嵌合抗原受体共刺激结构域通过调控T细胞不对称分裂诱导细胞命运决定

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法在血液恶性肿瘤中可实现令人瞩目的缓解，但复发较为常见，原因在于仅有少数输注细胞获得长寿命、记忆样状态。所有美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的CAR T细胞产品均包含4-1BB或CD28共刺激结构域，二者赋予不同的表型结局，但这些信号如何控制早期命运决定尚不完全清楚。本研究表明，共刺激结构域通过不对称细胞分裂（Asymmetric Cell Division, ACD）控制记忆命运获得。CD28 CAR T细胞具有更高的CAR表面表达及增强的首次分裂后表面蛋白质组不对称性，但矛盾的是，其子代细胞间表现出减弱的转录、表观遗传和代谢分歧，与长期持久性降低相关。相反，4-1BB CAR T细胞表面极化程度较低，但转录、代谢和表观遗传分歧更为显著，产生近端效应倾向型和远端持久倾向型子代。通过整合表面蛋白质组学、转录组学、代谢组学和染色质可及性分析，研究人员揭示了共刺激结构域如何调节不对称细胞分裂以塑造CAR T细胞命运，为优化细胞免疫治疗提供了机制基础。

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法在多种血液恶性肿瘤及难治性自身免疫性疾病中取得了显著疗效，但长期疾病控制患者间仍存在差异。持久控制依赖于长寿命CAR T细胞的持续存在，其维持依赖于长寿命记忆T细胞的形成以提供持续免疫监视。不对称细胞分裂（Asymmetric Cell Division, ACD）是效应T细胞与记忆T细胞命运分歧的关键机制之一：亲代T细胞活化后产生两个不同的子代细胞——近端、面向靶细胞的子代继承免疫突触并采用糖酵解、效应样表型，而远端子代则更为静息、氧化磷酸化且具记忆样特征。该现象近期在人CAR T细胞中已有报道，但不同临床相关共刺激结构域（包括4-1BB和CD28）如何影响这些早期命运决定仍不清楚。

4-1BB为基础的CAR常显示持久续存，部分患者缓解可持续超过10年，而CD28为基础的CAR虽常产生快速扩增和细胞毒性，但可能使细胞倾向于持久性降低和更早耗竭。机制上，4-1BB信号促进氧化代谢或脂肪酸代谢、抗凋亡通路及非经典核因子κ轻链增强子激活的B细胞（Nuclear Factor κ-light-chain-enhancer of Activated B cells, NF-κB）活性，同时增加人白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）II类和白细胞介素21（Interleukin-21, IL-21）轴基因表达；而CD28为基础的CAR则促进更具糖酵解特征的效应样表型，伴耗竭标志物高表达。为系统比较首次CAR T细胞分裂后4-1BB（BBζ）和CD28（28ζ）共刺激信号的差异，研究人员整合了改良的靶标诱导分子邻近标记技术（Labeling Immune Partnerships through SorTagging Intercellular Contacts, LIPSTIC）与多维度正交单细胞分析（表面蛋白质组学、转录组学、代谢组学和染色质可及性）。

**ACD的发生独立于共刺激结构域和CAR表达**

为探究不同共刺激结构域如何影响CAR T细胞的初始细胞命运决定，研究人员首先检测了BBζ和28ζ CAR的表达模式。28ζ CAR一致显示更高的表面表达水平和更为均一的表达模式，而BBζ CAR则呈现特征性的宽泛分布。该差异并非由转导效率不同所致，因为两种结构均达到可比的转导率；且该现象内在归因于共刺激结构域本身，因为信使核糖核酸（messenger RNA, mRNA）电转（规避慢病毒整合位点变异）重现了相同模式：28ζ为狭窄均一峰，BBζ为宽泛分布。在多个供体中，28ζ CAR的中位荧光强度在相似转导效率下始终更高，且CAR染色的变异系数降低，表明表达更为均一。这一现象具有普适性，在多独立实验室、不同靶抗原（包括间皮素、κ轻链和CD19）及不同递送方式中均有观察到。当检测其他共刺激结构域时，仅CD28表现出这种清晰的均一表达模式，而OX40、CD27和CD40均显示与BBζ类似的宽泛分布。

