转录组范围关联研究（transcriptome-wide association studies, TWAS）被广泛用于识别参与复杂性状的基因并推断基因对性状的效应方向。尽管其应用普遍，但目前仍不清楚TWAS能在多大程度上恢复基因对性状效应的真实方向。研究人员利用“基因表达升高通常应使蛋白表达升高”这一预期，估计TWAS对血浆蛋白的假阳性符号率（false sign rate, FSR）；并将该框架扩展到复杂性状，以功能缺失（loss-of-function, LoF）负担检验提供预期效应方向。两项分析均观察到与预期的高度不一致：TWAS对血浆蛋白的FSR为23%，对复杂性状为33%。研究人员提出，大量符号不一致产生于以下情形：非性状相关组织中的表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）通过紧密连锁的不同调控变异标记了全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）中的单倍型，从而产生“基因正确但效应方向不可靠”的虚假TWAS关联。这些发现表明，基于TWAS的效应方向估计应谨慎解释，并对TWAS整体的可靠性提出担忧。
论文发表在《Nature Genetics》。研究背景方面，全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）已发现大量复杂性状遗传关联，但把性状相关变异连接到因果机制仍很困难。转录组范围关联研究（transcriptome-wide association studies, TWAS）如FUSION、PrediXcan及相关方法SMR，借助顺式（cis）表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）把变异效应聚合为基因水平信号，从而识别可能驱动GWAS信号的基因，并进一步估计基因表达对性状的效应大小与方向。现有评估多关注因果基因的假发现率（false discovery rate, FDR），却很少检验TWAS能否正确恢复基因效应对性状的方向。由于效应方向直接关系基因调控网络、机制解释和药物靶点发现，方向误判会带来严重误导，因此研究人员开展本研究，系统评估TWAS的方向可靠性。
主要关键技术方法方面，研究人员使用GTEx构建跨47个组织的基因表达预测模型，并在UK Biobank（UKB）及UKB Pharma Proteomics Project（UKB-PPP）的2923个血浆蛋白、85个UKB复杂性状GWAS汇总数据中开展FUSION TWAS；以LoF与重复（duplication）负担检验作为基因效应方向的金标准；用coloc与coloc-SuSiE进行共定位（colocalization）和精细定位（fine-mapping）；并用cTWAS、多组cTWAS（M-cTWAS）检验新方法是否降低FSR；还基于Human Proteome Distribution Atlas的组织来源注释评估性状相关组织的作用，并通过模拟分析高连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）下的符号误判机制。
研究结果部分，首先为血浆蛋白的TWAS效应方向高度不一致。研究人员用UKB-PPP血浆蛋白作为正对照，因编码基因表达通常应与其蛋白丰度正相关；LoF变异降低、重复变异升高蛋白水平，98.6%显著LoF负担检验和100%重复负担检验符合预期。FUSION在2907个蛋白中分析后发现，有显著关联的1543个蛋白基因水平FSR达23%（95% CI，20–25%），即约四分之一基因显示“表达越高、蛋白越低”。共定位按PPH4过滤可降低FSR，但即便PPH4=0.99，基因水平FSR仍高于0.1，且召回率（recall）明显下降；cTWAS与M-cTWAS也得到相近FSR，说明高FSR不是FUSION特有。
复杂性状的TWAS效应方向不一致更高。研究人员从UKB复杂性状中挑出LoF负担检验显著的730个基因-性状对，其中484对有至少一个新的组织显著TWAS关联；基因水平FSR为33%（95% CI，29–38%），12%的基因-性状对在超过90%可用组织中自信地给出错误方向。coloc过滤同样只能部分降低FSR并损失召回率，说明复杂性状中的方向误判比血浆蛋白更严重。
非性状相关组织产生误导性TWAS信号。研究人员以GCK和血糖为例说明：胰腺本应是相关组织，但GCK在胰腺缺乏eQTL信号；相反，胫神经和甲状腺等无关组织中出现强且共定位的TWAS信号，方向却与生物学预期相反。模拟显示，当非相关组织表达与因果组织表达呈反向协同时，FSR最高；高LD可使非因果组织eQTL借助同一单倍型通过共定位过滤。限定单组织特异性蛋白后，FSR由23%降至20%，排除脑特异性蛋白后降至14%，再加PPH4≥0.5过滤可降为0%，但保留基因数很少。
讨论部分指出，TWAS高FSR源于非性状相关组织eQTL与GWAS因果变异处于高LD，方法正确锁定单倍型却错配组织和方向；性状相关组织受更强纯化选择，eQTL更难发现，而无关组织eQTL约束弱、效应大，容易在跨组织TWAS中主导结果。除LD驱动外，组织特异eQTL反向效应、非单调剂量反应、邻近基因共调控、LoF与常见变异效应不同等也可造成不一致；外部LD参考面板不匹配、表达预测模型不确定性等技术因素也会助长符号翻转。研究人员强调，高FSR不代表TWAS凭空制造错误符号，而是所用eQTL与汇总数据结构会导致方向不可靠，因此TWAS除报告FDR外还应评估FSR，血浆蛋白pQTL是检验FSR的有用表型。
研究结论部分翻译如下：总体而言，研究人员显示TWAS对血浆蛋白和复杂性状的效应方向估计分别与生物学预期存在23%和33%的高不一致率；共定位过滤虽能降低FSR，但过滤后仍存在明显不一致。将基因方向判定限定在性状相关组织并结合共定位过滤，可显著改善血浆蛋白的FSR，在保留基因中未再出现不一致，但代价是只保留少量基因。这些结果与一种失败模式一致：因果eQTL与非性状相关组织中的不同eQTL处于高LD，使TWAS和共定位正确指向底层单倍型，却错误归因组织和效应方向。由于非性状相关组织通常远多于相关组织，这些虚假但显著的信号很容易主导跨组织基因TWAS结果；单细胞或细胞类型特异TWAS若测试大量非因果细胞类型，也会通过连锁eQTL产生不一致。除LD驱动机制外，组织特异eQTL反向效应、非单调基因-性状关系、邻近基因共调控，以及LoF同时扰动多组织导致净效应与组织特异TWAS不同，也可能造成不一致；eQTL与GWAS队列不同、LD参考面板细微不匹配、预测表达被当作固定值而忽略模型不确定性，也会造成强关联位点的符号翻转。需注意，这种不一致不应被理解为TWAS本身引入错误符号，而是TWAS所依赖的eQTL数据和其他eQTL方法的数据会产生该现象；但把TWAS符号当作生物学效应方向时，这仍是实际限制。研究人员建议当前和未来TWAS方法除FDR外还应评估FSR，蛋白数量性状位点（protein quantitative trait locus, pQTL）数据因极少出现基因表达遗传成分与蛋白水平负相关，是检验FSR的理想表型。LoF负担检验虽常作金标准，但其基因发现偏向性状特异性基因，而GWAS常见变异可捕捉更情境化的信号；TWAS在总结常见变异对基因效应方向方面仍有价值，持续改进这些方法对理解基因在性状与疾病中的因果机制至关重要。
