尽管免疫疗法在肿瘤治疗中取得了显著进展，但每年仍有大量患者死于癌症复发或耐药。其中，肿瘤细胞通过不断演变获得免疫逃逸能力，是制约当前免疫治疗（如CAR-T、免疫检查点抑制剂）疗效的主要瓶颈之一。传统上，针对免疫逃逸机制的研究多采用CRISPR敲除筛选，以发现那些“丢失后促逃逸”的基因，然而，这一策略主要适用于开发小分子抑制剂或抗体药物。随着RNA疗法的兴起，一个亟待探索的问题是：是否存在另一类基因，当其表达“增加”时，反而能“增敏”肿瘤细胞，使其对免疫系统的攻击更为敏感？这种“功能获得性”视角，可能为开发基于RNA或基因激活的新型免疫疗法开辟全新道路。
针对这一科学问题，由L. Jerby团队领导的研究在《Nature Genetics》上发表了一项突破性工作。他们巧妙地将功能获得性筛选、单细胞技术与空间多组学分析相结合，系统性地绘制了能够调控T细胞特异性杀伤肿瘤的RNA网络图谱，不仅鉴定出一系列全新的治疗靶点，还建立了名为“原位Perturb-seq”的高通量技术平台，用于在组织和微环境中解析基因功能。这项研究为克服肿瘤免疫耐受、开发下一代精准免疫治疗策略提供了重要的理论依据和技术框架。
为了回答上述问题，研究团队运用了多项前沿技术。他们首先在黑色素瘤A375细胞中进行了大规模的CRISPR激活(CRISPRa)筛选，使用靶向NY-ESO-1抗原的T细胞受体(TCR) T细胞进行选择性杀伤，以鉴定能够增强或减弱TCR特异性细胞毒性的基因。接着，针对筛选出的候选基因，他们利用Perturb-seq技术（即结合CRISPR扰动与单细胞RNA测序），在单细胞分辨率下描绘了这些基因过表达后的转录组变化。为了在更复杂的体内微环境中研究基因功能，团队创新性地开发了“原位Perturb-seq”技术，通过在组织原位检测遗传扰动条形码并进行空间转录组测序，分析了基因过表达对肿瘤微环境中不同细胞类型的非自主性影响。此外，研究还利用患者来源的肿瘤细胞系（如HPV阳性的CaSki细胞）和小鼠同源肿瘤模型（如B16黑色素瘤、MC38结直肠癌模型）进行了体内外功能验证。
CRISPRa筛选鉴定出T细胞细胞毒性的新型调节因子
为了发现能够（去）增敏肿瘤细胞对TCR特异性细胞毒性的基因，研究团队在黑色素瘤A375细胞中进行了CRISPRa筛选。结果显示，38个基因的激活赋予肿瘤细胞抵抗性，而90个基因的激活则使其对T细胞杀伤更为敏感。这些“命中基因”功能多样，包括转录与表观遗传调控因子（如SAFB、KHDRBS1、MYC）、细胞表面/分泌蛋白（如CD44、WNT3A）以及凋亡相关基因。值得注意的是，许多增敏性“命中基因”（如CASP3、BID、BAK1）在基线条件下不影响细胞活力，仅在T细胞存在时才导致细胞死亡，这种现象被定义为“免疫RNA合成致死”。研究人员以CASP3为例，证实其过表达仅在共培养时激活caspase-3，从而选择性增强T细胞杀伤，而在单一培养时并无毒性，完美诠释了这一概念。
Perturb-seq揭示“命中基因”的汇聚效应与调控网络
为深入理解“命中基因”的作用机制，研究团队对61个候选基因进行了CRISPRa Perturb-seq筛选。单细胞转录组分析表明，T细胞的存在显著改变了肿瘤细胞的转录状态，同时上调了促凋亡和抗凋亡基因。通过构建每个扰动对应的基因激活(GA)特征，并分析其共调控关系，发现增敏性和抵抗性基因的转录变化存在显著交集。进一步构建基于Perturb-seq的调控网络，揭示了以神经元发育基因GAS7和以CD44为核心的配体-受体互作枢纽，表明这些“命中基因”通过复杂的转录调控和细胞间通讯网络汇聚于共同的下游通路。
MYC和SAFB作为TCR特异性细胞毒性的关键调节因子
体内聚焦CRISPRa筛选进一步验证了多个关键靶点。其中，著名癌基因MYC的过表达意外地增强了肿瘤细胞对T细胞杀伤的敏感性。机制上，MYC过表达上调了BAK1、BID、SAFB等促凋亡基因，并下调了GAS7、BCL2A1、MCL1等抗凋亡基因的表达。而核基质蛋白SAFB则表现更为独特，其过表达在基线条件下不影响细胞增殖或对其他死亡刺激（如FasL）的敏感性，却特异地增敏了T细胞介导的、颗粒酶/穿孔素依赖的细胞毒性，是“免疫RNA合成致死”的又一典型例证。
原位Perturb-seq：用于解析基因-环境互作与细胞间调控的高通量平台
为在组织微环境中研究基因功能，团队开发了“原位Perturb-seq”。该技术通过在体内肿瘤中同时进行遗传扰动条形码的原位检测和高通量空间转录组分析，能够评估基因过表达对自身（细胞自主性）及周围微环境细胞（非自主性）的影响。应用该技术对B16同源肿瘤的分析发现，过表达不同基因的肿瘤细胞在空间上形成克隆性聚集（“扰动分区”）。分析揭示了显著的基因-环境互作，例如Lifr过表达对肿瘤细胞转录组的影响取决于其配体在邻近细胞中的表达水平。更重要的是，该技术鉴定出“扰动多细胞程序”(pMCP)，即肿瘤细胞中特定基因的过表达会导致邻近免疫细胞或基质细胞的转录状态发生特异性改变。例如，肿瘤细胞过表达Wnt3会激活邻近T细胞，上调包括Cd28在内的T细胞活化标志物。随后的体外实验证实，Wnt3a处理可显著增强原代CD8+T细胞的细胞毒性、IFNγ和IL-2分泌，验证了这一非自主性调控机制。
结论与意义
本研究发现了一系列通过CRISPR激活筛选鉴定出的、能够特异性调节T细胞受体(TCR)介导的肿瘤细胞杀伤作用的RNA相关机制。研究提出了“免疫RNA合成致死”的新范式，即通过恢复或增强肿瘤细胞内特定基因（如CASP3、SAFB）的表达，可使其在免疫攻击下选择性地走向死亡，而在正常状态下保持存活，这为基于RNA的精准治疗提供了极具潜力的新靶点。
研究开发的原位Perturb-seq技术，为在复杂组织环境中高通量、多维度地解析基因功能、细胞间通讯及基因-环境互作建立了强大平台，具有广泛的方法学意义。
研究揭示的调控网络不仅包含细胞自主性凋亡通路，也涉及由Wnt配体等介导的、可激活T细胞的非自主性机制，为联合靶向肿瘤细胞与改造T细胞的“双管齐下”免疫治疗策略提供了新思路。例如，靶向肿瘤细胞的SAFB或CASP3，或通过工程化T细胞或药物递送系统提供Wnt信号，均可能增强抗肿瘤免疫应答的效力。
综上所述，这项工作通过整合功能获得性遗传筛选与多组学空间分析，系统解码了肿瘤细胞响应特异性T细胞杀伤的调控网络，为克服免疫治疗耐药性、开发下一代更安全、更精准的RNA免疫疗法奠定了坚实的理论与技术基础。
