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纳米技术被广泛认为可以改善乳腺癌的诊断，并从临床角度来看使其更加安全。使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为负对比剂（SPION-CAs）是钆基对比剂（Gd-CAs）的一个有利替代品，因为后者可能导致肾功能受损的患者出现肾源性系统性纤维化。SPION-CAs相对于Gd-CAs的主要优势在于其生物相容性，包括低细胞毒性、较长的血液循环时间以及通过自然代谢途径或通过铁氧化物的储存和降解（铁蛋白吞噬作用）有效消除。最近，涂有聚乙二醇（PEG）的超小SPION-CAs在中国获得了用于血管成像的批准。在这项工作中，我们合成了PEG涂层的SPIONs（SPION-A01），并将其与菲黑素涂层的SPIONs（SPION-C01）进行了比较，因为菲黑素是一种对铁结合位点具有高亲和力的生物寡聚体。透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）分析显示，SPION-A01的平均核心直径约为6.0纳米，SPION-C01的平均核心直径约为10.0纳米，并且预期它们具有超顺磁性行为。振动样品磁强计（VSM）测量证实了这一预测，SPION-C01的饱和磁化强度大约是SPION-A01的两倍。ζ电位测量表明样品具有良好的胶体稳定性，其中SPION-C01的稳定性高于SPION-A01。实际上，动态光散射（DLS）分析显示SPION-C01比SPION-A01更细，这与菲黑素单体单元的存在一致。体外实验，如细胞毒性、普鲁士蓝染色和TEM（在MCF-7细胞中的分析）显示，它们具有低细胞毒性，并在人类乳腺癌细胞（MCF-7）和正常成纤维细胞（McCoy）中表现出良好的摄取能力。此外，体外溶血活性测定表明两种样品均为阴性，证实了它们的血液相容性。实际上，体外MRI测量显示，横向弛豫率值（r2）（用于衡量MRI效率）对于两种样品来说是相似的，但SPION-C01的r2略高，这支持了其作为负对比剂的潜力。
**特刊**
作为ACS Applied Nano Materials特刊“生物医学成像对比剂”的一部分发表。
1. 引言
在筛查和早期诊断过程中进行可靠的监测和高质量的数据采集可以优化乳腺癌的控制。因此，人们注意到提高意识可以积极降低与此疾病相关的死亡率。(1,2)
基于钆的对比剂（Gd-CAs）在磁共振成像（MRI）中广泛使用，以提高图像对比度和诊断准确性，因为它们在T1加权图像中对实体肿瘤的信号更强。这些Gd-CAs中的游离离子可能会对肾功能受损的患者产生毒性副作用，而引入更稳定的非线性对比剂已经降低了肾源性系统性纤维化的发生率。(3−5) 此外，多项研究表明Gd在儿童大脑中的沉积概率很高，这导致FDA和EMA限制了线性开链大环Gd-CAs的使用。(6−8)
另一方面，纳米技术正在被用来寻找替代品，以改善乳腺癌的诊断及其未来的生物医学应用，使用从临床角度来看更安全的材料。基于超顺磁性氧化铁纳米颗粒的对比剂（SPION-CAs）越来越受到重视，其全球发展用于核磁共振（NMR），如T1或T2，以及治疗应用。(11,12) 两种静脉注射型SPION-CAs也获得了临床批准，分别是涂有右旋糖酐的Ferumoxides（商品名：Feridex, Endorem）和涂有羧基右旋糖酐的Ferucarbotran（商品名：Resovist）。这两种SPION后来因纯粹的经济原因被撤出市场，而不是因为它们作为MRI对比剂的效率不足。(6) 同时，另一种用于NMR的SPION-CA，称为ferumoxitol（Rienso, Feraheme），于2009年获得FDA批准，2012年获得EMA批准，在慢性肾病或肾衰竭患者的静脉铁替代治疗中显示出强大的潜力。首个用于治疗胶质母细胞瘤的商业产品NanoTherm也首次开发出来，其涂层为氨基硅烷（2011年获得EMA批准）。最近，首个USPION-CA，即涂有聚乙二醇（PEG）的MagSeeing，也上市了。(13) 它用于血管成像，并已获得中国国家药品监督管理局（NMPA）的批准。
