/g提取物），然后是SynExt 2（126.79 ± 0.71 mg GAE/g提取物，55.71 ± 0.30 mg QE/g提取物）。
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图1. (a) 测试提取物的总酚含量（TPC）和 (b) 总黄酮含量（TFC）。条形图上不同的字母表示根据Tukey多重范围检验样本之间存在统计学上的显著差异（P < 0.05）。
总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）用于评估从橄榄副产品中获得的提取物中生物活性化合物的丰富程度。其中，橄榄榨汁废水提取物（SynExt 1）显示出最高的TPC和TFC值，反映了其中酚类化合物的高浓度。这些结果与先前的研究一致[48,49]。
橄榄叶也显示出较高的TPC和TFC值，这与文献中的报道一致，这些酚类丰富性主要归因于橄榄苦苷的存在[[50], [51], [52]]。相比之下，橄榄果渣的TPC和TFC水平相对较低，这与早期报告一致[53,54]，这可能是由于其木质纤维素基质限制了酚类化合物的有效提取。
3.2.2. 高效液相色谱二极管阵列检测器分析（HPLC-DAD）
HPLC-DAD分析在从橄榄榨汁废水、橄榄果渣和橄榄渣中获得的提取物中鉴定出了总共十六种化合物（表3）。其中，关键的橄榄衍生多酚羟基酪醇、酪醇和橄榄苦苷被检测到（图2）。SynExt 1特别富含羟基酪醇（80.46 ± 0.02 mg/g提取物），这是其主要化合物。还观察到了显著的酪醇浓度（3.93 ± 0.04 mg/g提取物），而橄榄苦苷的含量较少（0.31 ± 0.08 mg/g提取物）。相比之下，SynExt 3含有高水平的橄榄苦苷（21.03 ± 0.09 mg/g提取物），这是其主要化合物，以及酪醇（2.50 ± 0.02 mg/g提取物）。然而，SynExt 3中的羟基酪醇含量较低（1.72 ± 0.00 mg/g提取物）。同时，SynExt 2表现出相当高的羟基酪醇浓度（3.80 ± 0.01 mg/g提取物），但酪醇和橄榄苦苷的水平相对较低（0.45 ± 0.11 mg/g提取物和0.21 ± 0.01 mg/g提取物）。
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图2. 橄榄副产品提取物的HPLC色谱图：(A) SynExt 1，(B) SynExt 2，(C) SynExt。
关于羟基苯甲酸，所有三种提取物都含有高浓度的没食子酸，其中SynExt 1的含量最高（4.70 ± 0.11 mg/g提取物），其次是SynExt 3（2.44 ± 0.00 mg/g提取物）和SynExt 2（2.25 ± 0.19 mg/g提取物）。原儿茶酸在SynExt 1中也更为丰富（1.05 ± 0.09 mg/g提取物），而在SynExt 3和SynExt 2中的含量较低（0.47 ± 0.07 mg/g提取物和0.01 ± 0.02 mg/g提取物）。相反，香豆酸在SynExt 2中是第二主要的酚类化合物（3.67 ± 0.01 mg/g提取物），而在SynExt 1和SynExt 3中的浓度显著较低（0.39 ± 0.35 mg/g提取物和0.21 ± 0.00 mg/g提取物）。此外，香草酸主要在SynExt 3中被检测到（1.05 ± 0.21 mg/g提取物），其次是SynExt 1（0.28 ± 0.00 mg/g提取物），而在SynExt 2中的浓度较低（0.05 ± 0.00 mg/g提取物）。此外，色谱分析还揭示了三种提取物中存在几种羟基肉桂酸。SynExt 1显示出最高的咖啡酸（8.79 ± 0.22 mg/g提取物）和对香豆酸（1.54 ± 0.01 mg/g提取物）浓度，其次是SynExt 3，分别含有1.68 ± 0.37 mg/g和0.36 ± 0.01 mg/g。这两种化合物在SynExt 2中未被检测到。阿魏酸在所有样本中都被鉴定出来，但浓度相对较低，其中SynExt 3中的含量最高（0.35 ± 0.09 mg/g提取物），其次是SynExt 1（0.22 ± 0.01 mg/g提取物）和SynExt 2（0.12 ± 0.00 mg/g提取物）。
关于黄酮类化合物，鉴定出了三种主要分子山柰酚、芦丁和槲皮素。SynExt 1显示出最高的芦丁含量（22.00 ± 0.01 mg/g提取物），其次是SynExt 3（10.02 ± 0.94 mg/g提取物），而SynExt 2显示出最低的浓度（0.03 ± 0.76 mg/g提取物）。
对于槲皮素，也观察到了类似的趋势，SynExt 1中的浓度为3.27 ± 0.45 mg/g，SynExt 2中的浓度为1.30 ± 0.00 mg/g，SynExt 3中的浓度为0.10 ± 0.35 mg/g。相反，山柰酚在SynExt 3中最丰富（1.91 ± 0.85 mg/g提取物），而在SynExt 1和SynExt 2中的浓度相当（0.96 ± 0.00 mg/g提取物和0.93 ± 0.45 mg/g提取物）。
