UBE3A缺失经ASNS过表达驱动持续神经元应激信号并介导Angelman综合征表型

Angelman综合征（Angelman syndrome，AS）是一种严重的神经发育障碍，由UBE3A缺失所致，该基因编码一种E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）。目前对AS机制的理解仍不充分，尤其是UBE3A底物与疾病表型之间的联系仍不确定。在此，研究人员利用UBE3A的功能获得性（gain-of-function，GOF）和功能丧失性（loss-of-function，LOF）突变，并结合无偏蛋白质组学（unbiased proteomics），发现天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）是UBE3A的靶标。研究人员发现，ASNS蛋白丰度在Ube3a缺失（Ube3a-null）小鼠脑内及人神经元中升高。对ASNS过量的遗传学纠正可挽救小头畸形（microcephaly）和许多行为缺陷（behavioural deficits）。详细分子分析表明，ASNS过量激活应激信号（stress signalling）并导致神经元蛋白合成（neuronal protein synthesis）全局性降低。研究结果提示，UBE3A缺失使神经元陷入持续应激状态，并在发育敏感期（developmentally sensitive periods）阻碍神经元生长。此外，研究结果提示，靶向ASNS和应激反应可能在Angelman综合征中具有治疗潜力（therapeutic potential）。

Angelman综合征（AS）是一种严重神经发育障碍，发病率约为1:20,000，特征包括智力障碍、发育迟缓、癫痫、小头畸形、面部畸形及独特行为表型；其由母源遗传的UBE3A拷贝缺失或突变所致。UBE3A是HECT（homologous to E6-AP C terminus）结构域E3泛素连接酶家族成员，在神经元中呈母源等位基因特异性印记表达，父源等位基因表观沉默。既往观点认为AS表型源于发育过程中UBE3A底物失调，尽管已提出众多候选底物，但确定其与AS表型的联系一直困难，限制了对该病机制的理解。因此，研究人员利用疾病相关UBE3A突变体、无偏蛋白质组学及遗传纠正策略，鉴定AS相关底物并检验其致病贡献；该研究发表于《Nature》。研究结论表明，ASNS是UBE3A的直接底物，UBE3A缺失导致ASNS过量，进而激活持续应激信号、降低神经元蛋白合成并阻碍神经元生长；遗传纠正ASNS过量可挽救小头畸形和多种行为缺陷，提示靶向ASNS及应激反应具有治疗潜力。

关键技术方法如下：利用表达UBE3A GOF/LOF突变的细胞系，结合SILAC（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，细胞培养稳定同位素氨基酸标记）、双甘氨酸（di-Gly）残基免疫亲和富集和LC-MS/MS（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，液相色谱-串联质谱）鉴定UBE3A底物；通过免疫共沉淀、体外泛素化反应及体内ASNS泛素化分析验证直接底物；将Asns^+/−小鼠与Ube3a^m−/p+小鼠杂交构建ASNS遗传纠正（Rescue）队列；采用行为学、LC-MS代谢组学、RNA-seq、p-eIF2α western blot、AAV（adeno-associated virus，腺相关病毒）介导ASNS过表达、BONCAT（bioorthogonal noncanonical amino acid tagging，生物正交非经典氨基酸标记）/FUNCAT（fluorescent noncanonical amino acid tagging，荧光非经典氨基酸标记）、多聚核糖体谱、脑重和神经元密度分析；并交叉比较既往患者来源AS神经元蛋白质组数据，样本来源包括两独立患者背景：母源15q11.2–q12缺失和母源UBE3A Q322X截短突变。

研究结果部分：

蛋白质组学鉴定UBE3A底物：研究人员在HEK293T细胞中表达UBE3A GOF/LOF突变体，采用SILAC、di-Gly纯化和质谱分析，四重复比较鉴定出23个候选底物；Western blot验证DNA-PKc、ASNS和RPL3受UBE3A调控，UBE3A敲低及MG132处理支持ASNS等为蛋白酶体依赖底物；与既往UBE3A共免疫沉淀结果及患者来源AS神经元上调蛋白交叉比较后，ASNS成为一致性最高的候选底物。

ASNS是UBE3A的直接底物：免疫共沉淀显示UBE3A与内源ASNS共纯化；体外泛素化反应中UBE3A催化ASNS形成高分子量泛素链并减少未修饰ASNS；UBE3A敲低使ASNS泛素化降低；ASNS赖氨酸突变分析提示天冬酰胺合成酶结构域内K467、K478和K504对ASNS降解重要；Ube3a^m−/p+小鼠海马ASNS泛素化降低约50%，海马和皮质ASNS蛋白升高而Asns mRNA不变，母源UBE3A GOF T485A（小鼠mT503A）使ASNS蛋白略降。

