在生物传感器技术领域，有机硅烷表面化学已成为将生物识别物种有效固定于换能器材料表面的主流策略之一。本文首先简要阐述有机硅烷吸附层（adlayer）的形成基础，随后概述迄今为止开发的代表性有机硅烷表面化学体系。
引言：有机硅烷吸附层形成
生物传感器开发的核心在于将生物识别物种（探针）成功固定于器件换能器组件的材料表面。现有探针固定策略中，有机硅烷表面化学因可在羟基化无机或有机基底表面构建有序的双功能分子组装体（即吸附层）而被广泛采用，多数情况下需预先对材料进行羟基化处理。该类组装体的双功能性可实现目标探针与传感器制备所用材料表面的连接。典型有机硅烷的基本结构包含三个可合成定制的部分：硅烷基尾部官能团（常为三烷氧基硅基或三氯硅基），用于锚定目标材料表面；远端头部官能团，决定材料整体表面性质，可通过表面后反应与目标探针共价连接；有机骨架，将头部基团与尾部官能团间隔开，并通过分子间作用力增强表面组装稳定性。
尽管理论上有机硅烷吸附层的化学组成具有无限可能性，但实际可用的、与硅烷基尾部官能团化学兼容的头部官能团非常有限。以三氯硅基为例，其因硅原子的强亲电性及氯离去基团的存在而反应活性极高，无法耐受亲核性头部基团（如醇、羧酸、胺）的存在，这类基团需在吸附层形成过程中被保护（随后脱保护）或在组装完成后引入。
吸附层形成的确切机制仍存争议，但普遍接受其为多步过程：表面连接剂的三氯硅基或三烷氧基硅基首先被表面吸附水分子水解为三硅醇锚定基团；新生成的三硅醇交联剂从溶液本体扩散至表面-溶液界面，通过与表面羟基发生多次缩合反应的可逆吸附/脱附过程，形成表面结合硅醇；最终在表面成核形成岛状结构，经重组阶段扩展并通过相邻表面结合硅醇间的共价交联（硅醇-硅醇进一步缩合）聚合为吸附层，同时相邻有机骨架间的范德华力为吸附层提供额外刚性、有序性与稳定性。
双功能丙基三烷氧基硅烷吸附层
双功能丙基三烷氧基硅烷连接剂是将探针分子固定于羟基化无机表面的常用基础方法，其由用于锚定羟基化材料表面的三烷氧基硅基尾部官能团（硅连接的烷氧基可为甲氧基或乙氧基）及通过短丙基链作为有机骨架连接的多种头部官能团组成。
此类连接剂多可商业化获取，目前仍被广泛使用的代表是(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷（APTMS）和(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES），二者均以氨基为末端头部官能团。在羟基化无机材料表面形成上述吸附层后，暴露的氨基可通过与目标探针分子的羧基（经1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺（EDC-NHS）处理）或氨基（经戊二醛预活化步骤）反应，实现探针分子的共价固定。凭借对探针羧基与氨基的靶向能力，APTMS与APTES表面化学至今仍被广泛用于二氧化硅、氧化铝、氮化铝等多种无机材料的蛋白质与多肽固定。
其他已商业化开发的类似丙基三烷氧基硅烷表面修饰剂还包括(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPTMS）和(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷（MPTES），二者均含巯基头部官能团，可与探针分子的硫醇基反应形成二硫键，实现探针在无机材料上的固定。(3-缩水甘油醚氧丙基)三甲氧基硅烷（GPTMS）和(3-缩水甘油醚氧丙基)三乙氧基硅烷（GPTES）则以环氧基为末端头部官能团，其高张力的三元环可在探针分子的亲核原子发生亲核取代反应时开环，与环氧基位阻较小的碳形成新的Nu-C键，构成探针与无机材料间的共价连接。