涂有生物相容性材料的Fe3O4或γ-Fe2O3超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）可以替代Gd-CAs，用于早期癌症检测的MRI数据采集，因为它们可以减少横向弛豫时间（T2）。(14,15) SPION-CAs相对于Gd-CAs的主要优势在于其生物相容性，包括低细胞毒性、较长的血液循环时间以及通过自然代谢途径或通过铁氧化物的储存和降解（铁蛋白吞噬作用）有效消除。(6,16) 超顺磁性氧化铁纳米颗粒含有生物相容性的氧化铁核心结构。(15,17) 它们已成为研究最广泛的纳米材料之一，用于乳腺癌的靶向和筛查特性，因为它们可以在外部磁场的引导下在特定组织中积累，从而用于MRI信号的采集（弛豫T1和T2）。(18) 为了提供这种稳定性并确保增强的渗透保持效果，必须用聚合物壳层对表面进行涂层。(11,18) 已经使用多种有机和无机材料对纳米颗粒进行涂层，包括右旋糖酐、壳聚糖、聚（乙烯醇）（PVA）、硅烷，尤其是聚乙二醇（PEG）。(7) 使用聚乙二醇（PEG）或涉及PEG化的涂层工艺是最常见的方法，因为它可以减少血浆蛋白的整体吸附，降低与肝脏和免疫反应相关的蛋白质水平，并防止纳米颗粒聚集。(7,16,17) 报道了使用儿茶酚功能化PEG作为涂层材料的超小SPIONs的临床前研究，结果显示其性能优于Gd-CA Magnevist。(13) 黑色素是自然界中最丰富的天然色素，存在于各种动物、细菌、真菌、植物和微生物中，目前它是唯一已知的内源性辐射保护剂。(19) 根据生物合成途径和中间代谢物的不同，黑色素可以分为几种类型，包括由吲哚环组成的真黑色素（如5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）和5,6-二羟基吲哚（DHI），以及由酚环组成的菲黑素（如5-S-半胱氨酰-DOPA醌、苯醌乙酸和1,8-二羟基萘（DHN）黑色素）。(20−23) 菲黑素的合成是通过酪氨酸酶对L-苯丙氨酸的羟基化实现的，然后水解为L-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）。(22−24) 由于存在儿茶酚基团（由苯并噻嗪和苯并噻唑单体组成），它们可以用作SPIONs的涂层材料，作为MRI的T2负对比剂。(25) 菲黑素的生物合成使其成为具有抗氧化活性的生物寡聚体，并且是水溶性的，从而提供了必要的特性和生物相容性。(23,24,26) 金属氧化铁核心的稳定使得可以获得直径小于20纳米的纳米颗粒。(8,27) 它与水的亲和力使得磁性纳米颗粒具有良好的单分散性，可以在不同的pH值下进行调整。其与金属离子的相互作用有助于通过提供高饱和磁化强度值来稳定SPIONs。
本研究旨在评估菲黑素寡聚体涂层SPIONs在提高纳米颗粒胶体稳定性方面的潜力。这种稳定性通过物理化学特性（饱和磁化强度、核心直径）和生物实验（细胞毒性、摄取、血液相容性和横向弛豫率（r2）来评估，以比较菲黑素涂层SPIONs与聚乙二醇涂层SPIONs作为负T2对比剂的性能。
2. 方法
2.1. 材料和表征
三氯化铁（FeCl3·6(H2O），97%；二氯化铁（FeCl2），98%；氢氧化铵（NH4OH）；氢氧化钾（KOH）；3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（L-Dopa）；聚乙二醇（分子量1000 g/mol，纯度>90%）；乙醇；来自蘑菇的酪氨酸酶；l-半胱氨酸均从Sigma-Aldrich购买。红外分析使用JASCO FT/IR 4100光谱仪进行，每个样品扫描64次，分辨率4 cm–1，在基线校正范围内；背景读数使用KBr片（100 mg）。
透射电子显微镜（TEM）和选区电子衍射（SAED）图像在JEM-1011 TEM显微镜上以100 kV的加速电压拍摄。X射线粉末衍射（XRD）测量在Siemens D500衍射仪上进行。
磁化强度测量是在干燥样品上进行的，样品被压紧并固定在圆柱形支架中，使用振动样品磁强计（VSM；Model Microsense EV9）。通过改变施加的磁场从20,000 Oe（2T）到−20,000 Oe（−2T）在300 K下进行。
