摘要
神经炎症被广泛认为是神经精神性红斑狼疮(NPSLE)的关键致病因素。参芪地黄汤(SQDHD)在狼疮肾炎中表现出显著的抗炎作用，但其在NPSLE中的疗效尚不明确。本研究旨在探索SQDHD在NPSLE中的神经保护作用及其潜在机制。
1 引言
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多因素自身免疫病，可累及皮肤、肾脏和大脑等多个器官。累及中枢神经系统(CNS)的神经精神性红斑狼疮(NPSLE)可表现为情绪障碍、感觉障碍和认知功能障碍等多种症状，是仅次于狼疮肾炎(LN)的重要疾病相关发病和死亡原因。因此，迫切需要阐明NPSLE的发病机制并制定更有效的治疗策略。
NPSLE的发病机制通常认为始于外周循环的炎症介质破坏血脑屏障(BBB)，进而引发中枢神经系统炎症，导致胶质细胞活化、神经元损伤和行为缺陷的级联反应。脑血管内皮细胞(CVECs)对维持血脑屏障完整性至关重要。当CVECs暴露于与SLE相关的慢性炎症刺激时，会激活细胞内信号通路，导致黏附分子和其他促炎介质的表达。Janus激酶-信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)通路是一条关键的促炎信号通路。白细胞介素6(IL-6)等配体可启动JAK磷酸化，继而激活STAT。值得注意的是，JAK-STAT信号通路参与内皮激活，导致黏附分子表达上调。抑制该通路可有效减弱内皮激活，从而减少白细胞-内皮相互作用。动物研究表明，JAK抑制剂(JAKi)可能通过靶向血脑屏障受损区域的脑细胞来减轻行为异常。因此，靶向CVECs中的JAK-STAT信号传导可能是NPSLE一个有前景的治疗策略。
目前NPSLE的治疗方案有限，大多数患者依赖于免疫抑制剂、皮质类固醇或对症治疗等经验性疗法。然而，这些疗法的副作用给患者带来沉重负担。近年来，传统中药(TCM)因其多靶点、多功能治疗复杂难治性疾病（特别是自身免疫性疾病）的特点而获得越来越多的认可。参芪地黄汤(SQDHD)是一种由八味传统中草药组成的方剂，在中医中主要用于治疗肾脏疾病、发热等症状。SQDHD的关键成分已被证明可通过抑制JAK-STAT信号通路等发挥强大的抗炎作用。然而，SQDHD在NPSLE中的治疗效果和机制仍有待充分探索。
为了研究SQDHD对神经精神表现的影响及其潜在机制，本研究采用了可模拟NPSLE患者神经系统和行为异常的降植烷诱导狼疮(PIL)小鼠模型。通过结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)、网络药理学、分子对接、细胞热位移分析(CETSA)、药物亲和力响应靶点稳定性(DARTS)分析和实验验证，研究了SQDHD治疗NPSLE的疗效和机制。结果提供了强有力的实验证据，支持基于中医的策略在NPSLE临床实践中的应用。
2 材料与方法
2.1 动物实验设计
雌性BALB/c小鼠随机分为六组：对照组(Ctrl)、NPSLE模型组(PIL)、SQDHD低剂量组(L-SQDHD)、SQDHD中剂量组(M-SQDHD)、SQDHD高剂量组(H-SQDHD)和阳性药(JAKi)组。模型建立后，小鼠通过日常饮水接受不同剂量的SQDHD或JAKi(Upadacitinib)治疗4个月，随后进行行为学评估、活体显微观察等，并收集血样和脑组织用于后续分析。
2.3 参芪地黄汤的组成与制备
SQDHD由人参、黄芪、茯苓、地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮八味中药按重量比3:3:2:2:2:2:2:1组成。水煎液经浓缩、冷冻干燥成粉末。根据人-鼠剂量换算系数9.1，按2.93 g/kg (L-SQDHD)、5.85 g/kg (M-SQDHD) 和 11.7 g/kg (H-SQDHD)三个浓度，通过饮水给药，以避免灌胃引起的慢性应激。
2.5 行为学测试
包括旷场实验、嗅觉敏感性测试和强迫游泳测试，分别用于评估焦虑样行为、嗅觉功能和抑郁样行为。
2.6 活体显微观察
静脉注射罗丹明6G荧光标记白细胞后，通过颅骨开窗技术，在体观察并定量分析脑血管中滚动和黏附的白细胞数量。
2.7 血脑屏障通透性分析
通过测量伊文思蓝染料的脑内渗出量来评估血脑屏障的通透性。
2.8 免疫荧光染色
检测脑组织中黏附分子血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和P-选择素、免疫球蛋白G(IgG)的沉积以及脂褐素的自发荧光。
