SENP3通过ASS1去SUMO化促进肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞凋亡的机制研究

本研究针对肾缺血再灌注损伤(IRI)中SUMO化修饰的调控机制，揭示了SENP3介导的ASS1去SUMO化在肾小管上皮细胞凋亡中的关键作用。研究人员通过构建肾小管特异性Senp3基因敲除小鼠模型，结合质谱分析发现ASS1是SUMO2/3修饰的关键靶点(K239/K310)。结果表明，SENP3通过促进ASS1核转位，增强p53转录活性，激活内源性凋亡通路。该研究为急性肾损伤(AKI)的治疗提供了新的潜在靶点。

在肾脏疾病研究领域，急性肾损伤(AKI)始终是一个严峻的临床挑战，其中缺血再灌注损伤(IRI)是导致AKI的主要病因之一。当肾脏血流供应突然中断后又恢复时，肾小管上皮细胞会经历一系列复杂的病理生理变化，最终可能导致细胞凋亡和肾功能丧失。尽管医学界对IRI的认识不断深入，但其具体的分子机制仍未完全阐明，这限制了有效治疗策略的开发。

近年来，蛋白质翻译后修饰在疾病发生发展中的作用日益受到关注。SUMO化修饰作为一种可逆的蛋白质修饰方式，类似于磷酸化或泛素化，能够通过共价连接SUMO蛋白来改变靶蛋白的功能、稳定性或亚细胞定位。这种修饰过程由SUMO特异性蛋白酶(SENP)家族动态调控，其中SENP3主要定位于细胞核，负责SUMO2/3的成熟和去结合过程。有趣的是，SENP3的活性受到氧化应激的精细调控——在氧化应激条件下，它从核仁重新分布到核质，这一过程通过抑制其降解来实现。

先前的研究表明，SUMO化修饰在心脏、肝脏和神经系统的缺血再灌注损伤中发挥保护作用，但在肾脏IRI中的具体角色却存在争议。一些研究提示SUMO化可能对肾小管上皮细胞具有保护效应，而另一些研究则表明SUMO化抑制可能使肾脏细胞对凋亡更敏感。这种矛盾提示我们，SUMO化在肾脏IRI中的作用可能具有高度的背景依赖性，取决于特定的SUMO亚型、SENP蛋白酶和底物蛋白。正是基于这样的科学背景，王洪菊等研究人员在《Cell Death & Disease》上发表了他们的最新研究成果，旨在深入探索SENP3介导的去SUMO化在肾IRI中的具体作用机制。

为了系统解答这些问题，研究团队运用了多种关键技术方法：他们建立了肾小管特异性Senp3条件性基因敲除(CKO)小鼠模型，并通过肾动脉夹闭手术模拟临床IRI；利用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术筛选SUMO2/3修饰的靶蛋白；通过细胞分子生物学手段如免疫共沉淀(Co-IP)、Western blot、免疫荧光等验证蛋白质相互作用和修饰位点；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；并通过双荧光素酶报告基因实验评估p53转录活性。

SENP3在肾缺血再灌注损伤中促进细胞凋亡

研究人员首先检测了SUMO化与去SUMO化在肾脏IRI中的表达变化。结果显示，在IRI诱导的急性肾损伤(IRI-AKI)小鼠模型中，SENP3和SENP5的转录水平显著升高。类似现象也在肾小管上皮细胞系TCMK1经历的缺氧/复氧(H/R)处理中出现，其中SENP3的表达上调更为明显。随着再灌注时间的延长，SENP3的转录和蛋白水平均呈现渐进式增加，免疫荧光染色进一步证实IRI后近端肾小管上皮细胞(PTECs)中SENP3表达上调。

为了明确SENP3在PTECs中的功能，研究团队构建了肾小管特异性Senp3基因敲除小鼠(Senp3^flox/flox-Ggt1^Cre，简称CKO)。与对照组(WT)相比，CKO小鼠在基础状态下未见明显肾损伤，但在经历IRI后，表现出显著减轻的肾功能损害：血清肌酐水平降低，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子-1(KIM-1)表达下降，TUNEL阳性凋亡细胞减少。这些结果表明SENP3缺失对IRI诱导的肾损伤具有保护作用。

SENP3介导的去SUMO化激活内源性凋亡通路

进一步探究SENP3促进凋亡的分子机制，研究人员分析了凋亡信号通路的关键组分。在IRI后的肾组织中，SENP3缺陷显著减弱了BID及其截短形式(tBID)的活化，以及CASPASE-9和cleaved CASPASE-3的切割，但不影响CASPASE-8的切割。这一发现在体外实验中得到了验证：在TCMK1细胞中敲低SENP3能够显著减轻H/R诱导的凋亡，并抑制凋亡执行蛋白的活化(CASPASE-8除外)。