铁浓度使用火焰原子吸收（FAAS）光谱仪（型号PinAAcle 900T，PTAS11120701，PerkinElmer，美国）测定。热重分析在氮气氛围下进行，加热速率10 °C/min，从室温加热到900 °C，使用Shimadzu TGA-50分析仪。动态光散射（DLS）测量（每个样品12次运行）在Malvern 3000HSA Zetasizer分析仪上进行，配备633 nm波长的He/Ne激光器。MRI图像用于测量样品的横向弛豫率，在Sigma Excite 1.5T - General Electric扫描仪中进行，使用均匀的B1场。
2.2. SPION-A01和SPION-C01的合成
SPIONs通过共沉淀法合成，根据图1，分别使用聚乙二醇和菲黑素作为稳定剂来涂层PEG（SPION-A01）和菲黑素（SPION-C01），并进行了一些调整。(25) 首先，对于SPION-A01的合成，在酸性溶液中（1 M）使用1.08 g FeCl3·6(H2O）（4.0 mmol）和0.253 g FeCl2（2.0 mmol）盐，在N2下防止F2(II)的氧化。
在三个颈烧瓶中准备100 mL去离子水并加热；在搅拌下制备Fe3+和Fe2+溶液。当溶液达到90 °C时，加入pH 11的NH4OH（25% v:v）溶液以生成SPIONs，观察到由磁铁矿引起的深棕色/黑色。在另一个反应烧瓶中，逐滴加入0.022 g PEG（0.5 mmol）的水溶液以稳定这些新合成的纳米颗粒，并在搅拌下反应约1小时。产物通过磁分离洗涤，这个循环重复四次，直到上清液达到7.0。洗涤水被丢弃，然后加入5.0 mL。
之后，使用磁铁（NdFeB，B508508254N52P）沉淀SPION-A01，并用丙酮洗涤三次，以3900 rpm离心10分钟，然后冷冻并冻干以进行后续分析和物理化学表征。混合物在60 °C的烤箱中干燥过夜以获得最终粉末。为了防止磁铁矿氧化并因此转化为非磁性相，这可能会影响饱和磁化强度和核心直径的测量结果，所有粉末样品都储存在–20 °C。
菲黑素寡聚体使用改进的方法获得。(25,28) 接下来，加入0.113 g（0.5 mol）溶解在氢氧化钾（0.5 M）中的菲黑素，并反应1小时。使用与SPION-A01相同的制备程序进行另一种合成，SPION-C01，其中菲黑素作为稳定剂。随后进行标准化的后合成方法学协议以纯化样品。
2.3. SPION-A01和SPION-C01的表征
SPION-A01和SPION-C01的形态通过JEM-1011显微镜下的TEM和SAED确定。X射线衍射分析使用Siemens D500 X射线衍射仪进行，使用Cu Kα（λCu Kα = 1.5418 Å），最大电压和电流分别为40 kV和40 mA，扫描速率为1°/min，范围20至80°，步长为0.05°。ζ电位（ζ）和流体动力学直径使用Zetasizer 3000 HSA（Malvern Instruments）测量。傅里叶变换红外光谱（FTIR）（光谱二）和热重分析（Shimadzu-50）被用来确定SPIONs中存在的有机相（pheomelanin和PEG）。SPIONs的饱和磁化强度是通过使用超导量子干涉装置（型号Microsense EV9）来测定的。定性元素分析使用元素分析仪（型号：Flash EA 1112系列CHNS，品牌：Thermo Electron Corporation）来确定样品中的C、H、N和S的含量。样品中的铁浓度是通过火焰原子吸收光谱仪（FASS）（型号：PinAAcle 900T，PTAS11120701；品牌：PerkinElmer，美国）来测定的。
2.4. “幻影”的制备以及SPION-A01和SPION-C01在T2弛豫中的测量
为了评估增强对MRI信号的影响，不同Fe浓度的SPIONs的水溶液被保存在一个由琼脂凝胶组成的“幻影”中，以避免SPIONs的聚集。这个幻影有助于定位MRI信号。幻影的制备遵循了之前描述过的适应性方法（25,29）。首先制备了2.5%（w/v）的琼脂凝胶储备溶液（250毫克琼脂糖凝胶在10毫升PBS中）。然后，配制了浓度为5、10、25和50 ppm的Fe3O4 SPIONs悬浮液，并将其保存在pH 7.2的PBS中。最后，通过将160微升的储备溶液与840微升的Fe3O4 SPION悬浮液混合来形成幻影。样品由含有大约250微升的管子组成，并放置在MRI扫描仪的等中心附近，该扫描仪具有均匀的B1场，以便获取MRI图像。使用主机软件（Weasis DICOM查看器，Eclipse公共许可证 - v 1.0）对获取的图像进行可视化和分析。横向弛豫率（1/T2）是在1.5T临床MRI扫描仪中根据某些推荐的脉冲序列（如自旋-回波序列）来测量的（25）。