研究人员采用LIPSTIC追踪并表征这些表达差异如何影响分裂后子代细胞命运。LIPSTIC通过共价转移荧光标记的亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-苏氨酸-甘氨酸 analog（LPETG）肽从靶细胞到CAR T细胞表面的免疫突触处，在首次分裂时该标记被不对称继承于近端子代，而远端子代保持未标记odie，从而实现对ACD产生的功能不同子代细胞的分离和表征。时间进程实验显示，在37°C、室温和4°C下均有显著标记，且4°C时标记略高，可能因CAR内吞被抑制而保留表面可及底物。为排除旁分泌细胞因子信号激活的旁观T细胞误判为远端子代的可能性，研究设置了CellTrace Yellow标记的非CAR表达T细胞对照，结果显示旁观细胞几乎不增殖，证实LIPSTIC阴性首次分裂群体代表抗原驱动的ACD产生的真正远端子代。细胞周期状态分析确认，共培养起始时CAR T细胞处于同步化静息状态，>99%细胞处于G0或G1期，且BBζ与28ζ间无差异。

首次分裂保留荧光团-链霉亲和素-LPETG肽复合物的近端子代显著大于LPETG阴性的远端子代，与共刺激结构域无关。近端子代表达更高水平的CD98（SLC7A5）和MYC蛋白，二者均为T细胞分裂中不对称继承的命运决定因子。为确定CAR表面表达水平是否影响首次分裂子代下游功能不对称程度，研究人员基于共表达NGFR报告基因强度对BBζ和28ζ CAR T细胞进行分选。结果出乎预料，功能不对称模式在CAR表达水平间保持一致：近端子代后代体积更大、CD25表达更高且增殖更快，而远端子代后代相对静息、增殖有限、CD25表达较低，维持记忆样状态。这表明CAR信号输入量的大范围变化并不按比例缩放ACD后下游后代的功能分歧。进一步评估首次分裂子代对稳态细胞因子的增殖反应发现，无外源细胞因子时近端子代增殖更快；但提供IL-2或IL-15时，BBζ和28ζ的远端子代均表现出显著更强的反应性，增殖增加且更多细胞经历超过四次分裂，与干细胞记忆样或中央记忆样表型一致。

**CAR共刺激信号控制ACD后T细胞持久性**

为检测体内持久性，研究人员将首次分裂近端或远端子代BBζ和28ζ CAR T细胞分选后注射入NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠。注射30天后，接受BBζ远端子代的小鼠显示最高外周T细胞计数。Nalm6白血病细胞挑战后，仅BBζ远端子代有效控制白血病生长。在压力测试模型中，将亚治疗数量的首次分裂子代注射入白血病负荷小鼠，28ζ子代（近端和远端）及BBζ近端子代均显示肿瘤控制不佳，而BBζ远端子代维持持续的肿瘤控制。静息（未分裂）CAR T细胞显示明确但短暂的治疗获益，证实28ζ首次分裂子代有限的肿瘤控制并非CD28共刺激结构域的内在缺陷，而是CD28信号通过ACD塑造子代细胞命运的特定后果。体外细胞毒性实验排除了28ζ和BBζ近端子代因细胞溶解功能降低而导致肿瘤控制不佳的可能性。

**CD28促进子代间更大的表面蛋白极化**

为全面理解共刺激结构域如何塑造ACD期间的分子景观，研究人员对首次分裂子代CAR T细胞进行了单细胞转录组和表位测序（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing, CITE-seq）分析，同时检测表面蛋白质组和转录组。对CD8细胞表面抗体数据进行均匀流形近似和投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）分析显示，28ζ首次分裂子代近端和远端群体间呈现显著间隙，欧氏距离增加；CD4 T细胞中同样观察到这种增加的分离。无监督聚类和子集评分揭示CD8 T细胞中存在naive样（T_N cell-like）、中央记忆样（T_CM cell-like）、效应记忆样（T_EM cell-like）和组织驻留记忆样（T_RM cell-like）群体，以及CD4 T细胞中的对应群体。28ζ CAR T细胞在所有子集中表现出比BBζ更大的子代间表面蛋白不对称性，每T细胞子集中28ζ特有的差异表达蛋白数量均更高。

