在心脏疾病的谱系中，心肌缺血再灌注（I/R）损伤是一个狡猾的“双刃剑”。当心脏病发作时，迅速恢复阻塞血管的血流（再灌注）是挽救濒死心肌的关键。然而，血液的重新涌入本身却可能引发新一轮的损伤，加剧心肌细胞死亡，这便是缺血再灌注损伤。它是冠心病患者接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）等再通疗法后心力衰竭、心律失常等并发症的重要元凶，全球范围内致残率和死亡率居高不下。尽管科学家们已探明包括细胞凋亡、氧化应激、钙超载、线粒体功能障碍在内的多条损伤通路，但针对这些机制开发的有效治疗药物却屡屡折戟。因此，深入挖掘I/R损伤的核心分子机制，寻找新的干预靶点，已成为心血管领域亟待攻克的堡垒。
环状RNA（circRNA）是近年来RNA世界升起的一颗新星。与传统的线性RNA不同，circRNA形成共价闭合的环状结构，能抵抗核酸外切酶的降解，因而更加稳定。越来越多的证据表明，circRNA在心血管发育、疾病乃至癌症、神经退行性疾病中都扮演着重要角色，可作为诊断标志物或治疗靶点。然而，circRNA在心肌I/R损伤中的具体作用和调控网络，仍是一片亟待开垦的“蓝海”。与此同时，蛋白质的翻译后修饰，如棕榈酰化，是调节蛋白功能、稳定性和定位的关键开关。棕榈酰化由ZDHHC家族酶催化，在多种生理病理过程中至关重要，但其在心脏I/R损伤中的模式和功能尚不清晰。近期有研究提示，circRNA可能与棕榈酰转移酶竞争性结合同一蛋白结构域，从而调控下游蛋白的稳定性，这为理解非编码RNA如何通过翻译后修饰层面行使功能提供了新视角。
基于以上背景，一个关键的科学问题浮出水面：是否存在特定的circRNA，能够通过调控关键蛋白的棕榈酰化修饰，在心肌I/R损伤中发挥保护作用？其分子机制如何？是否具有临床转化价值？为了回答这些问题，一项由国内研究团队开展、发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》的研究应运而生。该研究首次鉴定出一个名为circArhgap26的环状RNA，系统阐明了其通过m6 A修饰被调控表达，并通过抑制PKP1蛋白棕榈酰化来减轻心肌细胞凋亡和心脏I/R损伤的全新机制，不仅为理解I/R损伤提供了新的理论框架，也为其诊疗带来了潜在的双重（生物标志物和治疗靶点）新策略。
为开展这项研究，作者运用了多种关键技术方法。在模型构建上，使用了小鼠心脏左前降支结扎/再通手术建立体内I/R模型，以及过氧化氢（H2 O2 ）刺激或缺氧/复氧处理原代心肌细胞或AC16细胞系建立体外损伤模型。在基因操作层面，通过腺相关病毒9型（AAV9）携带心脏肌钙蛋白T启动子，实现了小鼠心脏特异性过表达或敲低circArhgap26、PKP1等靶基因。分子机制探究中，综合运用RNA结合蛋白免疫沉淀、RNA下拉联合质谱、共免疫沉淀、荧光原位杂交、核质分离、分子对接等技术验证RNA-蛋白、蛋白-蛋白相互作用；采用酰基生物素交换法检测蛋白棕榈酰化水平；通过放线菌酮追踪、多核糖体分析和荧光素酶报告基因实验分析蛋白稳定性和翻译效率。此外，还通过N6 -甲基腺苷免疫沉淀检测RNA修饰，并通过定量PCR、Western blot、TUNEL染色、Evans蓝/TTC双染、超声心动图等技术进行表型与分子表达分析。临床关联性方面，研究收集了接受PCI治疗的患者和健康志愿者的血浆样本进行表达分析。
研究结果
circArhgap26在缺血再灌注损伤中的鉴定与表征
