堆叠发酵是酱香型白酒生产中的关键阶段，这种传统中国蒸馏酒以其复杂香气闻名。然而，完整八轮堆叠过程中持续的微生物演替和功能动态仍未被充分解析。本研究系统调查了连续八轮堆叠发酵中的理化性质、挥发性化合物、微生物群落结构和功能基因谱。发酵过程中水分、酸度和温度上升，而淀粉含量显著下降，表明底物逐步转化。共鉴定出82种挥发性化合物，其中酯类和酸类占主导，并在与高品质白酒相关的第4至第6轮达到峰值。宏基因组测序实现了微生物演替的物种水平表征。细菌群落从乳酸菌（LAB）转变为Kroppenstedtia eburnea、Thermoactinomyces vulgaris和Bacillus spp.，而真菌演替则从初始酵母优势过渡到霉菌共存，再回到酵母优势。功能基因注释揭示糖酵解和丙酮酸代谢为核心途径。共现网络和相关性分析表明微生物群间存在潜在功能分区：霉菌与淀粉代谢和苯乙酸乙酯形成相关，酵母与乙醇和酯类生产相关，乳酸菌与有机酸代谢相关。本研究提供了酱香型白酒全八轮堆叠发酵中微生物演替和功能分区的全面、物种水平解析。研究结果强调了特定微生物类群在塑造发酵结果中的作用，并为优化传统白酒生产中的风味形成和产品质量提供了机制性见解。
酱香型白酒是中国传统固态发酵蒸馏酒，其独特风味产生于长达一年的生产周期，包含八轮连续的堆叠和窖池发酵。堆叠发酵作为关键阶段，在好氧和嗜热条件下驱动功能微生物选择性富集，通过自然接种（主要来自大曲，少量来自环境和工具）使微生物快速增殖并产生大量生物热。尽管已有研究探索了酱香型白酒发酵中的微生物组成，但多数依赖扩增子测序、采用混合样本或仅关注特定轮次，缺乏对完整八轮堆叠过程中连续微生物演替、功能转变及其与风味形成关联的系统性整合。此外，扩增子方法往往缺乏物种水平分辨率，而将微生物组成、演替模式、功能基因谱、微生物互作和挥发性化合物形成结合起来的系统性视角仍然缺失。为填补这些空白，研究人员对每个堆叠轮次内（来自贵州茅台镇某酱香型白酒企业的酿造车间1）的三个明确定义时间点（第1、5、9天，分别代表早期-1、中期-2、晚期-3）的理化性质、挥发性化合物、物种解析的微生物群落和功能基因谱进行了研究。每轮从三个独立发酵堆（作为生物学重复A、B、C）各取9个子样本混合为一个复合样本，共采集72个样本。研究揭示了从第4-6轮识别出的“控制窗口”，关键理化转变、风味积累和核心功能类群在此汇聚，为基于微生物组优化传统固态发酵提供了可操作的工艺管理策略。结论表明，微生物演替模式、功能分区和风味形成的机制性理解有助于提高产品质量一致性。该论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。
为开展研究，研究人员使用了以下主要关键技术方法（样本队列来源自贵州茅台镇某酱香型白酒企业的酿造车间1，涉及八轮堆叠发酵共72个复合样本）：理化参数分析（水分、酸度、淀粉、还原糖测定）；挥发性风味物质的气相色谱（GC）定量分析；总DNA提取与宏基因组测序（Illumina NovaSeq 6000平台，PE150策略，每样本至少6Gb数据量）；以及生物信息学分析（Kraken2用于物种级分类注释，KEGG数据库进行功能基因注释，metaSPADES组装，Prodigal基因预测）。此外，运用主成分分析（PCA）、线性判别分析效应大小（LEfSe）、共现网络（Spearman相关）和典型相关分析（CCA）等统计方法。
研究结果如下：
3.1 理化因子动态：通过理化参数测定，发现水分从42.56%稳步增至57.50%，酸度在第6轮达最大值3.58 mmol/10 g后下降，淀粉从40.93%显著降至14.20%，还原糖先升至第6轮峰值3.83%后回落至0.97%，堆芯温度每轮升至40 °C以上，R1最高达50.9 °C。这表明堆叠发酵维持持续嗜热环境，为微生物演替提供选择压力。
3.2 挥发性风味物质动态：通过GC分析，共鉴定82种挥发性化合物，酯和酸占总挥发物65%以上，酯浓度在第4-7轮达峰值（第5轮最高1405 μg/g），其中苯乙酸乙酯最丰富。聚类分析将样本分为三簇，第4-6轮（簇1）以较高酯和酸及较低高级醇为特征，对应优质酱香型白酒相关属性，表明该阶段为香气前体富集关键期。
3.3 微生物群落多样性：通过宏基因组测序（平均Q30 95.07%，覆盖率>0.999），细菌α多样性（Chao1和Shannon指数）先升后降，真菌Chao1稳定约180而Shannon先升后降；β多样性显示细菌从第1-2轮到第3-8轮趋于稳定，真菌在第4-6轮聚集后在第7-8轮再次分散，揭示微生物群落的时间结构。