**4-1BB驱动更大的转录不对称性尽管表面极化较低**

为探究观察到表面蛋白质组差异的转录基础，研究人员分析了CITE-seq数据中的mRNA表达谱。意外的是，定量分析显示BBζ CD8 T细胞表现出比28ζ增强的转录不对称性，火山图揭示BBζ近端和远端子代间存在更多差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），CD4 T细胞中同样如此。跨所有T细胞子集的定量分析证实这一发现——BBζ首次分裂子代在CD8和CD4群体中均显示更多独特的DEGs。尽管28ζ CAR T细胞具有更高的CAR表达和更大的表面蛋白不对称性，但其转录不对称性反而降低。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，BBζ子代特有的转录差异在功能上显著，T_N cell样BBζ子代（而非28ζ子代）表现出ATP水解、电子传递链、 theater甲基转移酶活性、组蛋白结合及其他代谢通路相关基因的不对称性，提示4-1BB共刺激在不对称分裂期间建立的早期代谢和表观遗传差异。

**共刺激而非CAR表达驱动转录不对称性**

为严格验证这一悖论是否跨供体和CAR表达水平成立，研究人员使用正交技术平台（split-pool combinatorial barcoding, Parse Biosciences）和CD19靶向CAR（FMC63克隆）重复单细胞分析。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示四个分选群体沿分化轨迹组织：静息细胞占据一极，近端子代占据另一极，活化未分裂（Activated–Undivided, AU）细胞介于近端和远端子代之间。BBζ近端和远端子代显示比28ζ对应子代更大的转录分离，BBζ细胞延伸至UMAP的极值而28ζ细胞保持较窄范围。规范标志物表达验证群体生物学身份：远端子代富集LEF1、IL7R和KLF2（干性及静息相关基因），近端子代表达更高水平的MYC、TBX21、IL2RA（CD25）、CD39、TOX和ARID1A（效应活化及染色质重塑程序）。

定量分析确认，无论高或低CAR表达水平，BBζ CAR T细胞均显示比28ζ更多的DEGs，直接证明是共刺激结构域而非CAR表达水平驱动ACD期间的转录不对称程度。基因集富集分析显示代谢通路在BBζ特有的近端-远端DEGs中最为富集，高低CAR表达的BBζ细胞均显示氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸代谢程序类似富集，而这些在28ζ细胞中缺失。表面蛋白层面，28ζ CAR T细胞再次显示近端和远端子代间更明显的蛋白不对称性，尤其在低CAR表达细胞中；BBζ群体和28ζ高表达细胞也显示不对称但程度较低。

**4-1BB而非CD28共刺激驱动代谢不对称性**

为确定转录代谢程序是否导致功能性代谢差异，研究人员对分选首次分裂子代进行实时代谢通量分析（Seahorse）。两种结构型近端子代均显示比远端子代更高的氧消耗率（Oxygen Consumption Rate, OCR），但BBζ远端子代显示显著更高的OCR与细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR）比值，表明优先依赖氧化代谢。能量表型图显示，BBζ远端子代在所有三种代谢状态下维持最高OCR/ECAR比值。BBζ远端子代在氧化和糖酵解灵活性方面均显示比BBζ近端子代更大的增幅，表明这些细胞在两条通路中保留更大的代谢储备能力，这是分化程度较低、记忆样T细胞的标志。28ζ近端和远端子代间差异减小，两群体间糖酵解灵活性无显著变化。

