ADA2通过自噬依赖性线粒体质量控制限制cGAS–STING–JAK–STAT介导的I型干扰素激活

腺苷脱氨酶2（ADA2）是一种分泌型酶，近期研究显示其可定位于溶酶体并结合DNA，但其细胞功能仍不明确。ADA2在固有免疫细胞尤其是巨噬细胞中高表达，而巨噬细胞参与ADA2缺陷（DADA2）的炎症发病机制。因此，研究人员在巨噬细胞中研究了ADA2的功能，并将ADA2鉴定为线粒体质量控制的关键调节因子。患者单核细胞的转录组分析显示，核编码线粒体基因上调，并伴随应激反应和凋亡程序。与此一致，ADA2缺陷巨噬细胞表现出线粒体质量增加、线粒体超极化、线粒体活性氧（ROS）和腺苷三磷酸（ATP）产生升高、线粒体嵴结构异常以及线粒体自噬（mitophagy）缺陷。这些缺陷促进线粒体DNA（mtDNA）经电压依赖性阴离子通道（VDAC）泄漏，触发胞质DNA感知、环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）–干扰素基因刺激因子（STING）激活以及JAK–STAT介导的I型干扰素（IFN-I）反应过度活跃。ADA2恢复可部分挽救巨噬细胞和斑马鱼中的线粒体完整性，并抑制IFN过度激活。总之，研究人员的发现将ADA2鉴定为线粒体质量控制的关键调节因子，其可防止细胞器功能障碍并限制由异常IFN信号驱动的炎症。

单基因自身炎症性疾病研究显示，固有免疫通路失衡可驱动慢性组织损伤性炎症；线粒体损伤释放mtDNA可激活cGAS–STING并诱导IFN-I，而线粒体自噬（mitophagy，选择性清除受损线粒体的自噬过程）可限制该过程。ADA2双等位突变导致DADA2，患者存在IFN-I转录特征，但ADA2的细胞功能及IFN-I激活机制不清。为此，研究人员以ADA2缺陷为人模型，整合患者转录组、患者来源标本及ADA2缺陷细胞和体内模型，发现ADA2缺失经线粒体自噬缺陷破坏线粒体质量控制，导致mtDNA泄漏和cGAS–STING依赖的IFN-I信号过度激活；ADA2恢复可改善线粒体完整性并抑制异常IFN-I反应。该研究发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。

研究人员再分析Watanabe等公开的DADA2患者单核细胞单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE142444）；患者样本来自IRCCS Ospedale San Raffaele和IRCCS Ospedale Giannina Gaslini，并设年龄匹配健康供者（HD）。关键技术包括患者单核细胞来源巨噬细胞（MDM）与CRISPR/Cas9介导的ADA2敲除（ADA2KO）U937巨噬细胞模型、透射电子显微镜（TEM）形态计量、MitoTracker/TMRE/MitoSOX及腺苷三磷酸（ATP）产生检测、自噬流与MitoTimer（线粒体周转荧光报告系统）、DQ-BSA溶酶体蛋白酶活性、液滴数字PCR（ddPCR）检测胞质和血浆mtDNA、核酸刺激及cGAS/STING/JAK/IFNAR/VDAC药理学抑制和shRNA敲低、LV.ADA2与ADA2条件培养基/重组人ADA2（rhADA2）挽救，以及cecr1b敲低斑马鱼模型。

