rFgl2处理的CD32b+M2型巨噬细胞有效抑制小鼠心脏移植排斥反应

背景：寻找针对急性排斥反应的额外治疗方法是必要的。选择性激活巨噬细胞（M2型巨噬细胞，M2 macrophages）具有免疫调节功能，增强其免疫调节能力是一种可行的辅助治疗方法。Fcγ受体II b（FcγRIIb，CD32b）在M2型巨噬细胞中高表达，其重要配体纤维蛋白原样蛋白2（Fgl2）均为免疫抑制分子，有必要探索二者在增强M2型巨噬细胞免疫调节能力方面的潜力。方法：体外实验中，研究人员通过磁珠分选获得CD32b⁺M2型巨噬细胞，并用重组Fgl2（rFgl2）进行处理，在模拟炎症刺激（脂多糖+干扰素γ）条件下，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术和蛋白质免疫印迹（WB）探索其免疫调节能力及可能机制；同时与CD4⁺T细胞共培养，探索其对调节性T细胞（Tregs）极化的调控作用。体内实验中，研究人员使用rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞治疗腹腔心脏移植模型小鼠，通过ELISA、苏木精-伊红染色、免疫组织化学和流式细胞术检测全身炎症、巨噬细胞、CD4⁺及CD8⁺T细胞与Tregs的系统比例变化，以及移植物中的浸润情况。结果：体外实验中，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞进一步表达白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β1（TGF-β1），且SHP2和STAT3的磷酸化水平增加，与CD4⁺T细胞共培养后有效提高了Tregs的比例。体内实验中，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞增加了M2型巨噬细胞和Tregs的比例，改善了全身炎症，减轻了移植物损伤，减少了炎性细胞浸润，并延长了移植物存活时间。结论：rFgl2通过激活SHP2进而促进STAT3活化，促进Tregs分化，进而促进抑炎因子IL-10及TGF-β1的分泌。rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞通过促进M2型巨噬细胞及Tregs分化，减轻小鼠心脏移植急性排斥反应，可作为减少免疫抑制不良反应、延长同种异体移植物存活时间的辅助治疗手段。

该研究聚焦于器官移植领域急性排斥反应这一关键临床问题。器官移植是终末期器官衰竭患者最有效的治疗策略，然而急性排斥反应是移植后常见的并发症，严重影响移植物功能并威胁患者生存。尽管当前免疫抑制疗法显著降低了急性同种异体移植物排斥的发生率，但其伴随的药物毒性、感染、代谢并发症及恶性肿瘤等不良反应同样不容忽视。因此，寻找能够降低急性排斥反应发生率和严重程度的新的免疫抑制方法具有重要意义。固有免疫在排斥反应中发挥重要作用，其中巨噬细胞作为抵御外来物质的第一道防线，具有可塑性和极化特征，在不同环境刺激下可分化为经典激活巨噬细胞（M1型巨噬细胞，M1 macrophages）和选择性激活巨噬细胞（M2型巨噬细胞）。M2型巨噬细胞被认为具有免疫调节功能，可通过分泌多种抑炎因子发挥免疫调节作用。Fcγ受体II b（FcγRIIb，CD32b）是唯一具有抑制功能的Fcγ受体，其包含的免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）结构域使其与免疫耐受相关；而可溶性纤维蛋白原样蛋白2（sFgl2）是CD32b的关键功能性配体，也是调节性T细胞（Tregs）分泌的关键免疫抑制因子和重要效应分子。CD32b是sFgl2的唯一受体，在包括巨噬细胞在内的多种免疫细胞中表达，但CD32b在巨噬细胞中的作用仍需进一步研究。基于此，研究人员探索了CD32b在M2型巨噬细胞中的表达，分析了添加重组Fgl2（rFgl2）对CD32b⁺M2型巨噬细胞因子分泌及免疫调节功能的影响，并验证其能否保护心脏同种异体移植物免受排斥反应，从而实现移植物的长期存活。

该研究发表于《Immunobiology》。研究采用的主要关键技术方法包括：体外利用M-CSF和IL-4诱导骨髓来源细胞分化为M2型巨噬细胞，通过磁珠分选获得CD32b⁺M2型巨噬细胞；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western blotting，WB）检测相关指标；建立CD4⁺T细胞与巨噬细胞的体外共培养体系；构建Balb/c至C57BL/6小鼠腹腔异位心脏移植模型，通过尾静脉注射方式进行细胞治疗干预；采用苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色评估移植物病理改变。