其他酚类化合物，包括单宁酸、酚醛和吡咯烷醇，也在分析的提取物中被鉴定出来。单宁酸仅在SynExt 2中被检测到（0.09 ± 0.00 mg/g提取物）。酚醛在SynExt 3中的含量为2.44 mg/g提取物，在SynExt 1中的含量为0.38 ± 0.09 mg/g提取物。最后，吡咯烷醇在所有提取物中的浓度都很低，分别为SynExt 1中的0.38 ± 0.01 mg/g，SynExt 2中的0.02 ± 0.00 mg/g，以及SynExt 3中的0.06 ± 0.18 mg/g。
我们的发现与许多先前的研究一致，这些研究确定羟基酪醇和酪醇是橄榄果渣及相关副产品中主要的酚类化合物[[55], [56], [57]]。相比之下，橄榄苦苷被确认为橄榄叶中的主要化合物[27]。除了这些主要酚类成分外，还检测到了其他几种化合物，如咖啡酸、香草酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁和槲皮素，尽管它们的含量较低。尽管这些分子的丰度相对较低，但由于它们众所周知的抗氧化、抗炎和抗菌特性，它们对提取物的整体生物活性有显著贡献[58,59]。这些化合物的多样性和互补性突显了橄榄副产品作为各种应用中有价值的天然生物活性剂的潜力。
3.3. 抗氧化活性
3.3.1. 总抗氧化能力（TAC）
总抗氧化能力结果显示，SynExt 4、8和SynExt 1表现出最高的活性，其值分别为598.61 ± 0.39、595.48 ± 0.77和569.31 ± 1.03 mg AAE/g提取物（图3（A））。其次是SynExt 10（486.64 ± 1.40 mg AAE/g提取物）、SynExt 9（461.92 ± 2.16 mg AAE/g提取物）和SynExt 7（409.57 ± 0.39 mg AAE/g提取物）。SynExt 3表现出中等的抗氧化能力（386.31 ± 0.67 mg AAE/g提取物），而SynExt 6（335.30 ± 0.00 mg AAE/g提取物）和SynExt 5（320.98 ± 0.77 mg AAE/g提取物）的活性较低。SynExt 2的抗氧化活性最低，其值为228.14 ± 1.55 mg AAE/g提取物。除了SynExt 4和SynExt 8之外，样本之间存在统计学差异。实际上，这两组之间没有显著差异（P > 0.05），表明它们的整体抗氧化能力相当。
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图3. (A) 总抗氧化活性（TAC），(B) 铁还原抗氧化能力（FRAP测定），(C) 自由基清除活性（DPPH测定），(D) 自由基清除活性（ABTS测定）。同一测试中带有不同字母的值在统计上存在差异（P < 0.05，Tukey多重范围检验）。
3.3.2. 铁还原抗氧化能力（FRAP）测定
FRAP测定表明所有提取物都具有还原能力，尽管它们的抗氧化活性存在显著差异（图3（B））。SynExt 1表现出最高的还原能力（284.73 ± 0.85 mg TE/g提取物），其次是SynExt 4（164.85 ± 0.13 mg TE/g提取物）、SynExt 8（164.24 ± 0.70 mg TE/g提取物）和SynExt 10（120.57 ± 0.87 mg TE/g提取物）。在这个组中，SynExt 4和SynExt 8之间没有统计学差异。相比之下，SynExt 3、SynExt 7、SynExt 2和SynExt 9表现出中等活性，其值分别为81.88 ± 0.24、67.53 ± 0.14、59.58 ± 0.18和47.65 ± 0.42 mg TE/g提取物。最后，SynExt 6（29.56 ± 0.49 mg TE/g提取物）和SynExt 5（27.97 ± 0.11 mg TE/g提取物）的还原能力最低。这两组之间没有统计学差异（P > 0.05）。
3.3.3. DPPH自由基清除活性
所有提取物都表现出对DPPH自由基的抗氧化活性（图3（C）。其中，SynExt 4、SynExt 8、SynExt 1、SynExt 10和SynExt 9的IC50值低于标准BHT（37.69 ± 0.15 μg/mL）。SynExt 4和SynExt 8表现出最高的活性，IC50值分别为11.24 ± 0.29和11.35 ± 0.50 μg/mL。其次是SynExt 1（13.07 ± 0.27）和SynExt 10（21.70 ± 0.82 μg/mL）。SynExt 9和SynExt 7表现出中等活性，IC50值分别为23.24 ± 0.95和30.48 ± 1.03 μg/mL。相比之下，SynExt 3、SynExt 6、SynExt 5和SynExt 2的IC50值高于BHT，分别为43.92 ± 0.19、64.45 ± 0.64和75.39 ± 0.85 μg/mL。SynExt 2的活性最低（141.11 ± 0.47 μg/mL）。各种组合之间存在统计学差异，除了SynExt 1、4和8之间无法区分，以及SynExt 9和SynExt 10之间也没有统计学差异。
3.3.4. ABTS自由基清除活性