为了估计每个样品的横向弛豫时间（T2），在10到240毫秒的不同回波时间（TE）下获取了切片厚度为2毫米的冠状图像，重复时间为10,000毫秒，这符合之前报告的程序（25）。图像获取后，使用Weasis软件手动绘制的感兴趣区域内的图像强度值。分别计算了SPION-A01的R2（1/T2-A01）和SPION-C01的R2（1/T2-C01）作为样品中铁浓度的函数，从而根据（25,30−33）公式计算出样品的r2值：
1𝑇2(sample)=1𝑇2(control)+𝑟2[Fe]
其中1/T2(sample)是样品的横向弛豫率，1/T2(control)是对照组的横向弛豫率，r2是横向弛豫率，[Fe]是铁浓度。
2.5. SPION-A01和SPION-C01的体外细胞毒性测定
使用（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）四唑盐还原试验（MTT）和中性红摄取（NRU）方法对SPION-A01和SPION-C01进行了体外细胞毒性测定。人类乳腺癌（MCF-7）和正常成纤维细胞（McCoy）（每孔104个细胞；每板96孔）（来自巴西里约热内卢细胞库）被用于MTT试验。四唑盐试验（34）允许在细胞暴露于SPIONs后评估细胞活力。细胞汇合后，用含有血清和抗生素的完全培养基（Dulbecco改良Eagle培养基 - DMEM）溶解的纳米颗粒（0.02、0.04、0.10、0.20、0.30和0.40 mM）处理细胞。阴性对照仅接受完全培养基。处理SPIONs 24小时后，移除培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。然后，每个孔加入含有5毫克/10毫升MTT盐的新鲜培养基，并在37°C下保持2小时。在550纳米处读取数据，结果以半最大有效浓度（EC50）表示，这些数据来自三个独立实验。
NRU试验用于通过体外细胞活力试验和中性红（NR）方法研究化合物的细胞毒性效应（35）。它基于存活细胞在结合阴离子位点后能够主动将中性红染料或NRU掺入细胞质中的颗粒或液泡的能力（30）。当液泡内容物呈酸性时，液泡会呈现红色，尽管在中性pH条件下，液泡可能是棕色或橙色（30）。24小时后，我们移除所有处理并三次用PBS洗涤孔。然后，将0.004毫摩尔的NR溶液（200微升/孔）稀释在培养基中，并将每个板在标准条件下孵育2小时。孵育时间后，移除含有NR的溶液，并向孔中加入0.05 M NaH2PO4在50%乙醇中的溶液（100微升/孔）。将板均匀化并在540纳米处进行分光光度测量。
2.6. 溶血和细胞摄取
溶血试验（36,37）显示了SPIONs导致红细胞溶血的潜力。从小鼠（雌性；60天；n = 3）的下颌静脉收集血液后，使用含有抗凝剂EDTA（15%）的注射器制备血细胞悬浮液（2%），并用CaCl2（10 mM）溶解在盐水（NaCl；0.85%）中。阴性对照仅接受溶解在盐水（NaCl；0.85%）中的CaCl2。阳性对照接受用CaCl2（10 mM）溶解在盐水（NaCl；0.85%）中的Triton 100（0.2%）。最后，加入不同浓度的SPION以达到所需的最终浓度（1、5、10或25微克/毫升）。孵育（30分钟，25°C）后，所有样品都进行离心（1000转/分钟；10分钟），并将上清液转移到96孔多孔板中。然后，通过吸光度读数（540纳米）计算释放的血红蛋白和相关溶血活性。关于用于SPIONs的溶血试验的评估，溶血比率（HR）是根据公式（2）从光学密度（OD）计算得出的：
HR(%)=OD(sample)−ODnegativecontrol
ODpositivecontrol−ODnegativecontrol
×100
