青枯菌GMI 1000菌株c-di-GMP合成酶Rsp1208的功能

摘要：

【背景】青枯病是由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引发的毁灭性土传植物病害，c-di-GMP作为细菌保守第二信使调控病原菌致病表型，但其在青枯菌中的核心代谢基因功能仍需深入解析。【目的】探究青枯菌GMI 1000中c-di-GMP代谢相关基因的功能及调控机制，明确关键基因对菌株生理表型和致病力的影响，完善青枯菌c-di-GMP信号调控网络，为青枯病新型防控靶点挖掘与绿色防控策略研发提供理论依据。【方法】以青枯菌GMI 1000为研究对象，采用RT-qPCR检测常规培养与模拟侵染条件下24个潜在c-di-GMP代谢基因的转录表达差异；针对极显著下调的Rsp1208，通过同源重组与电转化技术构建缺失、回补、酶活位点突变及过表达工程菌株；系统测定各菌株的生长动态、运动能力、生物膜形成量、胞外多糖产量等关键生理表型，结合RT-qPCR分析运动与胞外多糖合成相关基因的转录水平；采用LC-MS/MS与噻唑橙荧光反应法检测胞内c-di-GMP含量及体外合成酶活性；采用伤根接种法测定菌株对番茄的致病力。【结果】模拟侵染环境下，24个c-di-GMP代谢相关基因均呈不同程度转录下调，其中Rsp1208下调水平极显著，其编码蛋白同时含有GGDEF与EAL双结构域。Rsp1208缺失后，菌株运动能力与胞外多糖产量分别显著提升26.57%、85.92%，生物膜形成量降低75%，胞内c-di-GMP水平显著下降，对番茄致病力极显著增强；回补菌株表型恢复至野生型水平，过表达菌株则表现为运动能力减弱、生物膜形成微量提升、致病力显著降低。Rsp1208缺失株中运动相关基因（flhC、fliA、fliM、fliC）与胞外多糖合成基因（xpsR、epsB）转录水平均极显著上调。GGDEF酶活位点突变可使Rsp1208基本丧失c-di-GMP合成能力，EAL位点突变无显著影响。【结论】Rsp1208通过GGDEF结构域发挥c-di-GMP合成酶功能，调控青枯菌胞内c-di-GMP稳态，进而介导运动性、生物膜、胞外多糖等表型重塑，最终调控病原菌致病力，研究结果可为深入解析青枯菌的致病机制、研发绿色防控技术提供理论支撑。