Asns表达富集于神经元：单细胞RNA-seq和空间转录组显示Asns广泛表达于兴奋性和抑制性神经元，而在非神经元细胞中大多缺失；免疫荧光显示ASNS蛋白在出生后皮质和海马神经元层富集，并与NeuN共定位，NPY阳性中间神经元均呈ASNS阳性，5-HT阳性及TH阳性神经元亚群呈异质性表达；Ube3a缺失在兴奋性和抑制性神经元中均轻度增加ASNS丰度。

纠正ASNS过量可挽救表型：研究人员将Asns^+/−与Ube3a^m−/p+杂交获得WT、Het、Angelman和Rescue四基因型，Rescue小鼠ASNS恢复至近WT水平；Rescue改善成年肥胖、开放场中心时间、后肢紧抱和埋珠行为，但未改善转棒表现和睡眠siesta缺失；Het小鼠在各行为学检测中与WT无差异。结论为许多但非全部AS表型由ASNS失调导致。

ASNS过量激活ISR：P21海马代谢组学显示Angelman小鼠天冬酰胺升高，Het和Rescue降低；Angelman小鼠苯丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸升高，Rescue回至基线；Western blot显示Angelman小鼠p-eIF2α（phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α，磷酸化真核翻译起始因子2α）升高至176.43±7.13% WT，Rescue改善至140.56±10.94% WT；AAV介导ASNS过表达足以增加神经元p-eIF2α。

ISR激活不通过AAR：P21皮质RNA-seq显示Angelman小鼠有1,717个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），Rescue有1,214个，其中805个重叠；GO（Gene Ontology，基因本体）分析显示下调基因涉及线粒体功能和蛋白合成，上调基因涉及神经元生长和突触功能；ISR基因集仅弱富集；与Slc7a5缺失小鼠比较未见氨基酸转运体、Atf4/Atf5及tRNA合成酶诱导；Eif2ak1（编码HRI，haem-regulated inhibitor，血红素调节抑制因子）在Angelman小鼠上调并在Rescue回至基线，HRI蛋白增加，ASNS过表达增加HRI但不激活GCN2、PERK和PKR。结论为ASNS过量经HRI-p-eIF2α而非氨基酸反应（amino acid response，AAR）激活ISR。

ASNS过量促进小头畸形：BONCAT体内AHA标记显示Angelman小鼠新蛋白合成降低约4–5倍，Rescue改善至约66% WT；多聚核糖体谱显示Angelman小鼠多聚核糖体/单核糖体比值降低至72.94±2.83% WT，Rescue改善；FUNCAT显示体外ASNS过表达使神经元AHA荧光降低约50%；P21脑重降低在Rescue改善，神经元密度异常亦改善。结论为ASNS过量触发ISR并降低蛋白合成，进而影响神经元生长和发育。

讨论部分总结：研究人员指出，AS相关UBE3A底物鉴定困难与UBE3A底物混杂及其对底物丰度影响温和有关；ASNS似乎是AS的主要贡献者，但ASNS纠正未挽救所有表型，提示其他底物也参与病理。蛋白质组学局限包括不能排除内源UBE3A与过表达UBE3A竞争结合底物，以及低丰度或快速降解蛋白可能欠代表，未来需更深覆盖。Asns表达主要限于神经元，与Ube3a神经元特异性印记一致；血脑屏障处天冬酰胺经System N双向易化转运，研究人员假设神经元依赖ASNS合成所需天冬酰胺，ASNS扰动可能是发育易感点。ASNS纯合缺失导致天冬酰胺合成酶缺乏症，而本研究显示Angelman小鼠ASNS蛋白升高，提示ASNS功能获得可导致异常表型；ASNS过表达足以增加p-eIF2α和HRI，遗传降低ASNS挽救蛋白合成及多种行为表型。Angelman小鼠脑内游离氨基酸升高与蛋白合成降低一致，但未发现AAR激活，唯一被Asns调节挽救的ISR相关基因为Eif2ak1/HRI；HRI在神经元蛋白稳态应激中诱导，结合UBE3A的蛋白酶体作用，提示蛋白稳态应激在AS病理中关键。研究还发现新蛋白合成和多聚核糖体分数降低而单核糖体分数未降，未来需研究单核糖体依赖翻译是否保留。治疗上，持续应激信号是AS病理核心，AS属于蛋白稳态破坏和应激信号增强为共同机制的神经发育障碍，靶向ASNS、HRI或ISR可能缓解部分症状，并可补充基因靶向治疗以提高安全性和有效性。

研究结论翻译：UBE3A缺失使神经元陷入持续应激状态，并在发育敏感期阻碍神经元生长；ASNS过量激活应激信号并导致神经元蛋白合成全局性降低，纠正ASNS过量可挽救小头畸形和许多行为缺陷；靶向ASNS和应激反应在Angelman综合征中具有治疗潜力。