为了确认SENP3的去SUMO化活性是其功能所必需的，研究团队构建了野生型SENP3(SENP3-WT-HIS)和催化失活突变体(SENP3-C526S-HIS)表达载体。过表达SENP3-WT而非C526S突变体加剧了H/R诱导的凋亡，并促进了BID/tBID的产生以及CASPASE-9和CASPASE-3的切割。这些结果证明SENP3通过其去SUMO化活性促进肾小管细胞凋亡，主要经由内源性凋亡通路实现。

鉴定SUMO2/3修饰的ASS1为肾IRI中关键SENP3底物

基于SENP3介导的去SUMO化促进凋亡的发现，研究人员采用蛋白质组学方法寻找IRI发病机制中关键的SUMO2/3结合蛋白底物。他们通过免疫沉淀从有无SENP3缺陷的IRI-AKI小鼠肾组织裂解液中富集SUMO2/3修饰的蛋白，并通过定量质谱鉴定出16个潜在靶点。通过生物信息学分析和文献调研，精氨酸琥珀酸合成酶1(ASS1)被选为后续研究对象。ASS1是尿素循环中精氨酸生物合成的限速酶，在肾脏特别是近端小管细胞中高表达。

研究证实，在IRI肾组织和H/R处理的TCMK1细胞中，ASS1与SUMO2/3的结合减少。同时，ASS1与SENP3存在相互作用，且H/R处理显著降低了ASS1的SUMO化水平，同时增强了ASS1-SENP3相互作用。通过生物信息学预测和点突变验证，研究人员确定ASS1的SUMO化主要发生在K239和K310位点。将这两个位点同时突变为精氨酸(ASS1-2KR)几乎完全消除了ASS1的SUMO2/3修饰，并破坏了其与SENP3的相互作用。

SENP3依赖的去SUMO化是ASS1核聚集所必需的

亚细胞定位分析显示，在基础状态下，ASS1分布于胞浆和细胞核，而SENP3和SUMO2/3主要位于核内。H/R处理后，ASS1在核内聚集增加，胞浆水平下降，且核内的ASS1主要处于去SUMO化状态。敲低SENP3减少了核内ASS1水平，部分抑制了H/R诱导的ASS1核聚集。相反，过表达野生型SENP3进一步增强了ASS1的核聚集，而催化失活的SENP3-C526S突变体则无此效应。免疫荧光染色进一步证实H/R诱导的ASS1核转位依赖于SENP3活性。

功能上，过表达野生型ASS1增强了H/R诱导的凋亡，而SUMO化缺陷的ASS1-2KR突变体的促凋亡作用减弱。在SENP3敲低条件下，回补野生型ASS1仍能促进凋亡，但ASS1-2KR突变体则无法发挥促凋亡作用。这些结果表明H/R诱导的ASS1核聚集及其促凋亡功能依赖于SENP3介导的去SUMO化。

ASS1去SUMO化通过增强p53转录活性诱导凋亡

ASS1抑制剂MDLA处理或ASS1敲低均能减轻H/R诱导的凋亡。研究人员推测核内去SUMO化的ASS1可能通过促进Trp53(p53基因)的转录激活来增强凋亡。实验证实，H/R处理增加了p53与ASS1的共定位，并增强了Trp53转录活性，这些效应可被SENP3或ASS1敲低所减弱。而过表达SENP3则进一步放大了H/R后的Trp53转录，催化失活的SENP3-C526S突变体效果与野生型SENP3类似。体内实验也显示SENP3缺陷降低了IRI后肾组织中的p53表达。mRNA测序和RT-qPCR验证了H/R处理后TCMK1细胞中Trp53及其下游靶标Bid的表达上调，且该调控依赖于SENP3的去SUMO化活性。

本研究系统阐明了SENP3-ASS1-p53轴在肾IRI诱导的细胞凋亡中的关键作用。研究人员发现肾缺血/再灌注应激上调SENP3表达，后者通过去SUMO化修饰ASS1(主要位点为K239和K310)，促进ASS1核转位，进而增强p53转录活性，最终激活内源性凋亡通路导致肾小管上皮细胞死亡。

这项研究的科学意义在于首次将ASS1鉴定为SUMO2/3修饰的关键靶蛋白，并揭示了其在肾脏IRI中的促凋亡功能，颠覆了以往在某些肿瘤研究中ASS1作为抑癌基因的传统认知，体现了蛋白质功能的背景依赖性。研究结果强调了SUMO化稳态在肾脏保护中的重要性，提示增强ASS1的SUMO化修饰可能成为干预IRI诱导的急性肾损伤的新策略。此外，该研究为理解蛋白质SUMO化修饰在器官缺血再灌注损伤中的复杂角色提供了新的视角，SENP3-ASS1-p53信号轴有望成为未来肾脏保护治疗的潜在靶点。

当然，研究也存在一些局限性，例如虽然发现SENP3和SENP5在IRI中均上调，但只深入研究了SENP3；质谱鉴定的16个潜在SUMO化靶蛋白中仅聚焦于ASS1；ASS1核转位后的具体分子机制仍需进一步探索。这些未解之谜为后续研究指明了方向，也将推动我们对肾脏IRI分子机制的更全面理解。