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在SARS-CoV-2病毒的复制过程中，一长串连接的蛋白质被切割成单独的蛋白质。这一过程被FDA批准的治疗COVID-19的药物打断;然而，这种解理过程的机理细节仍不清楚。现在，由宾夕法尼亚州立大学的研究人员领导的一个团队已经制作了迄今为止这一过程最详细的图像，揭示了这些蛋白质以一致的顺序被切割，可能是由蛋白质链的结构决定的
一项新的研究提供了对SARS-CoV-2病毒中称为多蛋白的长串连接蛋白如何被称为Mpro的蛋白酶裂解的见解，这是病毒复制过程中的一个重要步骤。利用一种称为冷冻电子显微镜(cryo-EM)的成像技术，研究小组提出，分步切割过程是由多蛋白的结构决定的。左上:Mpro和多蛋白复合物的Cryo-EM图像(灰色，复合物的颗粒用绿色圆圈表示)。中上方和右侧:该综合体的2d级平均值。下图:该复合物的Cryo-EM密度图(灰色透明)显示了结合Mpro的识别位点外的多蛋白(虚线椭圆形)的密度(绿色和青色)。
宾州大学公园在SARS-CoV-2病毒的复制过程中，一长串连接的蛋白质被分裂成单独的蛋白质。这一过程被FDA批准的治疗COVID-19的药物打断；然而，这种解理过程的机理细节仍不清楚。现在，由宾夕法尼亚州立大学的研究人员领导的一个团队已经制作了迄今为止这一过程最详细的图像，揭示了这些蛋白质以一致的顺序被切割，可能是由蛋白质链的结构决定的。研究结果发表在《Journal of Biological Chemistry》上的一篇论文中，可以支持开发更有效的药物来治疗COVID-19。
逆转录病毒和许多其他RNA病毒——包括SARS-CoV-2——将它们的RNA基因组翻译成一长串相互连接的蛋白质，称为多蛋白。这种多蛋白随后被一种叫做蛋白酶的酶一次一个地分裂成独立的成熟蛋白质。这一过程是病毒复制的重要步骤，因此是抗病毒药物的理想靶点。例如，已被批准用于治疗轻中度COVID-19的药物PAXLOVID含有一种名为nirmatrelvir的蛋白酶抑制剂，它会干扰被感染人类细胞内SARS-CoV-2病毒的这一过程。
“SARS-COV-2病毒使用一种名为M的蛋白酶宾夕法尼亚州立大学生物化学和分子生物学教授、该论文的作者Katsuhiko Murakami说:“将一个多蛋白按特定顺序切割成10个单独的蛋白质。但是这个命令是如何确定的还不清楚。为什么Mpro先去一个识别点，而不是其他的?在这项研究中，我们使用冷冻电子显微镜制作了高分辨率的M单独或与多蛋白复合。更好地了解这种切割过程是如何发生的，可以为优化抗病毒药物的结合提供见解，甚至揭示抑制这一过程的新方法。”
以前的研究使用一种称为X射线晶体学的成像技术来研究Mpro单独或当它附着在多蛋白的一个非常短的片段上时。然而，研究小组想研究Mpro在上下文中，具有更具有代表性的多蛋白形式和更高的分辨率。
宾夕法尼亚州立大学博士后、该论文的第一作者Manju Narwal说:“以前的研究有一个局限性，那就是他们只使用了一种小肽来模拟多蛋白。我们想更清楚地了解Mpro接近多蛋白上的各种识别位点，看看是否有关于Mpro或者多蛋白决定它先去哪里。”
研究人员发现Mpro与切割位置的识别位点结合，但与多蛋白的其余部分很少接触。根据研究人员的说法，这表明多蛋白结构可能决定了Mpro劈开。
“如果Mpro从所有暴露的可能性中选择一个首选的识别位点，我们希望它与多蛋白进行额外的接触，原因与能量学和稳定性有关，”Narwal说。“因为我们没有看到那些额外的接触，我们怀疑多蛋白的结构可能决定了切割顺序。例如，在多蛋白中只有有限数量的识别位点可以被Mpro访问。当第一个蛋白质被Mpro从多蛋白的其余部分分离出来，下一个首选位点就暴露出来了。然后，一旦这一块裂开，它就会暴露另一块，以此类推。”
这些新发现之所以成为可能，是因为研究人员使用了冷冻电子显微镜(cryo-EM)，这是一种产生原子分辨率生物分子结构的成像技术。
“因为Mpro的重要性宾夕法尼亚州立大学生物化学和分子生物学助理教授、该论文的作者之一Jean-Paul Armache说:“来自世界各地的研究人员使用x射线晶体学迅速制作了数百张蛋白酶的图像，这非常适合研究较小目标的结构。”Cryo-EM是一种更常用于大分子的技术即使与多蛋白结合，Mpro也相当小，这使得在高分辨率下确定其结构变得更加困难。尽管尺寸很小，但我们能够专注于Mpro使用低温电镜，这要归功于Manju精心的样品制备;我们的低温电子显微镜和合著者托马斯·爱德华兹的技术;以及现代数据处理技术。”
研究小组在宾夕法尼亚州立大学哈克生命科学研究所的冷冻电子显微镜设备上进行了初步实验，随后在马里兰州弗雷德里克的国家癌症研究所的国家冷冻电子显微镜设备上进行了额外的成像。
“虽然我们确定了Mpro当与多蛋白结合时，多蛋白本身的图像就不那么清晰了。”Murakami说。“我们正在努力可视化整个复合体，并专注于多蛋白的其他区域。这些见解将支持未来对许多病毒复制这一关键步骤的研究，我们希望最终将支持有效的新型抗病毒药物的创造。”
爱德华兹是美国国家癌症研究所国家低温电子显微镜研究所的高级显微镜专家和设备经理。这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持。
SARS-CoV-2 polyprotein substrate regulates the stepwise Mpro cleavage reaction
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