需注意的是，上述双功能丙基三烷氧基硅烷连接剂的表面化学存在局限性：氨基封端的丙基三烷氧基硅烷（APTMS与APTES）需使用预活化或偶联剂（EDC-NHS、戊二醛）促进探针固定，增加了探针锚定的生产成本；巯基变体（MPTMS与MPTES）的暴露巯基可发生“交叉反应”（即一个固定连接剂的巯基与相邻连接剂的巯基形成二硫键），导致可用于锚定含硫醇探针的巯基失活；含环氧基的对应物（GPTMS与GPTES）因环氧基反应范围广，限制了该表面化学仅适用于简单有机小分子固定。尽管如此，此类双功能三烷氧基硅烷连接剂仍是羟基化无机表面探针固定的主流选择。
可功能化烷基三氯硅烷表面修饰剂
尽管商业化双功能丙基三烷氧基硅烷吸附层仍是当前简单探针固定的常用方法，近年研究开始关注新型可功能化有机三氯硅烷作为替代策略。该类连接剂以反应活性更高的三氯硅基尾部官能团替代三烷氧基硅基（用于锚定羟基化表面），并通过有机骨架连接远端头部基团。这类三氯硅烷修饰剂通常以含末端烯烃的类似前体分子为原料，在三氯硅烷（HSiCl3）与六水合氯铂酸（H2PtCl6·6H2O）共同作用下，通过经典催化氢化硅烷化反应将末端烯烃转化为Cl3Si-锚定官能团。
文献中已有多种可功能化三氯硅烷连接剂的报道，本研究团队率先开发的代表体系以长烷基链为有机骨架，以五氟苯酯（PFP）与苯硫磺酸酯（BTS）为可修饰头部官能团。PFP基团因可与伯胺残基形成强酰胺键而被选用，BTS头部基团则因对巯基（硫醇）的区域选择性被用于选择性形成二硫键。
PFP基烷基三氯硅烷连接剂已被用于修饰AT切石英表面，进而固定多种含胺探针。例如，Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸（NTAL）可被锚定在PFP修饰的石英表面，使表面功能化得到次氮基三乙酸（NTA）基团，随后与多聚组氨酸标签（His-tag）热休克蛋白10（HSP-10）形成镍(II)配位复合物。PFP基硅烷表面化学对胺基的反应活性使其完全无需使用活化剂（如戊二醛）即可固定含胺探针，显著优于传统APTMS与APTES表面化学。
另一示例中，BTS基烷基三氯硅烷吸附层被应用于氮化铝（AlN）薄膜——一种正被考虑用于未来声表面波生物传感器的压电基底。为验证BTS头部官能团对巯基的反应活性，BTS修饰的AlN薄膜随后与硫醇化生物素基团反应作为概念验证。BTS硅烷表面化学仅对探针分子的硫醇基具有选择性，比文献报道更多的MPTMS与MPTES方法更可靠，因为表面固定的BTS头部基团不会发生交叉反应。
乙二醇（EG）基三氯硅烷表面修饰剂
在开发上述PFP基与BTS基烷基三氯硅烷表面化学的同时，本研究团队近期也对将乙二醇（EG）基团作为硅烷表面修饰剂设计中的替代有机骨架产生兴趣。EG基团因可减少生物流体中蛋白质与细胞在各类材料表面的吸附而被广泛研究，在生物传感器技术中，该特性对解决始终存在的非特异性吸附（NSA，或称污染）问题至关重要，否则会干扰生物传感器的器件选择性与灵敏度。本团队开发的首批原位EG基三氯硅烷连接剂包括间隔分子MEG-OH，其在骨架中含1个EG单元并以羟基为末端头部官能团。由于羟基头部官能团与原位连接剂的三氯硅基尾部官能团不兼容，MEG-OH吸附层通常通过合成含三氟乙酰酯头部官能团（MEG-TFA）的前体三氯硅烷连接剂，再在组装后脱除三氟乙酰酯保护基（生成暴露的羟基头部官能团，形成MEG-OH吸附层）实现。本团队将MEG-TFA与MEG-OH吸附层用于修饰AT切石英，并将其作为换能剂用于声波生物传感器实验。实验发现，与MEG-OH硅烷骨架中的单个EG单元相比，其他修饰剂处理的石英在血清暴露时的污染显著降低，该结果显然与石英表面构建的特定分子结构直接相关。
本团队后续开展的分子动力学计算与中子反射实验表明，MEG-OH中引入的EG骨架可促进独特界面水屏障的形成，该屏障构成了扰动所需的能量代价，进而抑制蛋白质在无机表面吸附过程中的脱水过程。