液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, LC–MS）代谢组学分析显示，BBζ近端和远端子代沿主成分1显示更大代谢分歧，而28ζ子代聚类更紧密。近端子代在两结构中均显示乳酸和AMP水平升高（与增强糖酵解和ATP周转一致），以及脯氨酸和UDP-GlcNAc增加（支持快速增殖期间蛋白质合成和效应功能），但BBζ子代中这些差异幅度更大。远端子代谷氨酰胺水平更高，反映氧化代谢偏好，但BBζ细胞中近端-远端差异更显著。BBζ子代显示广泛的代谢不对称性，而28ζ子代代谢极化最小。BBζ特有差异代谢物包括远端子代升高的精氨酸、丙酮酸、异亮氨酸和天冬氨酸，提示增强的氧化代谢、线粒体功能和氨基酸分解代谢；以及BBζ子代中显著更高的棕榈酸和肉豆蔻酸，提示增强 lipid metabolism。此外，BBζ子代显示比28ζ更高的抗氧化代谢物半胱氨酸和谷胱甘肽水平，伴随抗氧化酶PRDX1（过氧化物还原酶1）、TXN（硫氧还蛋白）和MT2A（金属硫蛋白2A）基因表达增加。

**4-1BB驱动表观遗传不对称性强化不同子代命运**

鉴于代谢状态可通过代谢物可用性和通量直接影响染色质修饰，研究人员检测BBζ子代中观察到的代谢不对称是否转化为不同的表观遗传景观。对CD19靶向CAR T细胞进行单细胞转座酶可及染色质测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing, ATAC-seq）和RNA测序整合分析，同时评估首次分裂子代的染色质可及性和基因表达。UMAP可视化显示BBζ CD8近端和远端子代占据表观遗传空间的不同区域，而28ζ近端和远端子代染色质可及性谱几乎完全重叠。伪时间分析进一步确认这种差异表观遗传编程，BBζ子代沿伪时间轨迹显示更大的ATAC信号发散。BBζ在CD8和CD4 T细胞中产生更多差异可及区域和DEGs。关键T细胞命运决定基因包括IFNG、BATF3、IL2RA和TOX在BBζ子代中显示不对称可及性，而在28ζ子代中保持相似可及性。

SCENIC+分析揭示CD8 BBζ子代中调控网络的不对称继承，近端和远端细胞间存在不同的转录因子活性。效应相关转录因子TBX21在BBζ近端和远端子代间显示差异活性，而28ζ远端子代维持残余TBX21转录和染色质可及性程序。染色质结构因子SMC3、RAD21和CTCF在BBζ远端子代中下调，但在28ζ远端细胞中保留残余活性，可能阻止这些细胞实现或维持完全静息。最 memory相关转录因子BCL11B在BBζ远端子代中特异性 robust上调，而在28ζ子代中这种差异显著减弱。BCL11B在BBζ远端子代中作为双功能调节因子：作为表观遗传激活因子促进干性相关和记忆相关基因（LEF1、TCF7、NELL2、MBNL1和DOCK9）维持细胞于低分化状态，同时抑制活化基因IL2RA、糖酵解基因ENO1和氯离子通道/细胞增殖基因CLIC1。

**讨论**

FDA批准的CAR T细胞疗法的临床成功依赖于产生持久记忆细胞，但4-1BB和CD28共刺激如何塑造抗原 encounter后的首次命运决定一直不清楚。通过结合LIPSTIC命运追踪与跨三个正交单细胞平台（10x Genomics 5'-CITE-seq、Parse Biosciences split-pool combinatorial barcoding和10x Genomics Multiome ATAC+Gene Expression）、四个健康供体和两种CAR抗原特异性（CD19/FMC63和TCRδ/5A6.E9）的多组学分析，研究表明CAR表达控制分裂期间表面蛋白极化的程度，而共刺激结构域决定这种极化是否转化为稳定的功能分歧。因此，4-1BB和CD28 CAR T产品间的临床区别反映了早期ACD如何被分子编程。