关于对ABTS自由基的抗氧化活性（图3（D）），SynExt 4和SynExt 8的IC50值低于标准Trolox（20.53 ± 0.83 μg/mL），分别为9.99 ± 0.53和10.36 ± 0.98 μg/mL。其余提取物的IC50值高于标准。其中，SynExt 1（23.06 ± 0.54 μg/mL）、SynExt 9（25.04 ± 0.55 μg/mL）、SynExt 10（30.23 ± 0.14 μg/mL）和SynExt 2（34.32 ± 0.39 μg/mL）显示出最高的自由基清除能力。相比之下，SynExt 6（47.86 ± 0.21 μg/mL）、SynExt 5（45.88 ± 0.54 μg/mL）和SynExt 3（58.30 ± 0.97 μg/mL）的抗氧化活性最低。对于这项测试，几种组合之间没有统计学差异。因此，SynExt 2和SynExt 7、SynExt 5和SynExt 6、SynExt 4和SynExt 8以及SynExt 1和SynExt 9属于同一统计组（P > 0.05）。
多项研究已经研究了从橄榄果渣、橄榄榨汁废水和橄榄叶中提取的酚类提取物的抗氧化活性。这些副产品特别富含多酚，这些多酚因其强大的抗氧化特性而被认可。其中，羟基酪醇、酪醇和橄榄苦苷是最丰富和生物活性最强的分子。除了这些主要的多酚外，其他类别的酚类化合物，如羟基苯甲酸、羟基肉桂酸和黄酮类，也对整体抗氧化活性有显著贡献。这些化合物共同增强了提取物的抗氧化潜力。
橄榄榨汁废水提取物表现出显著的抗氧化能力，这与先前的研究一致，这些研究将这种活性归因于其中高含量的羟基酪醇，这是一种以其强还原能力而闻名的主要酚类化合物[[60], [61], [62], [63]]。然而，Gueboudji等人[64]报告的结果表明抗氧化活性高于本研究观察到的结果，这反映在显著较低的IC50值上。
关于橄榄果渣，我们的发现与De Bruno等人[65]的报告一致，这些报告强调了总黄酮在这种基质中的抗氧化活性重要性。尽管黄酮的含量低于橄榄叶或橄榄榨汁废水中的含量，但它们仍然对自由基的清除有显著贡献。对于SynExt 3，初步的体外测试显示了中等的抗氧化活性，这主要归因于其中高含量的橄榄苦苷。这一结论得到了Benincasa等人和Huguet-Casquero等人的先前研究的支持[66,67]。研究之间的差异可能是由于提取方案（溶剂类型、操作条件）以及植物基质本身的内在组成不同，而植物基质本身受到农气候条件、品种差异和技术因素的影响。
多酚通过多种机制发挥抗氧化作用。首先，它们可以清除自由基，这些高度反应性的分子可以通过氧化脂质、蛋白质和DNA来损害细胞[68,69]。其次，某些多酚可以螯合促氧化金属离子，如铁和铜，从而通过Fenton反应抑制羟基自由基的形成。最终，多酚通过减少脂质过氧化来稳定细胞膜，这一过程会促进生物结构的退化，并与多种退行性疾病有关[70]。本研究的结果表明，抗氧化效果与提取物的组合之间存在正相关关系，这表明整体抗氧化潜力得到了增强。这种协同作用基于几种互补的机制。首先，某些多酚在氧化后能够自我再生，从而延长其活性。其次，多种作用机制的多样性使得它们能够更广泛地抵御不同类型的氧化应激，因为每一类多酚都针对不同的途径[71,72]。此外，一些酚类化合物通过与主要抗氧化剂（如NADPH氧化酶和脂氧合酶）的相互作用来抑制促氧化酶，而这些酶参与了活性氧（ROS）的生成。这种酶的抑制作用有助于减少ROS的产生，进一步增强了提取物组合的整体抗氧化效果[73,74]。从橄榄副产品中提取的酚类化合物的组合已被证明是一种增强抗氧化潜力的有前景的方法。这些发现突显了它们在生物医学和农业食品领域的应用潜力，特别是在开发具有高抗氧化能力的功能性成分或膳食补充剂方面。
3.3.5 协同抗氧化活性：组合指数（CI）
为了评估橄榄油副产品提取物之间的相互作用，基于TAC、FRAP、DPPH和ABTS试验获得的抗氧化结果计算了组合指数（CI）（表4）。所得到的CI值揭示了所有配方组合（SynExt 1–10）中的重要相互作用模式，表明抗氧化活性不仅仅是单个提取物性能的总和，而是复杂的植物化学相互作用的结果。
表4. 橄榄副产品的SynExt组合指数。
样本 CI指数
CITAC FRAP DPPH ABTS
SynExt 4 1.24 0.77 0.28 0.32
SynExt 5 1.03 0.28 1.37 1.26
SynExt 6 0.86 0.26 0.62 0.99
SynExt 7 1.03 0.39 1.07 1.17
SynExt 8 1.25 0.90 0.15 0.25
SynExt 9 1.50 0.67 1.14 0.54
SynExt 10 1.19 0.85 0.33 0.78
注：协同作用（CI < 1），相加作用（CI = 1），或拮抗作用（CI > 1）。
几种混合物表现出显著的协同效应，特别是SynExt 4、SynExt 8、SynExt 9和SynExt 10，在大多数自由基清除试验中（尤其是DPPH和ABTS）的CI值低于1，表明当OMWExt与OLExt结合或三种提取物以相等比例存在时，抗氧化效率得到了提高。这些协同效应可能归因于互补的酚类谱型、改进的氢供体能力以及多种抗氧化机制的共存，这些机制在组合使用时比单独使用时更有效[75]。
相比之下，一些混合物（如SynExt 5和SynExt 7）在DPPH和ABTS试验中产生了拮抗或接近中性的CI值，这表明在特定比例下酚类化合物之间可能存在竞争或结构干扰。有趣的是，TAC和FRAP的结果倾向于显示更多的相加效应，表明还原能力和电子转移途径可能对协同作用的敏感性较低。