SPION摄取分析的评估使用普鲁士蓝染色试验（PB）进行，分为三个阶段：细胞固定阶段；用PB染色步骤；以及用醋酸奥尔辛（acetic orcein）染色步骤（38）。MCF-7细胞（每孔104个细胞；每板6孔）接受了含有纳米颗粒悬浮液（1.0微克/毫升）的培养基，并通过明场显微镜进行测量。暴露时间（4小时）后，移除培养基，并用PBS（37°C）洗涤孔两次。这个程序旨在去除未被细胞捕获的游离纳米颗粒（38）。
2.7. 用SPION-A01和SPION-C01培养的MCF-7和McCoy细胞，以及获得的TEM样品
透射电子显微镜（TEM）用于观察暴露于SPIONs（1微克/毫升；24小时）后的McCoy（图9H–I）和MCF-7（图9E,F）细胞系（每孔5 × 105个细胞；每板6孔）在DMEM培养基中的内化SPIONs（图9H–I）和MCF-7（图9E,F）。
2.8. 统计分析
细胞毒性、NRU和溶血试验数据使用ANOVA检验后进行Bonferroni检验。EC50值（仅针对细胞毒性）和其他比较使用GraphPad Prism软件（版本6.0，美国圣地亚哥）进行处理。p < 0.05的值被认为是统计学上显著的。生物实验的结果进行了三次重复（平均值 ± 标准差）。
3. 结果
在这项研究中，我们使用适应性方法合成了两种SPIONs，分别命名为SPION-A01（涂有PEG）和SPION-C01（涂有pheomelanin）（图1）（25）。它们按照8:1的化学计量比制备，对应于Fe3+和聚合物单体（PEG）以及前体（L-DOPA）。合成SPIONs后，使用TEM-100 keV确定了SPION-A01和SPION-C01的形态特征和尺寸分布；此外，SAED和XRD的结晶信息显示在图2中。
图2
图2. (A,D) SPION-A01和SPION-C01的低倍率TEM图像。(B,E) 氧化铁纳米颗粒的SAED；(C,F) 涂有PEG和pheomelanin的氧化铁核心的PXRD衍射图，衍射峰对应于尖晶石氧化铁相。
SPIONs在水介质中的稳定是生物医学应用的一个必要条件。结果显示了一定程度的单分散性，平均核心直径分别为6.2(1.7)纳米和10.3(3.0)纳米（图2A,D）。将这些结果与使用Scherrer方程的XRD分析数据（311）进行比较，估计的平均核心直径分别为6.0纳米（SPION-A01）和10.7纳米（SPION-C01），这与其他研究结果一致（40,41）。结晶结构和衍射平面通过SAED（图2B,E）和XRD（图2C,F）进行分析。XRD能够评估重叠并验证结构。此外，关于SPION相，XRD可以确定它是磁铁矿（Fe3O4），其中XRD反射峰的宽化代表了样品的纳米结晶性（42）。磁铁矿相的模式由2θ = 30.2°、35.6°、43.1°、53.7°、56.7°和62.7°的值给出，这些值分别对应于XRD平面（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440），并根据JCPDS 96-900-6921标准进行标记。使用衍射平面（311）上最强烈的峰计算了单位晶胞参数的值（43）。因此，通过SAED应用于XRD数据计算出的参数a = 8.310 Å（SPION-A01）和a = 8.340 Å（SPION-C01）与考虑磁铁矿模式的8.394 Å的值一致（44）。关于使用SAED分析获得的平面间距（311）的结果，分别为0.250纳米（SPION-A01）和0.252纳米（SPION-C01），与先前研究中记录的磁铁矿模式（0.253纳米）一致（25）。
图3A显示SPION-A01的饱和磁化强度（Ms）为27.1 emu/g，SPION-C01的饱和磁化强度为57.2 emu/g，而图3B显示了代表纳米颗粒超顺磁行为的低矫顽力曲线。通过VSM测量获得的磁铁矿的超顺磁行为表现出零滞后环（45）。纳米颗粒的平均流体动力学直径（dh）表明，合成的SPIONs可以在pH 7.4和10的缓冲溶液中保持良好的单分散性，多分散指数<0.200。在pH = 7.4时，平均流体动力学直径分别为160纳米（SPION-A01）和120纳米（SPION-C01），而在pH = 10时，平均直径分别为120纳米和110纳米。在接近生理条件（pH ≈ 7.0）时，SPION-C01显示的ζ电位为−38(0.9) mV，这与Zottis等人的结果一致（25）。
图3
图3. SPION-A01（蓝色曲线）和SPION-C01（红色曲线）的滞后环。插图显示了矫顽力场和剩磁。