2.9 ELISA检测
检测脑组织中细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10(IL-10)的水平。
2.10 细胞培养与活力分析
使用小鼠脑微血管内皮细胞系(bEnd.3)和原代内皮细胞，用狼疮血清诱导细胞活化，并用SQDHD、活性成分或Upadacitinib进行干预，通过CCK-8法检测细胞活力。
2.11 蛋白质印迹法
检测脑组织和细胞中JAK1、磷酸化JAK1(p-JAK1)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、VCAM-1和P-选择素的蛋白表达水平。
2.12 实时定量聚合酶链式反应
检测脑组织中VCAM-1和P-选择素的mRNA表达水平。
2.13 网络药理学分析
结合UPLC-MS/MS数据和文献，筛选出SQDHD的61个活性成分，并通过多个数据库预测其潜在靶点。通过与NPSLE疾病靶点取交集，获得129个重叠靶点。构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，筛选出前15个核心靶点，并进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。构建化合物-靶点(CT)网络，识别出SQDHD针对NPSLE的主要活性成分。
2.14 分子对接
将筛选出的主要活性成分与JAK1、STAT3等JAK-STAT通路相关靶点蛋白进行分子对接，计算结合能，并与选择性JAK1抑制剂Upadacitinib进行比较。
2.15 细胞热位移分析
用于验证活性成分与JAK1蛋白的直接结合。化合物与细胞裂解液孵育后，进行热梯度处理，检测剩余的可溶性JAK1蛋白量，热稳定性增强表明存在结合。
2.16 药物亲和力响应靶点稳定性分析
用于进一步验证活性成分与JAK1的直接结合。化合物与蛋白孵育后，用蛋白酶进行消化，通过蛋白质印迹法检测未被消化的JAK1蛋白量，抗性增强表明存在结合。
3 结果
3.1 SQDHD改善PIL小鼠的行为缺陷
行为学测试结果表明，PIL小鼠表现出焦虑样行为、嗅觉功能障碍和抑郁样行为。中、高剂量SQDHD或JAKi治疗可显著改善这些行为缺陷，效果与JAKi相当。
3.2 SQDHD抑制PIL小鼠的黏附分子表达、白细胞募集和血脑屏障破坏
免疫荧光显示，PIL小鼠大脑皮层中VCAM-1和P-选择素表达显著上调，中、高剂量SQDHD或JAKi治疗可有效逆转。活体显微观察发现，PIL小鼠脑血管中滚动和黏附的白细胞数量显著增加，SQDHD治疗可显著减少。血脑屏障通透性分析显示，PIL小鼠脑内伊文思蓝渗出量增加，SQDHD治疗可降低其渗出。
3.3 SQDHD降低PIL小鼠的细胞因子过表达、IgG沉积和脂褐素积累
ELISA检测显示，PIL小鼠脑内促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10水平均显著升高，高剂量SQDHD表现出与JAKi相当的抑制作用。免疫荧光显示，PIL小鼠侧脑室壁有显著的IgG沉积，海马区有显著的脂褐素积累，SQDHD治疗可显著减少这些病理改变。
3.4 JAK-STAT通路被预测为SQDHD抗NPSLE的关键机制
UPLC-MS/MS分析确定了SQDHD中的61个活性成分。网络药理学分析得到129个SQDHD与NPSLE的重叠靶点。PPI网络分析筛选出前15个核心靶点，包括EGFR、STAT3、IL-6、TNF、JAK1等。GO和KEGG富集分析表明，这些靶点显著富集于细胞因子活性和JAK-STAT信号通路。结合分析推测，JAK1-STAT3信号通路可能是SQDHD治疗NPSLE的关键机制。
3.5 SQDHD抗NPSLE的主要活性成分分析
CT网络拓扑分析确定了五个主要活性成分：泽泻醇B单乙酸酯、常春藤皂苷元、鞣花酸、汉黄芩素和槲皮素。分子对接显示，这五个成分对JAK1等JAK-STAT通路相关靶点的结合亲和力均优于或等于Upadacitinib。CETSA和DARTS实验证实，这五个成分均能与JAK1蛋白直接结合。
3.6 SQDHD通过阻断JAK1-STAT3通路抑制CVEC激活