CI分析表明，三元组合（SynExt 10）以及主要由OMWExt（SynExt 4和SynExt 8）或OPExt-OLExt（SynExt 9）组成的二元混合物提供了最显著的协同效果。这些发现证实了提取物组合策略在增强抗氧化性能方面的潜力，并支持通过开发生物优化配方来利用橄榄油副产品的价值[76,77]。
3.4 抗微生物活性
3.4.1 抗细菌活性
橄榄油副产品提取物的抗细菌活性总结在表5中。该活性的结果显示，五种测试细菌菌株的敏感性各不相同，这反映在它们的最小抑制浓度（MIC）上。
表5. 最小抑制浓度（MIC）（mg/mL）。
样本 MIC（mg/mL）
B. subtilis S. aureus E. coli P. aeruginosa K. pneumoniae C. albicans A. niger A. flavus F. oxysporum
SynExt 1 3.12 1.56 3.12 3.12 3.12 12.5 12.5 3.12
SynExt 2 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 25 25 25
SynExt 3 3.12 3.12 6.25 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5
SynExt 4 0.78 0.39 3.12 3.12 1.56 3.12 6.25 3.12 3.12
SynExt 5 3.12 6.25 6.25 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5
SynExt 6 3.12 6.25 6.25 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5
SynExt 7 3.12 6.25 6.25 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5
SynExt 8 1.56 0.78 3.12 3.12 3.12 6.25 3.12 3.12
SynExt 9 3.12 6.25 3.12 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5
SynExt 10 3.12 6.25 3.12 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5
Gentamicyn 0.07 – – – – – – – – – –
对于革兰氏阳性细菌，Bacillus subtilis对提取物表现出明显的敏感性。最强的抑制作用见于SynExt 4（0.78 mg/mL）和SynExt 8（1.56 mg/mL），其次是SynExt 1、SynExt 3、SynExt 5、SynExt 6和SynExt 10，它们的MIC均为3.12 mg/mL。最弱的抑制作用见于SynExt 2（6.25 mg/mL）。同样，Staphylococcus aureus对所有提取物都表现出较高的敏感性。SynExt 4（0.39 mg/mL）和SynExt 8（0.78 mg/mL）显示出最高的活性，其次是SynExt 1（1.56 mg/mL）。SynExt 3、SynExt 9和SynExt 10的抑制作用适中，但无统计学差异（3.12 mg/mL），而SynExt 2、SynExt 5、SynExt 6和SynExt 7的抑制作用较弱，MIC为6.25 mg/mL（P < 0.05）。
对于革兰氏阴性细菌，SynExt 4和SynExt 8对Escherichia coli的MIC显著较低（3.12 mg/mL），而其他提取物的MIC相同（6.25 mg/mL），无统计学差异。Pseudomonas aeruginosa在所有测试的提取物中均被抑制在3.12 mg/mL，但SynExt 2的抑制作用明显较弱（6.25 mg/mL）。对于Klebsiella pneumoniae，SynExt 4表现出显著的抗菌效果（1.56 mg/mL），而SynExt 1、SynExt 3、SynExt 7、SynExt 8和SynExt 10的抑制作用较弱（3.12 mg/mL）。最低的活性见于SynExt 2、SynExt 5和SynExt 6（6.25 mg/mL），无统计学差异。
关于最小杀菌浓度（MBC），所有提取物均具有杀菌特性，其值范围为0.78至12.5 mg/mL（表6）。对于B. subtilis，SynExt 4的MBC最低（1.56 mg/mL），其次是SynExt 8（3.12 mg/mL），而其他提取物的MBC无显著差异或为6.25 mg/mL，除了SynExt 2（达到12.5 mg/mL）。对于S. aureus，SynExt 4（0.78 mg/mL）再次显示出最强的杀菌效果，其次是SynExt 8（3.12 mg/mL）。SynExt 1、SynExt 3、SynExt 5、SynExt 9和SynExt 10表现出中等活性（6.25 mg/mL），彼此之间无显著差异，而SynExt 2、SynExt 6和SynExt 7的杀菌效果最弱（12.5 mg/mL），也无显著差异。