研究结果部分包含以下主要内容：

CD32b⁺M2型巨噬细胞表达更高水平的IL-10及TGF-β1：研究人员通过M-CSF和IL-4体外诱导获得CD206⁺M2型巨噬细胞，流式细胞术检测显示M2型巨噬细胞高表达CD32b（79.8%）。经磁珠分选获得高纯度CD32b⁺M2型巨噬细胞后，ELISA检测细胞培养上清液发现，与M2型巨噬细胞相比，CD32b⁺M2型巨噬细胞分泌更高水平的抗炎因子IL-10和TGF-β1，而促炎因子IL-6和TNF-α表达水平降低，提示CD32b⁺M2型巨噬细胞作为M2型巨噬细胞的亚群可能具有更强的免疫抑制功能。

rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞具有更强的免疫抑制能力：在确认CD32b⁺M2型巨噬细胞高表达抗炎因子后，研究人员补充rFgl2以探究其对CD32b⁺M2型巨噬细胞免疫-chairman免疫调节功能的影响。结果显示，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞进一步表达IL-10和TGF-β1，同时IL-6和TNF-α表达进一步降低；且阻断CD32b后，rFgl2诱导CD32b⁺M2型巨噬细胞分泌更多IL-10和TGF-β1的效应受到抑制。机制探索发现，添加rFgl2后CD32b⁺M2型巨噬细胞中SHP2和STAT3的活化水平升高。与CD4⁺T细胞共培养后，CD32b⁺M2组Tregs比例已较对照组增加，而rFgl2处理组Tregs比例进一步增加；阻断CD32b后，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞诱导Tregs分化的效能受损。这些结果提示rFgl2可进一步增强CD32b⁺M2型巨噬细胞的免疫调节功能。

rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞更有效缓解急性排斥反应：在体外实验确认rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞具有更显著免疫抑制能力后，研究人员通过尾静脉注射方式对腹腔心脏移植模型小鼠进行细胞治疗干预。Kaplan-Meier生存曲线显示，与未治疗组相比，CD32b⁺M2型巨噬细胞延长了移植物存活时间，而rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞进一步延长了移植物存活时间。移植术后第7天获取移植物进行H&E染色，结果显示CD32b⁺M2组移植物较未治疗组炎性细胞浸润减少、组织损伤减轻、病理评分降低；rFgl2处理组移植物炎性细胞浸润进一步减少、组织损伤进一步减轻、病理评分进一步降低。ELISA检测小鼠血清评估全身炎症状态，结果显示CD32b⁺M2组小鼠血清中IL-10和TGF-β1表达增加，促炎因子IL-6和TNF-α表达降低；rFgl2处理组血清IL-10和TGF-β1表达水平进一步升高，促炎因子IL-6和TNF-α表达进一步降低。这些数据表明rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞能够更有效缓解急性排斥反应。

rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞增加体内M2型巨噬细胞比例：观察到移植物存活时间延长后，研究人员检测了移植物中巨噬细胞浸润情况。免疫组织化学染色结果显示，补充CD32b⁺M2型巨噬细胞增加了移植物中M2型巨噬细胞（Arg-1阳性）浸润数量，而补充rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞进一步增加了移植物中M2型巨噬细胞浸润数量。流式细胞术结果提示，CD32b⁺M2型巨噬细胞治疗后M2型巨噬细胞比例增加，而rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞给药后M2型巨噬细胞比例进一步增加；脾脏及移植物中M1型巨噬细胞比例在补充CD32b⁺M2型巨噬细胞后降低，rFgl2处理后进一步降低。这些结果提示输入的M2型巨噬细胞可能通过影响受体小鼠M2型巨噬细胞比例发挥免疫抑制效应。

rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞增加体内Tregs比例：流式细胞术结果显示，与未治疗组相比，CD32b⁺M2组小鼠脾脏中CD4⁺及CD8⁺T细胞比例降低，rFgl2处理组脾脏中CD4⁺及CD8⁺T细胞比例进一步降低。Tregs检测结果提示，CD32b⁺M2型巨噬细胞给药后Tregs比例升高，而rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞给药后Tregs比例进一步升高。免疫组织化学染色评估移植物局部T细胞浸润，结果显示CD32b⁺M2组移植物中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞浸润较未治疗组显著减少，rFgl2处理组进一步减少；而Tregs标志物FOXP3阳性细胞在CD32b⁺M2组增加，在rFgl2处理组进一步增加。这些数据表明rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞可通过增加Tregs比例展现更有效的免疫调节功能。

