衰老细胞清除剂耐药性亚群具有独特的SASP谱与功能影响：开发衰老细胞增敏剂的路径
1 引言
细胞衰老（Cellular Senescence）是一种与衰老、多种疾病及生理功能障碍密切相关的细胞命运。衰老细胞（Senescent Cells, SCs）具有增殖停滞、抵抗凋亡及分泌衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）等特征。SASP是一系列促炎因子、趋化因子、蛋白酶和生长因子的复杂混合物，在生理条件下可促进组织修复，但若衰老细胞持续存在，则会驱动慢性炎症、组织功能障碍及多种年龄相关疾病。
衰老细胞清除剂（Senolytics）是一类能够选择性清除衰老细胞的药物，其作用机制是短暂抑制衰老细胞抗凋亡通路（Senescent Cell Anti-apoptotic Pathways, SCAPs），从而诱导衰老细胞凋亡。然而，现有的衰老细胞清除剂通常只能清除30%至70%的衰老细胞，这意味着存在一个对清除剂具有耐药性的衰老细胞亚群。目前，关于这一“清除剂耐药性衰老细胞”（Senolytic-resistant SCs）亚群的性质、SASP特征及其在体内的功能影响尚不明确。本研究旨在深入探究这一亚群的特性，并探索将其转化为清除剂敏感性亚群的策略，为开发更有效的衰老干预手段奠定基础。
2 材料与方法
2.1 细胞培养与衰老诱导
研究主要使用人前脂肪细胞（Preadipocytes）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。通过20 Gy X射线照射诱导细胞衰老，并在照射后30天进行实验，此时超过70%的细胞呈现衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色阳性，且SASP因子表达显著升高。
2.2 衰老细胞清除剂处理
使用达沙替尼（Dasatinib）和槲皮素（Quercetin）作为衰老细胞清除剂。将衰老细胞暴露于清除剂24小时后，洗去药物，继续培养3天，存活的细胞被定义为“清除剂耐药性衰老细胞”。
2.3 分子生物学分析
通过实时荧光定量PCR（rt-PCR）和RNA测序（RNA-seq）分析基因表达谱。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和多重细胞因子检测分析SASP因子分泌。通过TUNEL染色和caspase-3活性检测评估细胞凋亡。
2.4 体内功能研究
将人衰老前脂肪细胞（总衰老细胞群或清除剂耐药性亚群）移植入年轻SCID-beige小鼠腹腔，一个月后通过握力测试和悬吊耐力测试评估小鼠的生理功能。
2.5 统计学分析
数据以均数±标准差（SD）或均数±标准误（SEM）表示。组间比较采用Student's t检验或单因素方差分析（ANOVA），p < 0.05认为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 SASP与衰老细胞清除剂清除效率相关
研究发现，使用JAK/STAT抑制剂鲁索替尼（Ruxolitinib）抑制SASP的促炎成分，会降低达沙替尼对衰老细胞的清除效率，使细胞变得“清除剂耐药”。相反，使用脂多糖（LPS）等病原体相关分子模式（PAMP）因子处理衰老细胞，增强其促炎SASP，则能提高衰老细胞清除剂的杀伤效果。这表明SASP的促炎/促凋亡特性与衰老细胞对清除剂的敏感性密切相关。
3.2 衰老细胞清除剂在体内靶向促炎/促凋亡亚群
在肥胖小鼠模型中，达沙替尼和槲皮素联合治疗选择性地减少了脂肪组织中表达高水平促炎/促凋亡SASP因子的衰老前脂肪细胞亚群，而对其他细胞亚群影响较小。这证实了衰老细胞清除剂在体内确实优先清除具有组织破坏性SASP的衰老细胞亚群。
3.3 清除剂耐药性衰老细胞具有经典衰老标志
与总衰老细胞群相比，清除剂耐药性衰老细胞亚群在细胞周期抑制标志物（p16INK4a、p21CIP1）、DNA损伤标志物（γ-H2AX）和SA-β-gal活性等方面均无显著差异，表明它们同样是真正的衰老细胞，而非非衰老细胞。
3.4 清除剂耐药性衰老细胞具有独特的SASP谱
RNA测序和功能富集分析显示，清除剂耐药性衰老细胞的SASP谱与总衰老细胞群存在显著差异。该亚群促炎/促凋亡因子（如IL-6、IL-8、CXCL1）的表达和分泌水平较低，而生长/促纤维化相关因子的表达相对较高。此外，该亚群高表达糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（GPNMB），这是一种与免疫逃逸相关的信号分子。
3.5 清除剂耐药性衰老细胞诱导炎症和mtDNA释放的能力较弱
与总衰老细胞群相比，清除剂耐药性衰老细胞的条件培养基诱导非衰老细胞产生炎症反应的能力更弱。同时，该亚群释放到细胞外的线粒体DNA（mtDNA）也显著减少，而mtDNA是SASP诱导炎症的关键介质之一。
3.6 移植清除剂耐药性衰老细胞亚群导致的生理功能障碍更弱
将清除剂耐药性衰老细胞移植入年轻小鼠体内，与移植总衰老细胞群相比，小鼠的握力下降和悬吊耐力减弱程度均显著减轻。这表明清除剂耐药性衰老细胞亚群在体内的致病性相对较低。
3.7 序贯治疗策略增强对三阴性乳腺癌细胞的清除
基于上述发现，研究团队提出了一种“1-2-3-4”序贯治疗策略：先使用化疗药物（如顺铂）诱导肿瘤细胞衰老，再使用衰老细胞清除剂（如达沙替尼）清除清除剂敏感性亚群，接着使用Toll样受体3（TLR3）激动剂（如poly(I:C)）作为“衰老细胞增敏剂”（Senosensitizer）将剩余的清除剂耐药性亚群转化为敏感性状态，最后再次使用衰老细胞清除剂进行清除。初步实验表明，该策略能显著增强对三阴性乳腺癌细胞的杀伤效果。
4 讨论
本研究首次系统性地揭示了衰老细胞清除剂耐药性亚群的独特性质。该亚群虽然同样是衰老细胞，但其SASP谱更倾向于促生长和促修复，而非促炎和促凋亡，因此对衰老细胞清除剂的敏感性较低，且在体内诱导的生理功能障碍也相对较弱。
这一发现具有重要的临床意义。首先，它解释了为什么现有的衰老细胞清除剂只能部分清除衰老细胞，为开发更全面的衰老干预策略提供了理论基础。其次，它揭示了清除剂耐药性衰老细胞亚群可能在某些病理条件下（如感染、肿瘤）被激活，从而转化为致病性更强的状态。因此，开发能够靶向这一亚群的“衰老细胞增敏剂”，或将其与现有衰老细胞清除剂联合使用，有望实现更彻底、更安全的衰老细胞清除，为治疗年龄相关疾病和癌症提供新的思路。
