内质网连续性破坏通过核膜张力介导的机械转导激活炎症信号

本研究针对核膜机械转导（NMMT）中内质网（ER）与核膜（NM）连续性的作用机制这一长期未解之谜，开发了新型Ca2+不敏感的核膜张力（TINM）生物传感器ALPIN，发现ER在细胞应激下通过囊泡化破坏与核膜的连续性，从而解除对TINM的缓冲作用，促进cPLA2在核内膜（INM）上的吸附及后续炎症脂质信号通路激活，这一机制在低渗应激、铁死亡及斑马鱼伤口模型中均得到验证，为理解细胞损伤与炎症反应的联系提供了新视角。

细胞在不断重塑自身形态的过程中，常常面临各种机械应力威胁。质膜机械转导机制能够敏锐感知细胞表面的微小形变，而核膜机械转导（NMMT）则在细胞遭受严重挤压、急剧低渗肿胀等导致核膜（NE）受压和拉伸的应激状态下被激活。这种差异提示核膜可能专门用于检测可能危及细胞完整性的整体形变。

在核膜机械转导通路中，胞质磷脂酶A₂（cPLA₂）是关键效应分子。cPLA₂通过其Ca²⁺依赖的膜结合C2结构域和催化位点上的保守疏水残基，吸附到核膜张力（T_INM）诱导的脂质包装缺陷（LPDs）上，从而从核膜释放花生四烯酸，进而生成前列腺素、白三烯等强效炎症脂质介质。cPLA₂-NMMT通路已被报道在白细胞渗透压监测、胚胎细胞迁移、树突状细胞趋化等生理过程中发挥重要作用。

然而，核膜机械转导的一个基本前提——强烈的核变形会导致T_INM升高——一直存在争议。内质网（ER）作为与核膜相连的巨大膜系统，理论上可以作为核膜的膜面积储备库。如果连续的内质网能够像大型核膜储库一样发挥作用，那么在这个储库耗尽之前可能不会产生明显的T_INM。如果内质网通过补偿性膜流瞬间消除T_INM，那么核膜机械转导将不可能发生。但是，内质网是否以及如何影响T_INM和NMMT，此前从未经过实验验证。

为了解决这一关键问题，研究人员开展了一项创新性研究。他们开发了一种不依赖Ca²⁺的核内脂质包装探针"核内两亲性脂质包装结构域"（ALPIN），使得在有无连续内质网的情况下监测核肿胀过程中的T_INM动态成为可能。

关键技术方法

研究主要采用了多种先进的成像和分析技术：使用新型基因编码的Ca²⁺不敏感T_INM生物传感器ALPIN（基于ARFGAP1的ALPS结构域）监测核膜张力；通过细胞低渗肿胀和透化实验模拟核膜张力变化；利用结构化照明超分辨显微镜（SIM）和荧光漂白后恢复（FLIP）技术观察ER形态和核膜连续性；建立斑马鱼尾部鳍伤口模型进行在体验证；并开发了自定义Python脚本进行3D图像分析和核膜结合定量。

ER-核膜连续性破坏与T_INM升高相关

研究人员首先通过共聚焦时间推移成像发现，在低渗应激的哺乳动物细胞中，cPLA₂-INM吸附与ER形态变化（ER面积减少和环形度增加）高度相关。超分辨成像确认低渗应激导致ER囊泡化，从而将ER与NE分离。FLIP实验进一步证明，囊泡化的ER与NE之间的标记物扩散交换完全被阻断，表明ER-NM连续性被严重破坏。

ALPIN实现不依赖Ca²⁺的T_INM动态监测

为了解耦Ca²⁺在cPLA₂感应T_{INM和破坏ER中的双重作用，研究团队开发了ALPIN传感器。该传感器基于ARFGAP1的ALPS（两亲性脂质包装传感）结构域，能够像cPLA2的C2结构域一样感应TINM诱导的LPDs，但不依赖Ca²⁺。研究人员构建了ALPIN1（单个ALPS基序）和ALPIN2（双ALPS基序）版本，均带有三重核定位信号（3xNLS）。}

低渗休克可引起部分核仁溶解以及ALPIN1在INM上的吸附。与cPLA₂类似，ALPIN1在急性期显示可逆的膜吸附，在预裂解期则呈现持续的INM结合。重要的是，ER囊泡化和INM吸附之间存在相关性，这与cPLA₂的观察结果一致，但ALPIN1的反应不依赖Ca²⁺。

ER在核肿胀过程中有限缓冲T_INM

为了深入研究ER-NM连续性如何影响T_INM，研究团队在透化细胞 assay 中追踪了ALPIN1。该 assay 可以独立改变Ca²⁺水平和胶体渗透应激（ΔΠ_colloid）。结果显示，即使存在连续的ER，也能观察到ALPIN1-INM吸附对胶体渗透休克的响应，表明来自ER的补偿性膜流可以缓解但不能完全防止T_INM。

当通过微摩尔级Ca²⁺切断ER膜储库与核的联系时，ALPIN1-INM吸附持续较高。这些数据表明，即使ER-NM接触完整，ER对T_INM的缓冲也是不完全的。

ER片段化和NMMT在临界应激下被触发

即使在胶体渗透平衡（2.5% PVP）条件下保持透化细胞，使其细胞核不显示明显肿胀，Ca²⁺依赖的ER囊泡化也能促进ALPIN1-INM吸附。这表明T_INM的升高不仅发生在核水流入速度超过ER供应的膜面积时，也可能发生在ER-外核膜（ONM）囊泡化从连续的ONM-核周ER撤走膜时，减少了容纳给定核体积所需的可及面积。

铁死亡和组织损伤中的ER破坏

研究进一步发现，在GPX4抑制剂ML162诱导的铁死亡细胞中，约40分钟後开始出现持续的核收缩和ER囊泡化，同时伴有ALPIN1/cPla₂在INM上的吸附，这与低渗应激的预裂解阶段相似。核收缩伴随NE平滑化，排除了松弛的可能性。

在斑马鱼尾部鳍伤口模型中，通过共聚焦显微镜同时成像cPla₂易位（cPla₂-mKate2）和ER形态（eGFP-KDEL）。直接位于损伤区的上皮细胞显示即时、不可逆的ER碎片化和永久的cPla₂易位，而在较远的细胞中则显示可逆的cPla₂招募而无ER破坏。

研究结论与意义

这项研究利用不依赖Ca²⁺的T_INM传感器ALPIN揭示，内质网作为应激/Ca²⁺门控的核膜缓冲器，在稳态条件下抑制核膜机械转导。这种NMMT制动在临界应激时被释放。受损细胞中持续的ER囊泡化将细胞核锁定在高张力状态，稳定cPla₂在INM上的结合——这发生在细胞技术上讲仍然存活的时期，并持续到细胞死亡之后。

重要的是，cPla₂-NMMT通路是一种超越细胞死亡的机制，不专门与特定类型的应激（如ΔΠ）或细胞活力/死亡相关联——它是一个简单的物理过程，仅依赖于Ca²⁺和伴随的核加压。它可以在质膜完整性不可逆丧失、释放免疫原性分子到细胞外空间促进典型损伤相关分子模式（DAMP）信号传导之前的数小时，就触发修复性机制（修复、炎症等）。

该研究不仅巩固了核变形激活cPla₂的生物力学基础，还将细胞死亡诱导的ER破坏确定为额外的核膜机械转导触发器，为理解组织损伤、细胞应激与炎症反应之间的内在联系提供了新的理论框架。