Cas9通过感知CRISPR RNA丰度调控CRISPR间隔序列获取的新机制及其在细菌免疫记忆维持中的作用

本研究揭示了Cas9蛋白在缺乏crRNA和tracrRNA时的全新生物学功能——作为CRISPR间隔序列获取的调控因子。研究人员发现，当crRNA水平较低时，apoCas9（无RNA结合的Cas9）能够显著增强间隔序列获取效率，这一机制在CRISPR阵列新生或自然缩短时尤为重要。该研究不仅阐明了Cas9作为crRNA丰度传感器和间隔获取调节因子的双重角色，还为理解细菌如何动态维持免疫记忆深度提供了新见解。相关成果发表于《Nature》，对CRISPR-Cas9系统的进化研究和生物技术应用具有重要启示。

在微生物与病毒军备竞赛的漫长演化过程中，原核生物发展出了精妙的CRISPR-Cas适应性免疫系统。这一系统通过获取外源DNA片段（称为间隔序列spacer）作为"免疫记忆"，并利用这些记忆指导Cas蛋白识别和切割再次入侵的病原体。然而，一个长期未解的谜团是：细菌如何调控间隔序列的获取效率？特别是在CRISPR阵列新生或自然缩短时，细菌如何快速重建免疫记忆库？这项发表在《Nature》上的研究给出了令人惊喜的答案——Cas9蛋白竟能感知CRISPR RNA（crRNA）丰度来动态调节间隔序列获取。

研究团队以脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的II-C型CRISPR-Cas系统为模型，结合噬菌体感染实验、基因编辑和高通量测序等技术，发现当细胞缺乏crRNA和/或tracrRNA时，apoCas9（未结合RNA的Cas9）会显著刺激间隔序列获取效率。这一现象在生理状态下尤为关键：当细菌的CRISPR阵列较短（如新生阵列或自然缩短的阵列）时，低水平的crRNA使更多Cas9处于apo状态，从而上调间隔获取以快速扩充小型"免疫记忆库"；随着CRISPR阵列扩展，升高的crRNA水平又通过减少apoCas9的可用性来抑制获取，从而降低因过度获取导致自身免疫的风险。

关键技术方法包括：构建系列CRISPR阵列长度变异株模拟阵列进化过程；利用噬菌体MDAΦ感染模型研究天然获取；通过Northern blot定量crRNA水平；开发适应性PCR结合高通量测序检测新间隔序列；蛋白质有限酶解实验分析Cas9构象变化；以及多种Cas9结构域缺失突变体的功能验证。

研究结果部分：

"Cas9 enables PAM-compliant acquisition"显示，脑膜炎奈瑟菌CRISPR-Cas9能限制MDAΦ溶原化，并通过Cas1-Cas2过表达系统证实新获取的病毒间隔序列具有典型的N₄GATT PAM（原间隔序列邻近基序）特征。Cas9的PAM相互作用域（PID）对间隔获取的PAM选择至关重要，但不需要其核酸酶活性。

"Loss of tracr or crRNA boosts adaptation"部分揭示，删除tracrRNA基因或构建仅含单个重复的R26突变体（模拟crRNA缺失）均导致"超级适应"现象，间隔获取效率提升10倍。这一现象依赖于Cas9但独立于CRISPR干扰活性，表明这两种RNA是获取效率的负调控因子。

"ApoCas9 stimulates adaptation efficiency"通过生化实验证实，apoNmeCas9能形成稳定的核糖核蛋白复合体，且其构象在RNA加载前后发生显著变化。互补实验证明，只有同时恢复tracrRNA和crRNA（或sgRNA）才能逆转超级适应现象，确立了两者作为调控开关的角色。

"Domain requirements for super-adaptation"通过系统删除Cas9各结构域发现，仅含核酸酶结构域（NUC lobe，包括HNH、RuvC和WED/PID结构域）的Cas9突变体仍能刺激获取，而缺失REC结构域的突变体则不受RNA调控，揭示了功能域分工的分子基础。

"ApoCas9 assists CRISPR array neogenesis"部分显示，模拟CRISPR新生过程的系列阵列长度变异株中，获取效率与阵列长度呈强负相关（从单重复阵列的31%降至长阵列的4-6%）。在天然阵列缩短的逃逸株中，crRNA水平降低同样伴随获取效率提升，证实这是生理相关的调控机制。

"ApoCas9's role across II-C systems"将发现扩展到7种II-C型Cas9直系同源物，证明这一调控机制在进化上的保守性（除空肠弯曲菌Cas9外），为理解CRISPR-Cas系统的适应性进化提供了新视角。

这项研究从根本上扩展了Cas9的生物学功能，首次揭示其独立于RNA伴侣和核酸酶活性的新角色。发现的自动补充反馈机制解释了细菌如何通过Cas9感知crRNA水平来动态维持最佳免疫记忆深度——在阵列缩短时快速补充记忆，在阵列扩展时避免过度获取导致的自身免疫风险。这些发现不仅深化了对原核生物适应性免疫的理解，也为开发基于CRISPR的分子记录和谱系追踪工具提供了新思路。特别值得注意的是，这种通过蛋白质感知RNA水平来调控DNA获取的机制，可能代表了原核生物中一种广泛存在的基因表达调控范式。