表6. 最小杀菌浓度（MBC）和最小杀菌浓度（MFC）（mg/mL）。
样本 MBC & MFC（mg/mL）
B. subtilis S. aureus E. coli P. aeruginosa K. pneumoniae C. albicans A. niger A. flavus F. oxysporum
SynExt 1 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 25 25 3.12
SynExt 2 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 50 50
SynExt 3 6.25 6.25 6.25 6.25 12.5 25 25 25
SynExt 4 1.56 0.78 6.25 6.25 3.12 6.25 6.25 6.25
SynExt 5 6.25 6.25 12.5 12.5 12.5 25 25
SynExt 6 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5 25 25
SynExt 7 6.25 12.5 12.5 6.25 12.5 12.5 25 25
SynExt 8 3.12 3.12 6.25 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5
SynExt 9 3.12 6.25 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5
SynExt 10 3.12 6.25 3.12 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5
Gentamicyn 0.07 – – – – – – – – –
对于革兰氏阴性菌株，E. coli受SynExt 1、SynExt 3、SynExt 4和SynExt 8的影响最大，它们的MBC最低（6.25 mg/mL），彼此之间无统计学差异。其他提取物的MBC较高（12.5 mg/mL），也无显著差异。P. aeruginosa是最耐药的细菌，所有提取物的MBC均为6.25 mg/mL，但SynExt 2的MBC显著较低（12.5 mg/mL）。对于K. pneumoniae，SynExt 4再次显示出最强的杀菌效果（3.12 mg/mL），其次是SynExt 1、SynExt 3、SynExt 7、SynExt 8和SynExt 10（6.25 mg/mL），这些组之间无显著差异。活性最低的提取物是SynExt 2、SynExt 5和SynExt 6（6.25 mg/mL），无显著差异。
3.4.2 抗真菌活性
三种提取物及其组合的抗真菌活性（表5）范围为3.12至25 mg/mL。对Candida albicans的最小抑制浓度（MIC）为SynExt 1、SynExt 4和SynExt 8的3.12 mg/mL，而其他提取物的MIC为6.25 mg/mL。这清楚地表明了两组之间的区别。每组内部没有统计学差异。对于Aspergillus niger和Aspergillus flavus，最强的抑制作用见于包含SynExt 4和SynExt 8的组合，其MIC分别为6.25 mg/mL和3.12 mg/mL。相比之下，SynExt 2的抗真菌活性最弱，MIC为25 mg/mL，而其他提取物的MIC均为12.5 mg/mL。这突显了最活跃的提取物（SynExt 4和SynExt 8）与最不活跃的提取物（SynExt 2）之间的明显统计差异，以及SynExt 2与中间组之间的差异。同样，对Fusarium oxysporum的抗真菌活性最明显的是SynExt 1、SynExt 4和SynExt 8，其MIC为3.12 mg/mL。相反，SynExt 2的抑制能力最低（25 mg/mL），而其他提取物的MIC均为12.5 mg/mL，无显著差异。
表6. 对Candida albicans的最小杀菌浓度（MBC）和最小杀菌浓度（MFC）（mg/mL）。
样本 MBC & MFC（mg/mL）
B. subtilis S. aureus E. coli P. aeruginosa K. pneumoniae C. albicans A. niger A. flavus F. oxysporum
SynExt 1 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 25 25 3.12
SynExt 2 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 50 50
SynExt 3 6.25 6.25 6.25 6.25 12.5 25 25 25
SynExt 4 1.56 0.78 6.25 6.25 3.12 6.25 6.25 6.25
SynExt 5 6.25 6.25 12.5 12.5 12.5 25 25
