水稻类受体激酶OsVIRK1在反式高尔基体网络/早期内体识别病毒蛋白并激活抗病毒免疫的新机制

本研究报道了水稻类受体激酶OsVIRK1在反式高尔基体网络/早期内体(TGN/EE)识别水稻条纹病毒(RSV)外壳蛋白(CP)和非结构蛋白3(NS3)，通过激活防御基因表达和磷酸化抑制NS3的RNA沉默抑制活性，从而增强水稻抗病毒能力。该发现揭示了植物细胞内免疫识别新机制，为作物抗病毒育种提供了新靶点。

在植物与病原体长期博弈的进化过程中，植物发展出了精密的免疫监测系统。当细菌、真菌等病原体入侵时，植物细胞表面的模式识别受体(PRR)能够识别病原体相关分子模式(PAMP)，触发第一层免疫反应——模式触发免疫(PTI)。然而，对于专性寄生于细胞内的病毒，植物如何感知其存在并启动有效的抗病毒防御，特别是是否存在类似PRR的受体能够识别病毒成分，一直是植物免疫领域悬而未决的关键科学问题。

水稻条纹病毒(RSV)是亚洲水稻产区最具破坏性的病毒之一，属于纤细病毒属，其负链RNA基因组编码多个蛋白，包括外壳蛋白(CP)和作为RNA沉默抑制子的非结构蛋白3(NS3)。尽管前期研究表明CP可能作为免疫激发子，但植物细胞识别CP的具体分子机制尚不明确。同时，病毒为逃逸宿主防御，往往利用NS3等蛋白抑制RNA沉默这一核心抗病毒途径。因此，揭示植物细胞内病毒感知机制和病毒反防御机制的调控原理，对于发展可持续的病毒防控策略具有重要意义。

发表在《Cell Discovery》上的这项研究，由中国科学院微生物研究所的严永胜团队主导，发现了一个定位于反式高尔基体网络/早期内体(TGN/EE)的水稻类受体激酶OsVIRK1，能够直接识别RSV的CP和NS3蛋白，并通过双重机制抑制病毒感染：一方面介导CP触发的防御基因表达，另一方面磷酸化NS3从而抑制其RNA沉默抑制活性。

研究团队综合运用了分子生物学、细胞生物学和生物化学等多学科技术方法。主要包括：利用CRISPR/Cas9技术构建OsVIRK1基因敲除和过表达水稻材料，通过病毒接种实验评估抗病表型；采用膜蛋白分离、共聚焦显微镜观察和分子互作实验(Co-IP、GST pull-down、BiFC)分析蛋白亚细胞定位和相互作用；通过体外激酶实验、Phos-tag SDS-PAGE和质谱分析研究磷酸化修饰；利用GFP转基因本氏烟叶片系统评估NS3的RNA沉默抑制活性；通过转录组测序(RNA-seq)分析防御基因表达谱。

OsVIRK1正向调控水稻对RSV的抗性

研究人员首先发现RSV感染可诱导OsVIRK1基因表达。通过CRISPR/Cas9技术获得的osvirk1突变体对RSV表现出高度感病性，病毒积累量显著增加；而过表达OsVIRK1的转基因水稻则增强了对RSV的抗性。

OsVIRK1定位于质膜和TGN/EE

OsVIRK1编码一个富含半胱氨酸的类受体激酶(CRK)，包含信号肽、两个DUF26结构域的胞外区、跨膜区和胞内激酶区。亚细胞定位显示OsVIRK1-GFP既定位于质膜(PM)，也出现在细胞内点状结构，这些点状结构与TGN/EE标记蛋白SCAMP1完全共定位。

OsVIRK1的自磷酸化和氧化还原调控维持其蛋白积累

体外和体内实验证实OsVIRK1具有激酶活性，能够发生自磷酸化。激酶活性缺失突变体OsVIRK1^K391E和六个自磷酸化位点突变体OsVIRK1^6A蛋白积累显著降低。同时，OsVIRK1通过DUF26结构域中四个保守半胱氨酸残基发生氧化还原调控，形成高分子量复合物，这一过程对维持蛋白稳定性至关重要。

OsVIRK1在TGN/EE与RSV CP发生物理互作

通过Co-IP、GST pull-down和BiFC等多种技术证实OsVIRK1与RSV CP在TGN/EE发生直接相互作用。这种相互作用不依赖于CP的RNA结合能力，但CP自相互作用区域对其积累至关重要。

OsVIRK1是CP触发防御基因表达所必需的

转录组分析显示，CP处理可诱导野生型水稻原生质体中861个差异表达基因(DEG)，其中472个上调基因主要富集于细胞生长、代谢和防御相关通路。而在osvirk1突变体中，CP触发的防御基因上调表达显著减弱，表明OsVIRK1是CP激活防御基因表达的关键元件。

OsVIRK1在TGN/EE与RSV NS3发生物理互作

研究发现OsVIRK1不仅识别CP，还能与RSV的RNA沉默抑制子NS3在TGN/EE直接互作。这种相互作用不依赖于CP的存在，且OsVIRK1的N端和C端区域均能独立与NS3结合。

OsVIRK1磷酸化RSV NS3抑制其RNA沉默抑制活性

体外激酶实验证实OsVIRK1可直接磷酸化NS5，质谱分析鉴定出S117、T118、T133、S182和S188五个主要磷酸化位点。在16c本氏烟系统中，OsVIRK1通过降低NS3蛋白积累并改变其亚细胞分布（从细胞质和核分布转变为主要定位于核），从而抑制NS3的RNA沉默抑制功能。磷酸模拟突变体NS3^5D表现出与野生型NS3相似的核定位特征和功能缺失表型。

这项研究首次揭示了植物类受体激酶在细胞内区室识别病毒蛋白并激活抗病毒免疫的新机制。OsVIRK1定位于TGN/EE，作为双重功能受体：一方面感知病毒CP并激活下游防御基因表达，另一方面通过磷酸化修饰病毒RNA沉默抑制子NS3，改变其亚细胞分布并抑制其反防御功能。这一发现不仅拓展了人们对植物细胞内免疫识别机制的认识，也为理解病毒与宿主在细胞内区室的相互作用提供了新视角。OsVIRK1介导的免疫途径可能代表了一种不同于典型PTI的非经典抗病毒机制，其通过整合模式识别和病毒反防御抑制双重策略，为作物抗病毒育种提供了新的分子靶标和理论依据。