讨论部分，研究人员首先指出急性排斥反应仍是影响器官移植患者生存和供体器官功能的主要因素之一，免疫抑制药物虽取得巨大进展，但存在增加感染、肝肾毒性及肿瘤发生等风险，减少或避免免疫抑制药物使用是器官移植领域的研究焦点。由于固有免疫在移植排斥中的作用不可忽视，因此有必要关注急性排斥反应中的固有免疫。巨噬细胞作为固有免疫的重要成员，占移植物浸润细胞的38%-60%，与急性和慢性同种异体移植物排斥相关。CD32b受体主要表达于树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和B细胞表面，作为唯一抑制性Fcγ受体，CD32b可抑制FcγRs活化导致的细胞因子释放；CD32b缺失会增加自身免疫病风险。本研究中，研究人员发现高表达F4/80⁺CD206⁺的M2型巨噬细胞也高表达CD32b，CD32b⁺M2型巨噬细胞经分选后可表达更高水平的IL-10和TGF-β1，而rFgl2处理进一步增加了这两种抗炎因子的表达，同时降低了IL-6和TNF-α的表达。CD32b是免疫抑制分子sFgl2的唯一受体，sFgl2主要由CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞和耐受性CD8⁺CD45RC^lowTreg细胞分泌；已有研究证实sFgl2在产生耐受的小鼠肝脏移植模型中上调，外源性sFgl2可通过诱导巨噬细胞向M2型极化来缓解同种异体移植物排斥。Fgl2作用于CD32b可影响SHP2、NF-κB、STAT1、STAT3和ERK1/2等多个靶点的活化从而发挥免疫调节功能。结合课题组前期研究，本研究发现rFgl2处理后CD32b⁺M2型巨噬细胞中SHP2磷酸化水平升高，STAT3磷酸化水平进一步升高。SHP2是CD32b下游关键分子，CD32b通过其免疫受体酪氨酸抑制基序结构域调控下游SHP2活化，进而调控STAT3活化；STAT3与M2型巨噬细胞极化相关，在巨噬细胞向M2极化及M1向M2复极化过程中STAT3活性均增加。因此，本研究得出结论：rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞通过增强SHP2及STAT3活化发挥更强的免疫抑制功能。研究还发现，补充CD32b⁺M2型巨噬细胞有效缓解了急性排斥反应并延长了小鼠心脏移植移植物存活时间，而rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞进一步延长了移植物存活时间。促进巨噬细胞向M2型极化并增加受体M2型巨噬细胞比例可减轻排斥反应并延长移植物存活；补充CD32b⁺M2型巨噬细胞有效增加了移植物局部M2型巨噬细胞趋化和分化，增加了循环抗炎因子表达，而rFgl2处理后上述效应更为显著，提示回输rFgl2处理的M2型巨噬细胞可通过显著增强M2型巨噬细胞极化免疫调节功能发挥更强免疫调节作用。移植术后CD4⁺和CD8⁺T细胞被招募至移植物局部导致T细胞介导的急性同种异体移植物排斥，巨噬细胞作为重要抗原呈递细胞可招募T细胞并调节T细胞功能。本研究发现rFgl2处理的M2型巨噬细胞显著减少了移植物中CD4⁺、CD8⁺T细胞浸润并降低了二者在脾脏中的比例；同时rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞在体内外均更显著促进了Tregs分化。Tregs作为CD4⁺T细胞的重要亚群具有免疫抑制效能，可有效缓解急性排斥反应；M2型巨噬细胞可诱导Tregs分化。综上所述，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞通过影响CD4⁺和CD8⁺T细胞招募及调控Tregs分化，可更有效发挥免疫抑制能力。

研究结论部分原文翻译如下：总之，本研究发现M2型巨噬细胞的亚群，特别是CD32b⁺M2型巨噬细胞，表现出更强的免疫抑制效应。此外，rFgl2通过调控SHP2促进STAT3活化，进而促进抗炎细胞因子的分泌和Tregs的分化。另外，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞通过增强M2型巨噬细胞和Tregs的分化，缓解了小鼠心脏移植中的急性排斥反应，从而改善了局部和全身炎症状况。这些发现表明，rFgl2处理的CD32b⁺M2型巨噬细胞可作为辅助疗法，减少免疫抑制剂的不良反应并延长同种异体移植物的存活时间。