SynExt 6 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5 25 25
SynExt 7 6.25 12.5 12.5 6.25 12.5 12.5 25 25
SynExt 8 3.12 3.12 6.25 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5
SynExt 9 6.25 6.25 6.25 12.5 12.5 12.5 12.5 25
SynExt 10 6.25 6.25 12.5 6.25 12.5 12.5 25 25
Gentamicyn 0.15 – – – – – – – –
在革兰氏阴性菌株中，E. coli受SynExt 1、SynExt 3、SynExt 4和SynExt 8的影响最大，它们的MBC最低（6.25 mg/mL），彼此之间无统计学差异。其他提取物的MBC较高（12.5 mg/mL），也无显著差异。P. aeruginosa是最耐药的细菌，所有提取物的MBC均为6.25 mg/mL，但SynExt 2的MBC显著较低（12.5 mg/mL）。对于K. pneumoniae，SynExt 4再次显示出最强的杀菌效果（3.12 mg/mL），其次是SynExt 1、SynExt 3、SynExt 7、SynExt 8和SynExt 10（6.25 mg/mL），这些组之间无显著差异。活性最低的提取物是SynExt 2、SynExt 5和SynExt 6，其MBC为12.5 mg/mL，无显著差异。
3.4.2 抗真菌活性
三种提取物及其组合的抗真菌活性范围为3.12至25 mg/mL。对Candida albicans的最小抑制浓度（MIC）为SynExt 1、SynExt 4和SynExt 8的3.12 mg/mL，而其他提取物的MIC为6.25 mg/mL。这清楚地表明了两组之间的区别。每组内部没有统计学差异。对于Aspergillus niger和Aspergillus flavus，最强的抑制作用见于包含SynExt 4和SynExt 8的组合，其MIC分别为6.25 mg/mL和3.12 mg/mL。相比之下，SynExt 2的抗真菌活性最弱，MIC为25 mg/mL，而其他提取物的MIC均为12.5 mg/mL。这突显了最活跃的提取物（SynExt 4和SynExt 8）与最不活跃的提取物（SynExt 2）之间的明显统计差异，以及SynExt 2与中间组之间的差异。同样，对Fusarium oxysporum的抗真菌活性最明显的是SynExt 1、SynExt 4和SynExt 8，其MIC为3.12 mg/mL。相反，SynExt 2的抑制能力最低（25 mg/mL），而其他提取物的活性中等（12.5 mg/mL）。
表6. 对Candida albicans的最小杀菌浓度（MFC）为SynExt 1和SynExt 4的6.25 mg/mL，其他测试提取物的MFC为12.5 mg/mL。对于Aspergillus niger和Aspergillus flavus，SynExt 4的MFC最低（6.25 mg/mL），其次是SynExt 8（12.5 mg/mL）。相比之下，SynExt 1、SynExt 3、SynExt 5、SynExt 6、SynExt 7和SynExt 9的MFC为12.5 mg/mL。最低的杀菌活性见于SynExt 2，其MFC为50 mg/mL（表6）。
对来自橄榄副产品的提取物SynExt 1、SynExt 2和SynExt 3的抗微生物活性的评估表明，其效果因提取物的性质及其组合而异。结果表明，某些组合表现出比单个提取物更高的抗微生物活性，这表明这些橄榄副产品中存在的生物活性成分之间存在协同作用。这种协同作用可以归因于提取物中含有的酚类化合物的互补作用机制。已知酚类分子如羟基酪醇、橄榄苦苷和酪醇能够破坏微生物细胞膜，导致膜通透性增加和细胞内物质泄漏。同时，黄酮类化合物（包括槲皮素、芦丁和山柰酚）会干扰必需的细菌酶，抑制核酸合成，并螯合微生物代谢所需的金属离子。这些不同机制的结合使得提取物在混合使用时具有更强的抗微生物效果[[78], [79], [80]]。此外，多项研究表明，橄榄衍生多酚的抗微生物效力取决于它们的化学结构和羟基化模式，这些因素决定了它们的反应性和与微生物膜的相互作用能力。羟基酪醇和咖啡酸等酚类分子中的多个羟基基团有助于与膜蛋白和磷脂形成强氢键，从而破坏细菌和真菌的细胞壁[12,81]。因此，含有SynExt 4和SynExt 8的组合表现出更高的活性可能源于低分子量和高分子量酚类化合物的平衡组成，优化了它们通过微生物膜的渗透和细胞内作用。这一发现支持了通过协同作用增强橄榄副产品提取物抗微生物潜力的假设，使它们成为食品和制药应用中天然防腐剂或抗菌剂的候选者。