研究人员通过circRNA表达谱分析，结合序列特征、表达变化和保守性，筛选出三个在急性心肌梗死模型中变化不显著，但在I/R损伤和小鼠心肌及H2 O2 /缺氧复氧刺激的细胞模型中表达均显著下调的circRNA。其中，源自Arhgap26基因座、命名为circArhgap26的分子在I/R心脏组织和患者PCI术后血浆中均显著降低，且与人类同源分子高度保守。Sanger测序和RNase R抗性实验证实了其环状结构，亚细胞定位显示其主要分布于细胞质。进一步的实验排除了其编码蛋白的潜力。这些结果表明circArhgap26是一种在I/R损伤中下调的保守性环状RNA。
心肌细胞特异性circArhgap26参与调控I/R诱导的心脏损伤
功能获得与缺失实验证实了circArhgap26的心脏保护作用。在体实验中，利用AAV9心脏特异性过表达circArhgap26，能显著改善I/R模型小鼠的心功能（提高射血分数和短轴缩短率），降低血清乳酸脱氢酶和心肌肌钙蛋白T水平，减少心肌细胞凋亡和梗死面积，并下调促凋亡蛋白Bax、上调抗凋亡蛋白Bcl2。相反，心脏特异性敲低circArhgap26则加重了生理状态下及I/R后的心脏损伤和细胞凋亡。在体实验的结论在雌性小鼠中得到验证，且无性别特异性。体外细胞实验同样显示，过表达circArhgap26能减轻H2 O2 诱导的心肌细胞损伤和凋亡，而敲低则加剧损伤。在人心肌AC16细胞系中，h-circArhgap26也展现出类似的抗凋亡功能。
鉴定PKP1为circArhgap26的结合蛋白
为探究机制，研究通过RNA下拉联合质谱技术寻找circArhgap26的结合蛋白，功能聚类分析提示与细胞粘附蛋白的凋亡性切割相关。RNA免疫沉淀等实验进一步验证了circArhgap26与桥粒斑蛋白1存在特异性结合。PKP1在I/R损伤和H2 O2 刺激的心肌细胞中表达上调。分子对接、免疫荧光共定位及截短体实验表明，circArhgap26主要与PKP1的ARM1结构域相互作用。
心肌细胞特异性PKP1参与调控I/R诱导的心脏损伤
功能实验表明PKP1是I/R损伤的促进因子。心脏特异性敲低PKP1能改善I/R后的心功能，减少细胞损伤标志物、细胞凋亡和梗死面积，并调节Bax/Bcl2表达。而过表达PKP1则产生相反效果，加重I/R损伤。体外细胞实验也证实，敲低PKP1减轻H2 O2 诱导的损伤，而过表达则加剧损伤。
PKP1介导circArhgap26对I/R诱导心脏损伤的效应
挽救实验证明了PKP1是circArhgap26下游的关键效应分子。在体实验中，同时过表达PKP1可逆转circArhgap26过表达带来的心脏保护作用；同时敲低PKP1则可挽救circArhgap26敲低导致的损伤加剧。体外细胞实验也得到一致结论，表明circArhgap26主要通过调控PKP1来发挥其抗凋亡功能。
circArhgap26通过抑制其棕榈酰化来降低PKP1蛋白稳定性
机制深入探究发现，circArhgap26不影响PKP1的mRNA水平，但能在翻译后水平降低其蛋白丰度。蛋白稳定性实验显示，circArhgap26过表达加速了PKP1蛋白的降解。功能聚类分析提示circArhgap26与脂质修饰相关。使用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸酯处理可剂量依赖性地降低PKP1蛋白水平和棕榈酰化修饰，并加速其降解。重要的是，circArhgap26过表达本身就能显著降低PKP1的棕榈酰化水平。
circArhgap26竞争性结合PKP1并抑制ZDHHC1介导的棕榈酰化