体外细胞实验表明，狼疮血清可诱导bEnd.3细胞和原代内皮细胞中JAK1和STAT3的磷酸化水平升高，以及VCAM-1和P-选择素表达上调。SQDHD预处理可有效抑制JAK1-STAT3通路的激活及其下游黏附分子的表达。当用STAT3激活剂Colivelin与SQDHD共同处理时，可逆转SQDHD对STAT3磷酸化及黏附分子表达的抑制作用，证实了SQDHD的作用依赖于JAK1-STAT3通路。
3.7 泽泻醇B单乙酸酯和常春藤皂苷元通过抑制JAK1-STAT3减轻CVEC激活
在bEnd.3细胞和原代内皮细胞中，泽泻醇B单乙酸酯或常春藤皂苷元预处理，均可显著抑制狼疮血清诱导的JAK1和STAT3磷酸化，并下调VCAM-1和P-选择素的表达。这表明这两种活性成分能模拟SQDHD的全方效应。
3.8 SQDHD抑制PIL小鼠脑内的JAK1-STAT3通路
体内实验表明，PIL小鼠脑组织中JAK1和STAT3的磷酸化水平显著升高，VCAM-1和P-选择素的mRNA表达也显著上调。SQDHD治疗以剂量依赖的方式有效抑制了这些变化。
4 讨论
本研究首次证明了SQDHD在NPSLE中的治疗效果，包括显著改善PIL小鼠的行为缺陷、减少黏附分子表达、白细胞募集和血脑屏障渗漏、降低脑内细胞因子过表达、IgG沉积和脂褐素积累，并通过抑制JAK1-STAT3信号通路下调黏附分子表达。研究结果共同为SQDHD治疗NPSLE提供了一种新的临床应用策略。
中医在治疗情感缺陷（如抑郁和焦虑）方面显示出潜力。本研究首次证明SQDHD可有效缓解PIL小鼠的焦虑和抑郁样行为，并改善嗅觉功能障碍。嗅觉功能障碍与情感损伤密切相关。NPSLE的关键发病机制之一是通过促炎因子和细胞的浸润破坏血脑屏障。CVECs对维持血脑屏障完整性至关重要。SQDHD可下调黏附分子表达、减少白细胞募集并改善血脑屏障完整性，这些有益作用可能通过其抑制CVEC激活的抗炎特性介导。
细胞因子失调在NPSLE神经精神症状的出现中起关键作用。PIL小鼠脑内促炎因子和抗炎因子IL-10均升高，表明存在代偿性抗炎反应。SQDHD通过靶向关键炎症介质，恢复了这一失调的细胞因子网络的平衡。IgG沉积可加重内皮损伤和炎症介质合成。SQDHD可能通过调节细胞因子失调来增强血管屏障功能，从而减少IgG沉积。脂褐素是神经元持续氧化应激下积累的自发荧光色素。NPSLE中的促炎微环境诱导神经元慢性氧化应激，引发脂褐素积累和细胞衰老。SQDHD通过下调脑细胞因子表达，减轻驱动脂褐素形成的上游氧化应激，从而减少其积累。
通过网络药理学，确定了SQDHD的活性成分及其潜在靶点。拓扑分析显示，SQDHD抗NPSLE的前15个靶点主要富集于JAK-STAT信号通路。JAK-STAT信号通路失调与NPSLE的记忆缺陷有关，抑制该通路对于减轻SLE的炎症、维持免疫耐受和加强屏障功能至关重要。与Upadacitinib等单靶点抑制剂不同，SQDHD同时作用于JAK-STAT网络和相关炎症级联中的多个靶点，这可能实现更平衡和持续的免疫调节。此外，KEGG分析表明，这些靶点也显著富集于IL-17和TNF等其他关键炎症通路。这表明SQDHD广泛的抗炎作用是通过一种超越JAK-STAT抑制的协同、多靶点机制实现的。
分子对接分析显示，SQDHD的主要活性成分对JAK1等JAK-STAT通路枢纽靶点的结合亲和力强于Upadacitinib。CETSA和DARTS实验证实，所有五种活性成分均能与JAK1直接结合。泽泻醇B单乙酸酯和常春藤皂苷元可抑制JAK1-STAT3通路并下调其下游效应分子。JAK-STAT信号在内皮激活中的作用已有充分记载。本研究结果表明，SQDHD在PIL小鼠和狼疮血清诱导的CVECs中均能抑制JAK1-STAT3通路。CVECs中的救援实验提供了确凿证据，表明SQDHD的抗神经炎症功效依赖于对该通路的多靶点抑制。这些发现强有力地表明，SQDHD在NPSLE中的治疗效果主要源于阻断这一关键信号通路。
本研究存在一些局限性。首先，临床前发现向人类的转化相关性需要进一步验证。其次，缺乏SQDHD的长期安全性数据。最后，鉴于多成分草药方剂中潜在的脱靶效应和复杂相互作用，JAK1-STAT3的抑制被确定为SQDHD抗NPSLE的核心治疗机制。这种多靶点特征更多地反映了草药多药理学固有的协同策略。未来的系统级药理学研究对于全面阐明SQDHD完整的相互作用网络至关重要。
5 结论
总而言之，我们首次提供了证据，表明SQDHD可能通过抑制NPSLE中的JAK1-STAT3信号通路，在激活的CVECs中发挥抗炎作用。我们的结果强调了SQDHD在减轻NPSLE行为缺陷和逆转神经炎症方面的重要性，表明其作为NPSLE治疗策略的潜力。