多项研究强调了橄榄副产品作为天然抗菌剂来源的潜力。橄榄厂废水中的酚类化合物，特别是羟基酪醇和橄榄苦苷，对多种病原微生物表现出强烈的抗菌活性[82]。同样，富含黄酮类和酚类成分的橄榄叶提取物也表现出显著的抗菌特性[83]。尽管橄榄渣受到的关注较少，但它仍含有大量的多酚残留物，可能在抑制细菌生长方面发挥重要作用[84]。本研究的结果强烈支持从这些副产品中提取物的组合中存在协同效应。其中，SynExt 4对所有测试菌株表现出最明显的抗菌活性，而SynExt 8也显示出显著的抑制效果。其他几种组合的抗微生物性能也优于单个提取物，这证实了先前的观察结果，即整个提取物通常比其分离成分具有更高的生物活性，这是由于植物化学成分之间的协同作用[85]。在这方面，Liu强调水果和蔬菜的生物活性主要源于其植物化学成分之间的协同作用，这些成分共同促进了它们的健康促进效果[86]。先前的研究还表明，橄榄基质中的生物活性化合物（如橄榄苦苷、羟基酪醇和脂肪醛）对多种细菌和真菌具有抑制作用，表明它们可以作为天然食品防腐剂或综合抗菌策略的组成部分[87]。特别是橄榄苦苷已被证明可以抑制包括Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Salmonella typhimurium在内的多种病原细菌的生长[88]。某些提取物组合中的协同效应可能归因于多种机制。首先，生物活性分子之间的相互作用可能增强细菌膜的通透性，从而促进抗菌剂的进入和效果[89]。此外，同时干扰多个必需的微生物途径可能阻碍抗性的发展[90]。正如Lu等人所强调的，结合天然抗菌化合物通常可以增强对细菌生物膜的抑制，从而减少感染的持续性和毒性[91]。
总体而言，这些结果强调了橄榄副产品提取物作为天然抗菌剂来源的潜力。需要进一步的研究来确定最有效的协同组合，并在分子水平上阐明其作用机制。值得注意的是，SynExt 1富含羟基酪醇（提取物中含量为80.46毫克/克），但欧莱欧佩林的含量较低（提取物中含量为0.31毫克/克），而SynExt 3则含有高水平的欧莱欧佩林（提取物中含量为21.03毫克/克）。另一方面，SynExt 2的特点是含有较高的丁香酸浓度（提取物中含量为3.67毫克/克），这与SynExt 1和SynExt 3中的较低含量形成对比（表2）。这些成分差异支持了这样的假设：将这些提取物结合使用可以产生比单独使用任何一种提取物更强的抗菌效果。
3.4.3. 协同抗菌活性：分数抑制浓度指数（FICI）
通过分数抑制浓度指数（FIC指数）分析研究了OMWExt、OPExt和OLExt之间的抗菌相互作用（表7）。在所有混合物中，SynExt 4表现出最有希望的协同作用，对金黄色葡萄球菌具有协同作用（FIC = 0.44），并对枯草芽孢杆菌和黄曲霉具有叠加效应（FIC = 0.62）。其他所有组合被归类为中性（1.00 ≤ FIC ≤ 2.00）或拮抗（FIC > 2.00）。在SynExt 5和SynExt 6中观察到对所有测试微生物的强烈拮抗作用，FIC值介于2.50到7.01之间。二元组合（SynExt 7–9）和平衡的三元混合物（SynExt 10）没有显示出协同作用的迹象。这些发现表明，协同作用不仅仅是由提取物的比例混合决定的，而是由提取物的特定优势和兼容性决定的，特别是在富含OMW的SynExt 4中。
表7. 橄榄副产品的SynExt的FIC指数。
样品 FIC指数
枯草芽孢杆菌 0.62
金黄色葡萄球菌 0.44
大肠杆菌 2.00
铜绿假单胞菌 2.50
肺炎克雷伯菌 1.25
白色念珠菌 0.62
黑曲霉 1.37
SynExt 5 2.50 7.01
4.00 2.50 5.01
4.00 2.50 2.50
SynExt 6 2.50 7.01
4.00 2.50 4.00
2.50 2.50 2.50
SynExt 7 2.00 2.00
2.00 1.00 1.00
2.00 2.00 2.00
SynExt 8 1.00 1.00
2.00 2.00 2.00
2.00 2.00 1.00
SynExt 9 2.00 2.00
2.00 1.00 2.00
2.00 2.50 3.50
注：协同作用（FIC < 0.5），叠加作用（0.5 ≤ FIC ≤ 1.0），中性（1.0 < FIC ≤ 2.0），或拮抗作用（FIC > 2.0）。
协同作用评估表明，在三元系统中高比例添加OMWExt时，能够显著增强抗菌效果。SynExt 4（含有66.6%的OMWExt）产生了有意义的交互模式，特别是对革兰氏阳性细菌（尤其是金黄色葡萄球菌）的抗菌性能得到了提升。这一观察结果支持了富含酚类的废水提取物具有更强的膜破坏作用的假设，这种作用在与其他橄榄衍生基质结合时可能会得到放大。相比之下，以OPExt和OLExt为主的混合物（SynExt 5和6）不仅未能增强抗菌效果，反而显著降低了抗菌效力，这可能是由于它们之间的竞争性或抑制性分子相互作用。这些拮抗作用可能是由于多酚成分的重叠，干扰了微生物靶点的结合或降低了活性化合物的溶解度。
二元组合中缺乏协同作用表明，三种提取物的同时存在是实现协同作用增强的必要条件。然而，平衡的三元混合物（SynExt 10）表现出拮抗作用，这证实了协同作用不是由提取物的数量决定的，而是由成分的优势和兼容性决定的。
总体而言，这些结果强调了提取物比例、化学兼容性和靶点特异性相互作用的重要性。它们还强化了OMWExt作为橄榄生物产品协同系统中增强抗菌效果的核心贡献者的潜力。研究结果表明，SynExt 4和SynExt 8在测试的组合中表现出最强的抗氧化和抗菌活性。这种性能主要归因于所研究的三种橄榄副产品（橄榄厂废水、橄榄果渣和橄榄叶）的特定组成及其生物活性化合物之间的协同作用。在SynExt 4和SynExt 8中，三种提取物的特定比例促进了关键生物活性分子的更高浓度和最佳平衡，增强了它们与微生物膜相互作用或中和自由基的能力。因此，这两种组合的优异性能可能与单一化合物无关，而是由于来自橄榄厂废水、橄榄果渣和橄榄叶的多种分子的互补酚类成分及其协同效应。