通过生物信息学分析和实验验证，研究锁定ZDHHC1是催化PKP1棕榈酰化的关键酶。敲低ZDHHC1（而非ZDHHC17）可抑制PKP1棕榈酰化并加速其降解。共免疫沉淀证实PKP1与ZDHHC1存在相互作用，而circArhgap26过表达会减弱这种互作。机制上，ZDHHC1同样主要结合PKP1的ARM1结构域，与circArhgap26存在竞争关系。通过点突变实验，研究进一步确定了PKP1蛋白第14和136位的半胱氨酸是其主要的棕榈酰化位点，突变这些位点可消除棕榈酰化并加速蛋白降解，且能废除circArhgap26对PKP1棕榈酰化的调控作用。
PKP1通过与APAF1 mRNA的5‘非翻译区结合加剧APAF1蛋白合成
为了解PKP1如何促凋亡，研究通过生物信息学预测及实验验证，发现PKP1的下游关键靶点是APAF1。PKP1调控APAF1发生在翻译水平，它不影响APAF1的mRNA水平或蛋白降解速率，而是通过结合APAF1 mRNA的5‘非翻译区，促进其翻译起始效率，这通过荧光素酶报告基因和多核糖体分析得以证实。功能挽救实验表明，APAF1过表达可逆转PKP1敲低带来的抗凋亡效应。此外，PKP1/APAF1轴最终激活了Caspase-9/Caspase-3凋亡信号通路。而circArhgap26过表达可抑制I/R或H2 O2 诱导的APAF1上调，该效应可被PKP1过表达所逆转。
circArhgap26的m6 A修饰调控其在心肌细胞中的表达
研究进一步探索了circArhgap26本身在I/R中下调的上游机制。生物信息学预测、m6 A免疫沉淀及RNA免疫沉淀实验证实，circArhgapRNA存在m6 A修饰，并可被阅读蛋白YTHDF2识别结合。敲低YTHDF2能显著上调细胞内circArhgap26的水平，表明YTHDF2可能通过识别m6 A修饰促进circArhgap26的降解，从而参与其在I/R损伤中的下调。
研究结论与意义
本研究发现并系统阐述了一条全新的心肌缺血再灌注损伤调控轴：m6 A阅读蛋白YTHDF2通过识别m6 A修饰促进circArhgap26降解，导致其在I/R中表达下调。低水平的circArhgap26减弱了与PKP1的竞争性结合，使得棕榈酰转移酶ZDHHC1能更有效地与PKP1的ARM1结构域结合，催化其第14和136位半胱氨酸发生棕榈酰化。此修饰增强了PKP1的蛋白稳定性。高水平的PKP1进而结合凋亡蛋白酶激活因子1 mRNA的5‘非翻译区，促进其蛋白翻译。APAF1的累积最终激活Caspase-9/Caspase-3级联反应，执行细胞凋亡程序，导致心肌损伤。反之，过表达circArhgap26可通过竞争性抑制PKP1棕榈酰化，破坏该促凋亡通路，发挥心脏保护作用。
该研究的突破性意义在于多维度整合了RNA修饰、非编码RNA功能、蛋白质翻译后修饰和翻译调控等多个层面的生物学过程，绘制出一幅精细的I/R损伤分子图谱。它首次揭示了circRNA可通过竞争性抑制蛋白棕榈酰化来调节其稳定性的新机制，拓展了人们对非编码RNA功能模式的认识。研究不仅在小鼠模型中验证了circArhgap26的治疗潜力，更重要的是，在PCI患者的血浆中发现了其同源物h-circArhgap26的表达下降，这为其作为无创诊断生物标志物提供了直接的临床依据。因此，circArhgap26兼具成为预后预测指标和治疗干预靶点的“双重价值”，为开发基于circRNA或靶向棕榈酰化修饰的精准心血管治疗策略奠定了坚实的理论基础，有望为改善全球范围内高发的I/R相关疾病预后带来新的希望。
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