结果也与Hajdú等人的研究结果一致（32），对于羧酸酯涂层的SPIONs，ζ电位为–39.5(6.8) mV。换句话说，在相同的pH下，SPION-A01显示的ζ电位为–16(1.7) mV。这种负电荷是由于SPION表面带有羟基团的PEG涂层所致，Thapa等人也报告了这一现象（−15.5(2.1) mV）（45）。这些结果表明，用pheomelanin涂层SPION的表面更有优势，因为它在接近生理条件的pH环境中能够更好地稳定ζ电位，而不是PEG提供的稳定性。
热重分析（图4）为SPION-A01（约11%）和SPION-C01（约17%）的涂层提供了额外的定量证据，两种样品的水分损失（约3.5%至4.4%）相同。结果表明，pheomelanin的涂层与构成pheomelanin的主要化学组分的质损失一致，如醌亚胺（约4.0%）和苯并噻唑和苯并噻嗪（约13%），这与早期研究的结果一致（23,25,26）。
图4
图4. 热重曲线显示了pheomelanin生物聚合物在SPION-A01和SPION-C01上的覆盖率与质量损失百分比之间的关系。
图5展示了SPION-A01（蓝线）、SPION-C01（红线）和pheomelanin（黑线）的FTIR光谱。对于SPION-A01，观察到-C–O–C醚基团在1135 cm–1处，-CH2甲基基团在1400.5 cm–1处，以及-CH平面弯曲振动在981.7 cm–1处。(40,45) 对应于Fe3O4的Fe–O伸缩带在598 cm–1处被观察到，(25,32,45,46) 而3339 cm–1处的大峰归因于PEG的羟基(O–H)。(45) 黑素原（Cys-DOPA）的FTIR光谱与其主要基团相对应，另外两个峰分别在1720和1503 cm–1处，这些峰可以分别归因于羧酸基团和含有硫的醌亚胺基团。(23,25)图5显示了PHEO（黑色）、SPION-A01（蓝色）和SPION-C01（红色）的FT-IR光谱。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片在3422 cm–1处可以看到特征性峰，这归因于羧酸和质子化儿茶酚及醌亚胺基团的-O–H伸缩。另一个特征性峰在1620 cm–1处，与醌亚胺和羧酸中存在的-C═O伸缩有关。(23−25) 这是由于1063 cm–1处的振动频率（C–O伸缩），与酚环相关，1633 cm–1处的振动频率（羧酸酯或CQC环以及含氮杂环），以及590 cm–1处的振动频率与Fe3O4的Fe–O键相关。黑素原SPIONs在1063 cm–1处显示出与酚基团相关的C═O伸缩，在1633 cm–1处显示出与含氮杂环相关的C═C伸缩。(23,25) 在3399.93 cm–1处观察到的更长的峰是由于Fe3O4和PEG纳米颗粒中存在的羟基(O–H)基团。样品中也观察到了Fe3O4，其Fe3+（Fe–O）键是磁赤铁矿（γ-Fe2O3）相的特征。(31) 光谱中显示了黑素原在SPION-C01稳定中的作用。关于寡聚体的存在和主要黑素原基团的特征，光谱在3138.85 cm–1（OH）、1621.67 cm–1（C═O）和1001 cm–1处显示出峰，这些峰分别对应于儿茶酚、羧酸和醌亚胺基团的-C═O。(23,25) 同样，在617.75 cm–1处也观察到了苯并噻唑基团的-C–S峰，这已在其他研究中得到证实。(47,48) 使用定性方法后，接着使用定量方法（分散能量光谱学EDX）对SPION-A01和SPION-C01中的铁含量进行了定量评估，以定性阐明氧（O）、铁（Fe）和硫（S）原子的百分比。发现SPION-A01和SPION-C01中的铁和氧的百分比分别为41.2%和38.55%，以及51.3%和45.8%。在两个样品中也观察到了硫的存在。这是由于使用了前体FeSO4（Fe2+盐）。然而，观察到的硫含量差异（2.2%和7.6%）是由于SPION-C01中存在硫醇和苯并噻唑基团。(47,48) 还使用FAAS测量了SPIONs的铁浓度，分别得到SPION-A01的铁浓度为48.94 ± 0.95%，SPION-C01的铁浓度为40.88 ± 0.12%。这种差异是由于用于生产SPIONs的合成方法不同所致。