除作为间隔分子的MEG-TFA与MEG-OH硅烷外，本团队还开发了多种其他面向后续探针固定的EG基三氯硅烷，重点调控有机骨架中EG单元的数量以增强NSA降低效果。其中一种原位开发的连接剂是OEG-TTTA，其含有可置换的2,2,2-三氟乙基酯（TFE）头部基团，TFE基团因对伯胺的选择性反应而被选用。另一种EG基硅烷表面修饰剂是OEG-TUBTS，其含有巯基选择性BTS头部基团。这两种分子均已成功用于修饰AT石英以实现后续探针固定，同时保持抗污染性能。例如，OEG-TTTA连接剂曾与MEG-OH间隔分子联用，用于共价固定多粘菌素B以检测脂多糖（LPS）。
为进一步明确EG单元数量与NSA降低效果的关联，研究人员合成了含不同EG单元数的TFA封端三氯硅烷（7-OEG-TFA、10-OEG-TFA、13-OEG-TFA），用于修饰AT切石英，并在组装后脱除TFA头部保护基以暴露远端OH头部官能团（形成7-OEG、10-OEG、13-OEG吸附层）。通过声波传感器实验对修饰石英暴露于未稀释山羊血清的性能测试发现，尽管10-OEG与13-OEG吸附层含更多EG基团，但7-OEG吸附层的污染远低于更长分子构成的吸附层。该结果强烈表明，含较短链长（较少EG单元数）的硅烷吸附层具有更强的NSA抗性，这很可能与较短分子形成的较低堆积密度允许更好的水渗透以形成前述间隙区有关；随着链长（EG单元数）增加，吸附层堆积更致密，阻碍了此类水的渗透。
MEG-Cl表面修饰剂
最后，研究团队开发了MEG-OH的姊妹分子——3-(3-(三氯硅基丙氧基)丙酰氯（MEG-Cl）。该表面修饰剂既可作为后续探针固定的连接剂，也可作为通用间隔分子，以类似前述MEG-OH吸附层的方式降低表面吸附。MEG-Cl表面化学已被用于修饰羟基化材料以实现多种用途，包括固定Ni-NTA以结合重组蛋白，以及降低血清与牛奶样品的污染。一项特定研究显示，通过声波传感器实验对MEG-Cl修饰石英基底的测试表明，MEG-Cl涂层表面具有与既往研究的MEG-OH修饰表面相当的高抗污染性。在实际应用层面，该表面化学已与针对大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）的适配体传感器联用：适配体通过抗污染连接剂MEG-Cl共价拴系于声波传感器装置的石英表面，该传感器可在磷酸盐缓冲液与牛奶样品中分别实现对大肠杆菌的选择性检测，检测限低至35 CFU/mL与8 CFU/mL，远低于商业乳制品的安全限值。
结语
有机硅烷表面化学仍是生物传感器制备中将合适探针分子固定于各类材料的常用方法。尽管本文涵盖的案例聚焦于无机基底，也有涉及有机材料（如聚合物）的相关报道。无论何种情况，有机硅烷表面化学的成功实施需考虑以下标准：换能器基底材料需具有大覆盖度的表面羟基以促进有机硅烷吸附层形成过程中的多步缩合反应，多数金属基底天然带有此类表面羟基（或可经简单处理获得），但在聚合物与其他非金属材料上引入羟基较具挑战性，此时可采用特殊表面氧化技术（如氧等离子体处理）为材料赋予所需羟基；探针固定的核心问题在于需实现器件上探针的“理想”横向间距，对于有机硅烷而言，通常通过优化用于功能化换能器材料的间隔硅烷分子与探针锚定硅烷连接剂的比例实现，尽管更高的表面固定探针丰度有利于提升灵敏度，但相邻探针的过近间距可能损害生物识别能力，因此在灵敏度与探针间距间取得理想平衡是有机硅烷表面化学的挑战之一；如前所述，硅烷连接物种与间隔分子的重要结构要素是在两类分子中均引入抗污染化学，若预期需在血液、血清等基质中进行低浓度分析物检测，则该设计是必需的，本研究团队的研究表明，含EG官能团的短骨架链是最佳策略；生物传感器领域鲜少被解决的问题是附着探针在特定换能器上的取向，现实情况是探针分子与硅烷等表面修饰剂的连接过程可能导致生物识别位点被阻断或生物探针结构受损，解决该问题的途径之一是开发含新型头部基团的表面修饰剂，专门靶向探针分子中的重要生物基序，对于蛋白质（及多肽基）探针，一个有前景的方向是开发头部官能团可共价靶向蛋白质/多肽表达过程中末端生成的特异性肽标签的连接剂，例如通过靶向His标签基序固定His标记蛋白质，这类表面化学有望将几乎任意目标蛋白质或重要多肽可控取向地固定于目标无机材料表面。