SynExt 4由66%的橄榄厂废水提取物、16%的橄榄果渣提取物和16%的橄榄叶提取物组成。这种富含简单酚类（如羟基酪醇和酪醇）的比率确保了强大的基础抗氧化活性。适量添加富含丁香酸和没食子酸的果渣提取物以及富含欧莱欧佩林和黄酮类的橄榄叶提取物，通过提供能够作用于多个生物靶点的互补化合物，进一步增强了这种效果。这种分子多样性产生了叠加和协同效应，改善了自由基的中和和微生物的抑制。
SynExt 8由50%的橄榄厂废水提取物和50%的橄榄叶提取物组成，结合了两种特别富含强亲水性酚类的来源。橄榄叶提取物中高比例的欧莱欧佩林和黄酮类显著增强了抗氧化活性。此外，橄榄厂废水中的简单酚类与橄榄叶中的复杂化合物之间的平衡结合似乎产生了最佳的协同作用，特别是在抗菌活性方面，通过增强与细菌膜的相互作用和对多种细胞机制的共同作用。
3.5. 分子对接
分子对接分析评估了所鉴定化合物的抗氧化潜力，发现它们与NADPH氧化酶具有抑制作用，Glide得分范围从-6.132到-4.496 kcal/mol。在测试的植物化学物质中，芦丁、槲皮素和丁香酸显示出对NADPH氧化酶活性位点的最强结合亲和力，Glide得分分别为-6.889、-6.587和-6.132 kcal/mol（表8）。这些结果表明，这些化合物可能作为有效的NADPH氧化酶抑制剂，有助于解释提取物观察到的抗氧化效果。此外，现有研究也证实了黄酮类和酚酸（特别是芦丁和槲皮素）对NADPH氧化酶活性的抑制作用，从而减少了活性氧（ROS）的生成。
表8. 酚类配体与不同靶受体的对接结果。
化合物 Glide得分（kcal/mol）
2CDU1 -5.484
FJ43 -6.424
Q8U5 -7.938
FSAC -3.758
-5.398
Catechol -3.957
-5.354
-6.166
-5.129
-5.741
Ferulic Acid -5.401
-6.558
-7.933
-3.697
-5.210
Gallic acid -5.878
-6.755
-10.05
-5.032
-5.636
Hydroxytyrosol -4.496
-5.913
-5.296
-4.878
-5.705
kaempferol -5.543
-5.959
-8.984
-5.257
-7.849
Oleuropein -5.364
-5.123
-6.221
-4.289
-8.161
p-Coumaric acid -5.017
-6.261
-7.678
-3.830
-5.198
Protocatechuic acid -5.576
-6.339
-7.941
-4.856
-5.590
Pyrogallol -4.566
-5.568
-6.392
-5.181
-5.676
Quercetin -6.587
-5.929
-8.991
-5.134
-7.625
Rutin -6.889
-4.837
-7.817
-6.025
-6.245
Syringic acid -6.132
-6.636
-7.916
-4.85
-5.996
Tyrosol -4.951
-5.719
-4.187
-5.048
-5.003
Vanillic acid -6.120
-6.217
-8.010
-4.852
-5.871
在抗菌活性方面，没食子酸、阿魏酸和丁香酸对大肠杆菌靶酶表现出最强的结合亲和力，Glide得分分别为-6.755、-6.558和-6.636 kcal/mol。同样，针对金黄色葡萄球菌核苷二磷酸激酶（NDK）的分子对接显示，没食子酸、槲皮素和山柰酚是最活跃的化合物，Glide得分分别为-10.05、-8.991和-8.984 kcal/mol。这些值表明配体与细菌靶点之间存在强烈且稳定的相互作用，表明它们有可能抑制参与细菌存活和毒力的关键酶功能。现有研究结果与先前的体内和体外研究一致，证实了这些酚类化合物（特别是没食子酸和槲皮素）对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的强大抗菌作用。
在抗真菌活性方面，芦丁、山柰酚和焦性没食子醇对黑曲霉的β-1,4-内葡聚糖酶表现出最高的结合亲和力，Glide得分分别为-6.025、-5.257和-5.181 kcal/mol。同样，针对致病酵母Candida albicans的甾醇14-α-脱甲基酶（CYP51）的分子对接显示，欧莱欧佩林、山柰酚和槲皮素显示出最强的相互作用，Glide得分分别为-8.161、-7.849和-7.625 kcal/mol。这些结果表明这些酚类化合物与参与细胞壁降解和麦角甾醇生物合成的关键真菌酶之间存在强烈的结合亲和力。此外，这些发现与先前的研究一致，证明了欧莱欧佩林、槲皮素和相关多酚对各种致病真菌的抗真菌潜力。
2D和3D相互作用分析显示，芦丁与NADPH氧化酶活性位点形成了四个氢键，分别与残基PHE 245、LYS 187、VAL 214和LYS 213结合，并与LYS 187形成了一个π-阳离子相互作用（图4（A）和图5（A））。