3.4 微生物群落的组成、动态与演替：通过Kraken2物种级分类，细菌从乳酸菌（LAB，如Lactiplantibacillus plantarum）主导转为Kroppenstedtia eburnea、Bacillus spp.和Thermoactinomyces vulgaris富集，最终稳定于K. eburnea、T. vulgaris和Bacillus spp.。真菌从酵母（Wickerhamomyces anomalus、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae等）优势经第3-6轮霉菌（Aspergillus chevalieri、Lichtheimia ramosa、Paecilomyces variotii等）共存后回到酵母优势（P. kudriavzevii、Torulaspora delbrueckii等）。LEfSe分析（LDA阈值4）鉴定出24种核心细菌和18种核心真菌作为阶段特异性生物标志物。
3.5 微生物群落与理化因子的关联：通过CCA和线性回归，发现淀粉是影响微生物群落的最主要因子，与多数类群呈强负相关，并与微生物演替率显著关联，表明底物消耗与群落更替紧密耦合。
3.6 堆叠发酵功能分析：通过KEGG功能注释，糖代谢相关基因在第1-2轮显著富集，糖酵解途径（ko00010）丰度最高（2248.41），超过TCA循环。关键酶中乙醇脱氢酶（EC 1.1.1.1）最丰富（434.60），其基因在第4-6轮尤其富集，与脂肪酸乙酯合成基因峰值一致，对应酯浓度高峰，表明中期为乙醇和酯类代谢活跃期。
3.7 微生物、功能基因与挥发性化合物的关联：通过共现网络和Spearman相关分析，网络分为四个模块：模块1含霉菌（P. variotii、Mucor ruber等）和Bacillus spp.，与淀粉降解（ko00500）相关，且P. variotii与苯乙酸乙酯强正相关（ρ=0.899）；模块2含S. cerevisiae、T. delbrueckii和Acetobacter pasteurianus，与乙醇、乙酸和酯合成相关；模块3含P. kudriavzevii等，与丙酸和丁酸相关；模块4含LAB和Zygosaccharomyces等，与乳酸和苯乙酸合成相关。这支持微生物群间存在潜在功能分区。
在讨论部分，研究人员总结了理化变化与微生物代谢的关联，指出水分增加源于呼吸和代谢水，酸度积累由乳酸菌（LAB）、醋酸菌（AAB）和酵母贡献，淀粉降解不完全可能有利于风味前体积累。挥发性化合物中酯在第4-6轮峰值对应微生物活性和酶潜力最高期，苯乙酸乙酯贡献花香和果香，高级醇需严格控制。微生物多样性方面，细菌Chao1先升后降反映竞争排除，Kroppenstedtia和Bacillus因耐热性占据生态位，LAB和AAB产酸增加竞争力，Thermoactinomyces在后期富集。真菌中Pichia和Paecilomyces通过宏基因组测序获得高分辨率，Saccharomyces贡献乙醇和酯。CCA显示淀粉与微生物动态最相关，但微生物增殖也会加速淀粉消耗，形成反馈循环。功能基因谱强调糖酵解主导，乙醇脱氢酶基因在中期达到峰值，与酯积累一致。共现网络揭示霉菌在早期驱动淀粉水解并与苯乙酸乙酯形成关联，酵母与乙醇和酯合成相关，LAB与酸代谢相关，而丰度高的K. eburnea和P. kudriavzevii连接性低，提示丰度不直接反映功能重要性。研究人员指出，所有样本来自单一生产设施，演替模式可能反映车间和区域特异性，需跨批次验证；宏基因组揭示功能潜力而非实际表达，未来需整合宏转录组、酶活测定、靶向代谢组和培养验证。
研究结论翻译如下：本研究系统表征了酱香型白酒全八轮堆叠发酵过程中理化变化、挥发性化合物谱、微生物演替和功能基因动态。水分从42.56%增至57.50%，淀粉从40.93%降至14.20%，表明广泛的微生物水解伴随酸度和还原糖的相应变化。宏基因组分析揭示细菌群落从乳酸菌（LAB）主导转变为K. eburnea、T. vulgaris、AAB和Bacillus spp.富集的组合，最终稳定于K. eburnea、T. vulgaris和Bacillus spp.。真菌群落从初始酵母优势过渡到霉菌共存阶段，再回归酵母优势。功能注释、共现网络和相关性分析表明微生物群间存在潜在功能分区，霉菌与淀粉代谢和苯乙酸乙酯形成相关，酵母与乙醇和酯类生产相关，乳酸菌与酸代谢相关。风味形成似乎并非仅由微生物丰度决定，而是与阶段特异性微生物演替和功能特化相关联。总之，这些发现增强了研究人员对堆叠发酵过程中微生物演替和功能特化的机制性理解，并为酱香型白酒生产的合理优化提供了坚实基础。
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