这些数据细化了结构域间已确立的差异。CD28 CARs促进快速效应分化、糖酵解和即时细胞毒性，而4-1BB CARs favor氧化代谢、记忆形成和持久性。机制上，4-1BB engage TRAF依赖的非经典NF-κB和 THEMIS–SHP1通路，而CD28招募LCK以产生更强的近端活化；相应转录程序包括4-1BB CAR T细胞中HLA II类、IL-21轴和脂肪酸代谢富集。这些差异有助于解释B细胞急性淋巴细胞白血病分析显示4-1BB产品具有更大持久性和微小残留病阴性缓解。但它们具有情境依赖性：CD28为基础的axi-cel在侵袭性淋巴瘤中可显示更强抗肿瘤活性伴更大毒性，慢性4-1BB活化也可驱动功能障碍。

研究揭示ACD在CD4⁺和CD8⁺ CAR T细胞中均发生，但非二元过程。28ζ CAR更高、更均一的表面表达产生更大蛋白不对称性，可能通过更强的受体聚集和突触形成；28ζ CAR在等效抗原密度下也比4-1BBζ CAR信号更强。然而这种增强的表面极化并不转化为持久的子代细胞分歧。相反，28ζ近端和远端子代在转录、代谢和表观遗传上保持相似，而BBζ子代在所有三个层面分歧并产生有助于解释4-1BB CARs often superior durability的持续远端群体。这种解离表明信号质量而非信号幅度决定ACD是否产生稳定的效应偏向和记忆偏向子代。

代谢数据为此效应提供机制基础。与前期工作将4-1BB与氧化代谢和CD28与糖酵解联系起来一致，BBζ远端子代保留更高OCR/ECAR比值、更大代谢储备和与氧化及氨基酸代谢一致的代谢物 profile，而BBζ近端子代更具生物合成性和增殖性。28ζ子代尽管表面不对称更大，但显示有限代谢极化。由于线粒体动态和代谢灵活性塑造T细胞命运，这些发现提示共刺激信号主动编程ACD产生的代谢分支点，而非被动反映继承的表面 cargo。

调控网络分析进一步鉴定BCL11B为有效记忆偏向ACD的关键特征。BBζ远端子代选择性激活BCL11B——T细胞干性和记忆的调节因子，连同干性相关靶标LEF1、TCF7、NELL2、MBNL1和DOCK9，同时抑制活化和代谢基因IL2RA、ENO1和CLIC1。28ζ子代中BCL11B不对称性减弱可能因此在缺乏持久记忆功能方面解释其为何获得部分记忆样表面特征。

数据还显示表观遗传分歧在单次人CAR T细胞分裂内即已建立。BBζ远端子代下调染色体结构因子包括SMC3、RAD21和CTCF，提示更易适应的染色质状态，而28ζ子代保留更相似的可及性 program。这一模式与近期显示不对称EIF4F分配驱动MYC依赖性命运分歧，以及cBAF-MYC复合物可不对称继承以重塑染色质并影响持久性的工作一致。总体而言，这些发现将共刺激信号置于稳定ACD衍生命运的表观遗传 machinery上游。结论的稳健性得到跨正交单细胞平台汇聚的支持：10× 5'-CITE-seq、Parse split-pool barcoding和10× Multiome ATAC+Gene Expression跨越四个健康供体和两种CAR抗原特异性，28ζ子代的减弱不对称性和BBζ子代的显著分歧均被各平台独立重现，强烈论证这些差异是共刺激结构域固有的而非平台特异性或供体特异性假象。

这些观察反对简单最大化CAR表达或信号强度。相反，CAR设计应将信号质量与治疗情境相匹配：需要快速肿瘤清除时CD28程序可能具优势，而4-1BB程序可能更好支持持久免疫监视。双共刺激设计、亲和力调谐CAR、代谢调节和表观遗传干预可用于调节这一平衡。总体而言，该研究将ACD定义为共刺激结构域可调控的机制，其中早期蛋白极化、转录重塑、代谢和染色质可及性协调作用以决定CAR T细胞持久性。