在哺乳动物雌性个体中，两条X染色体如何实现基因表达剂量的平衡调控，一直是发育生物学领域的核心谜题。X染色体失活（XCI）作为重要的表观遗传调控机制，通过Xist非编码RNA介导其中一条X染色体的转录沉默。然而令人困惑的是，有3%-11%的X连锁基因能够逃脱这种沉默效应，在不同细胞类型和个体间呈现可变表达模式。这些"逃逸基因"对性别二态性特征形成和疾病易感性具有重要影响，但其调控机制尚不明确。传统观点认为Xist的功能仅限于早期胚胎发育的特定时间窗口，但近年研究发现Xist缺失会导致已沉默基因的再激活，暗示Xist可能在生命后期持续发挥调控作用。为验证这一假说，欧洲分子生物学实验室等机构的研究团队在《Nature Cell Biology》发表重要研究成果，系统阐明了XistRNA在分化细胞和胚胎发育后期对逃逸基因的直接调控作用。研究团队主要采用等位基因特异性RNA测序、条件性基因表达调控系统和三维基因组分析等技术手段。通过构建携带四环素诱导型Xist基因的转基因小鼠模型，结合神经前体细胞（NPCs）、星形胶质细胞分化体系，以及胚胎体外培养系统，实现了对Xist表达水平的精确时序控制。利用单胚胎RNA测序、Capture Hi-C、CUT&RUN和酶甲基化测序等方法，从转录组、三维基因组和表观遗传多个层面解析Xist的功能机制。Increased Xist RNA levels can silence Xi escapee genes in NPCs研究人员首先在21个克隆性神经前体细胞系中发现Xist RNA水平与逃逸基因表达呈显著负相关。通过四环素诱导Xist表达，证实Xist上调能剂量依赖性地沉默逃逸基因，且沉默动力学因基因类别而异：组成型逃逸基因抵抗性最强，而NPC特异性逃逸基因最敏感。值得注意的是，相邻逃逸基因表现出协同沉默特征，提示局部染色质环境的影响。Xist RNA can initiate XCI of escapees in terminally differentiated astrocytes在终末分化的非分裂星形胶质细胞中，Xist上调同样能有效沉默逃逸基因，证明该功能不依赖于细胞分裂。但沉默动力学较分裂细胞缓慢，提示细胞周期可能影响表观遗传重塑效率。Xist RNA-mediated silencing of escapees in NPCs is SPEN dependent通过auxin诱导的SPEN蛋白降解系统，研究人员发现Xist介导的逃逸基因沉默完全依赖于SPEN蛋白。在SPEN缺失情况下，即使Xist高水平表达也无法引发基因沉默，表明SPEN是Xist功能的核心效应因子。Xist-mediated silencing of escapees leads to loss of TAD-like domains on the XiCapture Hi-C分析显示，逃逸基因簇所在的拓扑关联结构域（TAD）在Xist上调后逐渐消失，且该过程与基因沉默直接相关。在SPEN缺失或胚胎干细胞中，Xist表达不引起TAD结构变化，证实三维基因组重塑是基因沉默的结果而非原因。Silencing of most facultative escapees becomes Xist independent after prolonged Xist upregulation时序实验表明，Xist介导的沉默存在从可逆到不可逆的转变。短期（7天）Xist上调后沉默是可逆的，而长期（14-21天）诱导导致大部分兼性逃逸基因不可逆沉默，且与DNA甲基化积累相关。Irreversible silencing of escapees is associated with DNA methylation at promoters and H3K27me3 enrichment表观遗传分析发现，不可逆沉默伴随着启动子区CpG岛甲基化增加和基因体甲基化丢失。H2AK119Ub修饰随Xist水平可逆变化，而H3K27me3在不可逆沉默基因中持续存在，提示多梳蛋白复合物在维持沉默状态中的特殊作用。Xist RNA levels modulate X-linked escapee gene expression in vivo在植入前后胚胎中验证发现，Xist上调能显著抑制逃逸基因表达，且组织特异性逃逸基因对Xist敏感性各异，证实该调控机制在生理环境下的普适性。本研究突破性地揭示了XistRNA在发育时间窗口之外持续调控X染色体活性的新功能，阐明了SPEN依赖性的基因沉默机制和三维基因组重塑规律。发现不仅深化了对剂量补偿机制的理解，更重要的是为性别特异性疾病的治疗提供了新思路：通过调控Xist水平可能实现对X连锁基因表达谱的精确编辑，为Rett综合征、X连锁免疫疾病等性别二态性疾病的干预策略开辟了新途径。