因此，本测试中使用的聚合物和生物寡聚体的特定性质影响了其稳定生成的铁核的能力。根据FAAS测得的铁含量，可以绘制出由于自旋-自旋松弛导致的横向弛豫率（1/T2）的信号降低效应。图6A显示，横向弛豫率与铁的摩尔浓度成线性增加（相关参数rA012 = 0.97和rC012 = 0.97），并根据方程1计算出横向弛豫率（r2）由曲线的斜率给出。我们发现PEG包覆的纳米粒子的r2–A01 = 205(19) mM–1s–1，而黑素原包覆的纳米粒子的r2–A01 = 218(20) mM–1 s–1。我们的结果略高于Feridex（33）（120 mM–1 s–1），是Supravist（SHU-55C）（57 mM–1 s–1）的四倍，与二巯基丁二酸包覆的SPIONs（49）非常相似（218 mM–1 s–1）。图6（A）显示了水溶液中磁铁矿纳米粒子的弛豫率1𝑇2(sample)−1𝑇2(control)与铁浓度的关系。曲线是线性拟合。我们根据方程1从曲线的斜率得到横向弛豫率（r2）。(B,C) 在含有PBS（pH = 7.4）的琼脂糖凝胶幻影中，不同浓度的T2信号降低情况。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片此外，使用相同合成方法并用几乎相同平均水动力直径（120 nm）的壳聚糖包覆的SPIONS（50）的横向弛豫率大约低四倍（64.31(0.03) mM–1 s–1）。如图6B,C所示，SPION-A01和SPION-C01的T2加权图像信号强度随铁浓度的变化而显著变化。此外，线粒体活性对细胞能量供应至关重要，而溶酶体活性与细胞自噬过程相关，这些活性值是在成纤维细胞（McCoy）和乳腺癌（MCF-7）细胞实验中获得的，而细胞活力则通过MTT（34）和NRU测定（35）来确定SPION-A01和SPION-C01的细胞活力。这些结果（图7和8）表明，在这两种实验中测试的SPIONs保持了细胞活力。图7（A–D）显示了SPION-A01和SPION-C01对乳腺癌细胞（MCF-7）和成纤维细胞（McCoy）的体外细胞毒性测定。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片体外细胞毒性测定结果显示细胞活力超过95%。实际上，结果表明SPION-A01和SPION-C01的细胞毒性很低。这两种纳米粒子在细胞活力方面与阴性对照组没有统计学差异。像金、铁或任何高原子序数的金属这样的无机纳米粒子如果位于肿瘤细胞内部或外部，可以通过TEM分析轻松识别，因为它们的高电子密度增强了成像对比度。(51) 考虑到我们纳米粒子的大小、形状和表面电荷，我们使用普鲁士蓝染色方法（38,39）（图9A–C）和TEM分析（图9D–I）确定了SPION-A01和SPION-C01的内化情况。这些SPIONs的内化最可能的机制是通过非特异性内吞途径，例如巨噬细胞吞噬作用，这是水动力直径大于100 nm的纳米粒子的常见机制。这一发现与我们的PEG和黑素原包覆的SPIONs一致，支持了其成功的内化。(51)图9显示了MCF-7细胞中的普鲁士蓝染色测定：(A)（对照组）；(B)（SPION-A01）和(C)（SPION-C01）。MCF-7细胞中的TEM分析：(D)（对照组）；(E)（SPION-A01）和(F)（SPION-C01）。McCoy细胞中的TEM分析：(G)（对照组）；(H)（SPION-A01）和(I)（SPION-C01）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片结果表明这些纳米粒子被摄入到了细胞内介质中（图9B,C），其中在某些MCF-7肿瘤细胞中检测到了铁颗粒的摄入（蓝色颗粒）。正如预期的那样，在对照组（图9A）中观察到PB染色较弱或没有铁颗粒。TEM分析显示了MCF-7细胞对SPION-A01（图9E）和SPION-C01（图9F）的纳米颗粒的内化和摄入。对于成纤维细胞（McCoy），根据图9H和图9I，SPION-A01的摄入是正向的。在对照组位置的MCF-7和McCoy细胞的TEM图像中未观察到氧化铁纳米颗粒的内化（图9D,G）。4. 血细胞溶解试验使用阳性和阴性对照（37）对SPION-A01和SPION-C01在体外对红细胞的血液相容性活性进行了分析，结果显示SPION-A01和SPION-C01的细胞溶解活性较低。