基于片段化合物筛选揭示WRN解旋酶结构灵活性并发现变构抑制剂

本研究针对WRN解旋酶靶点开发抑制剂面临的挑战，采用基于片段的先导化合物发现策略，通过生物物理筛选和结构生物学方法，发现了WRN的新型变构结合口袋和多个构象状态，成功将片段化合物优化为具有微摩尔级抑制活性的先导化合物，为治疗微卫星不稳定性高的癌症提供了新途径。

癌症治疗领域一直致力于寻找能够特异性杀死癌细胞而不伤害健康细胞的靶向疗法。合成致死（synthetic lethality）策略为此提供了新思路，即当两个基因同时发生突变会导致细胞死亡，而单个基因突变则不会。WRN解旋酶作为DNA损伤修复的关键蛋白，在微卫星不稳定性高（MSI-H）和错配修复缺陷（MMRd）的癌细胞中表现出合成致死效应，使其成为极具潜力的抗癌靶点。

然而，开发WRN抑制剂面临巨大挑战。传统的基于生化实验的高通量筛选往往产生大量假阳性结果，且WRN高度保守的ATP结合口袋难以结合类药分子。已有报道的WRN抑制剂如ML216和NSC化合物后来被发现是通过非特异性机制或共价标记发挥作用，而非特异性结合WRN。这些挑战促使研究人员寻求新的策略来攻克这一难题。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Rachel L. Palte、Mihir Mandal、Justyna Sikorska等研究人员采用基于片段的先导化合物发现（FBLD）策略，成功识别出WRN的新型变构抑制剂。他们通过结合生物物理筛选方法和结构生物学技术，不仅发现了新的结合位点，还揭示了WRN解旋酶前所未有的结构灵活性，为开发针对这一挑战性靶点的有效抑制剂开辟了新途径。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：利用含氟片段的¹⁹F NMR筛选和表面等离子共振（SPR）技术进行初步结合活性筛选；通过X射线晶体学解析WRN与片段化合物的复合物结构；使用ADP-Glo试剂盒测定化合物对WRN ATP酶活性的抑制效果；通过分子对接模拟化合物与靶点的相互作用模式。所有蛋白样品均通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备，并经过多步色谱纯化获得高纯度蛋白。

片段筛选鉴定WRN的变构结合剂

研究人员首先采用平行筛选策略，分别利用基于生物分子核磁共振（bioNMR）和表面等离子共振（SPR）的方法对内部片段库进行筛选。在bioNMR研究中，他们筛选了1020个含氟片段，通过T₂弛豫CPMG实验鉴定初级命中化合物，并采用四种正交的NMR方法进行验证。SPR筛选则针对500个非含氟片段，根据结合占有率和结合曲线特征对命中化合物进行分级。尽管初始片段在高达100μM浓度下未能显著抑制WRN活性，但X射线晶体学结构显示其中三个片段结合在Form B变构口袋中，为后续优化提供了起点。

配体结合结构展示WRN灵活性及额外变构口袋

研究人员使用截短的WRN构建体（残基500-942）建立了可重复的结晶系统。片段1与WRN的复合物结构显示，该片段结合在最近发现的变构口袋中，此时WRN的两个ATP酶结构域D1和D2相对于彼此旋转了约180°，他们将其命名为WRN Form D。值得注意的是，Form D构象也可以在无配体情况下获得，说明这是WRN固有的构象状态。此外，研究人员还发现了一个新的变构口袋（由片段3结合）以及片段4在残余ATP结合口袋中的结合模式，展示了FBLD方法在发现新颖结合位点方面的强大能力。

基于结构指导的片段1系列演化实现功能性抑制并发现WRN Form E

基于片段1和片段2的结构信息，研究人员通过虚拟库生成和分子对接，设计了一系列能够同时与关键残基Arg732、Tyr849、Arg857和Arg910相互作用的化合物。通过系统优化，他们获得了化合物3，其对WRN的ATP酶抑制活性提高了10倍以上，并显示出对BLM的选择性。进一步优化得到的化合物4表现出1.2μM的IC₅₀值和近100倍的对BLM选择性。令人惊讶的是，化合物5与WRN的共结晶结构揭示了一个全新的构象状态——WRN Form E，尽管其结合模式与母体化合物3几乎相同，但ATP酶结构域呈现出不同的相对取向。

讨论

本研究成功展示了FBLD策略在攻克挑战性靶点方面的价值。与传统高通量筛选方法相比，FBLD能够提供更可靠的起点，减少假阳性结果的干扰。结构研究表明，WRN具有惊人的结构灵活性，其D1和D2结构域可以通过连接区域（残基Thr728-Asn734）的相对旋转， adopting多种不同的构象状态。这种灵活性可能与WRN在DNA解旋过程中独特的暂停和往复运动机制有关。

研究发现的Form D和Form E构象，虽然与已知的Form B构象相似，但在结构域取向和结合口袋细节上存在显著差异。这些构象状态可能代表了WRN在行使功能过程中的不同中间态，为理解其工作机制提供了重要线索。特别值得注意的是，临床候选化合物HRO761中也包含了本研究发现的N-[4-(三氟甲基)苯基]乙酰胺支架，独立验证了该变构结合位点的生物学相关性。

综上所述，本研究不仅为开发WRN抑制剂提供了高质量的化学起点，还深化了我们对RecQ解旋酶家族结构和功能关系的理解。随着对合成致死靶点探索的不断深入，WRN抑制剂的开发有望为MSI-H癌症患者带来新的治疗选择，同时为其他难靶向解旋酶的药物发现提供了可借鉴的方法学框架。