研究结果如下。转录组谱揭示DADA2线粒体功能障碍：公共scRNA-seq再分析显示，经典、中间和非经典单核细胞中核编码线粒体过程显著富集，差异基因涉及线粒体核糖体蛋白、氧化磷酸化复合物组装或导入、应激反应/抗氧化和凋亡调节，提示DADA2单核细胞线粒体机器、应激和凋亡程序广泛激活。ADA2缺陷巨噬细胞显示形态和功能线粒体异常：MitoTracker、TIM23 Western blot和TEM显示ADA2KO及患者MDM线粒体质量增加、线粒体增大、嵴结构改变，且仅巨噬细胞分化后明显；形态分类向受损类偏移，每细胞线粒体数量相当，提示增大而非增多；TMRE和MitoSOX升高，分离线粒体ATP产生增加，且无细胞死亡差异，提示线粒体增大、代谢活跃但结构受损。线粒体自噬受损与老化线粒体累积相关：患者单核细胞自噬–溶酶体基因上调；BafA1/CQ处理后ΔLC3B-II降低、p62/SQSTM1升高且抑制剂额外累积少，optineurin、NDP52和BNIP3L/NIX升高；TEM自噬泡减少；MitoTimer显示ADA2KO绿色信号持续高、红色信号持续高，rapamycin仅降低绿色信号而未恢复红色信号；DQ-BSA显示溶酶体蛋白酶活性降低，提示ADA2缺失伴自噬–溶酶体通路改变和线粒体质量控制缺陷。线粒体不稳定促进mtDNA泄漏和IFN-I高反应：患者PBMC呈IFN-I特征，血浆mtDNA升高而cfDNA不升；ADA2KO胞质mtDNA增加而核DNA不增加；多种DNA配体刺激后IFNB增强，poly(dA:dT)后IFNB/ISG上调并进一步增加ADA2KO胞质mtDNA；VBIT-4和VDAC1敲低降低IFNB/ISG，提示VDAC依赖的mtDNA泄漏连接线粒体功能障碍与IFN-I高反应。cGAS–STING和JAK–STAT信号介导ADA2缺陷巨噬细胞IFN-I激活：Ru.521和H-151降低IFNB/ISG，anti-IFNAR和ruxolitinib亦降低；ADA2KO对IFN-α刺激的ISG诱导增强，尽管IFNAR1/2转录降低，提示下游通路反应增强；STING敲低降低poly(dA:dT)诱导的IFNB/ISG；cecr1b敲低斑马鱼IFN-I基因升高，ruxolitinib使其恢复正常，提示cGAS–STING感知和JAK–STAT放大。ADA2恢复改善线粒体缺陷并抑制IFN-I高反应：LV.ADA2恢复ADA2蛋白后，TEM示线粒体变小、嵴改善，MitoTimer示自噬效率改善，poly(dA:dT)诱导IFNB降低至ADA2WT水平；ADA2条件培养基经甘露糖-6-磷酸（M6P）受体部分内化，按健康血浆活性水平补充可降低IFNB；rhADA2注射cecr1b敲低斑马鱼使IFN-I基因及核编码线粒体基因mrpl27、mrps18c恢复正常，提示ADA2恢复/替代可纠正线粒体和IFN-I异常。

讨论部分总结认为，ADA2是连接线粒体质量控制与IFN-I过度激活的关键调节因子；ADA2缺失破坏巨噬细胞线粒体稳态，导致大而高活性线粒体累积、周转缺陷、mtDNA释放以及cGAS–STING和JAK–STAT–IFN-I放大。研究揭示ADA2此前未识别的细胞内作用，位于线粒体与溶酶体质量控制交叉；患者血浆mtDNA升高支持mtDNA为主要免疫刺激信号；STING抑制/敲低和JAK抑制在体内外验证该通路；ADA2可经M6P受体依赖内化，WT ADA2非主要自噬/溶酶体降解底物。讨论指出ADA2影响溶酶体功能和自噬流的分子机制未解，可能涉及溶酶体内核酸处理、溶酶体膜动力学或蛋白酶成熟；自噬表型包括自噬体形成和溶酶体降解能力下降，mTORC1可能参与，rapamycin部分改善；线粒体蛋白合成/导入改变、生物发生及融合/分裂未直接研究；VDAC参与mtDNA泄漏；DADA2与系统性红斑狼疮（SLE）、Aicardi–Goutières综合征（AGS）等IFN相关疾病临床重叠；治疗上LV.ADA2、细胞外ADA2和rhADA2在细胞与斑马鱼中显示纠正作用。研究结论译为：总之，本研究将ADA2鉴定为巨噬细胞线粒体稳态的调节因子。ADA2缺陷诱导线粒体过度激活、破坏线粒体自噬、促进mtDNA泄漏并驱动过度活跃的cGAS–STING–IFN信号。这些发现为理解DADA2中巨噬细胞驱动的炎症提供了机制框架，并强调线粒体质量控制是固有免疫稳态的重要调节因素。