图10显示了SPION-A01（左）和SPION-C01（右）的结果；根据单因素ANOVA分析，两者之间没有显著差异。此外，溶血试验的结果显示了纳米颗粒的铁浓度，阴性对照组的溶血活性高达40%。我们的结果与Janko及其同事之前的研究一致，他们在体外全血测定和PBS中的红细胞上发现SPION LA（月桂酸）和SPION LA-BSA（月桂酸-牛血清白蛋白）没有溶血作用，且具有血液相容性。(36)5. 讨论使用黑素原生物聚合物通过在Fe(III)表面的儿茶酚基团结合来稳定氧化铁（Fe–O）。这是通过电荷转移配体-金属在SPIONs表面的配位以及在碱性条件（pH > 9）下的脱质子化实现的。(23−25) 动态光散射结果表明，通过共沉淀方法制备的SPION-C01显示出相当高的单分散性（多分散指数读数<0.20），与其他合成方法相比。(27,31,33) 这些水动力直径的值与SPIONs用于生物医学应用的理想范围（20至200 nm）相符。(33,34,48) 根据早期研究，PEG的ζ电位在酸性介质（pH < 4）中为正值，而在碱性介质（pH > 10）中，由于SPION-PEG表面的OH–基团逐渐脱质子化导致纳米颗粒聚集，从而产生负值，这是由于静电排斥作用。(31,45) 在pH > 9的条件下，有机表面涂层对SPION-C01的稳定效果与其他关于含有羧酸涂层的SPIONs的合成研究结果一致。(25) 因此，SPION-C01在介质中的稳定性优于SPION-A01，因为在接近生理条件的pH值下，其ζ电位值表现良好。高ζ电位（+或−）值表明SPIONs由于静电相互作用而具有分散稳定性。(52) 涂层类型（在我们的案例中是PEG的亚单位以及黑素原的苯并噻唑、羧酸和儿茶酚基团）也影响了水分子的运动，从而减缓了水分子的运动和水扩散，根据量子力学外层球理论，导致R2弛豫率增加。(31,33,45) 实际上，这一理论表明纳米粒子大小和弛豫率r2的行为与三种可能的物理情况有关：(i) 运动平均状态（MAR），(ii) 静态退相位状态（SDR），以及(iii) 回波限制状态（ELR）。(31) 我们发现SPION-A01（6.2(1.7) nm；205(19) mM–1 s–1）和SPION-C01（10.3(3.0)nm）的平均核心直径与横向弛豫率（r2）之间的比例关系符合MAR，因为根据理论，随着纳米粒子大小的增加，磁化强度增强，较大的纳米粒子表现出更高的r2弛豫率，范围从4.0到12 nm。(31) 此外，TEM分析（图2A,D）和VSM测量（图3A）的结果与Hyeon及其同事的研究一致，他们将饱和磁化的增加与核心直径相关联。(31) 此外，通过TEM和XRD获得的“核心”大小（10–13 nm）强烈表明这些纳米粒子表现出超顺磁行为，这与之前考虑相同合成方法的研究结果一致。(25) 这些结果与理论相符，该理论认为SPIONs的核心直径随着Fe3O4纳米颗粒的聚集而增加，从而增强了颗粒之间的磁相互作用，有效地表现为更大的磁性实体，进而影响横向弛豫率（r2）的增加。(31) 关于对MRI负对比剂有用的特性，涉及SPION-A01和SPION-C01的悬浮液，这些纳米粒子显示出在横向弛豫时间（T2）上的信号降低效应。SPION-C01的横向弛豫率（r2）比SPION-A01高约10%。结论在这项工作中，我们报告了使用生物寡聚体黑素原成功包覆SPIONs，这归因于其在水介质中的血液相容性、亲水性和在MCF-7和McCoy细胞中的低细胞毒性。由于SPION-C01所具有的物理化学性质（形态、粒径分布、磁化强度以及晶体结构），其成像效果也得到了改善。实验验证表明，与SPION-A01相比，SPION-C01具有更优异的横向弛豫时间（T2）信号抑制能力，因此有望成为一种新型负性造影剂。这种在磁共振成像（MRI）中的增强效果对于识别原发性肿瘤或新血管生成（常见于转移性病变过程）具有重要意义。综上所述，SPION-C01具备在体内实验中应用的潜力，有望替代现有的PEG涂层。未来应进一步研究其血液循环特性，以全面评估这种新型负性造影剂的实际效果。
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