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在论证了利用重组蛋白可鉴定SH2磷酸化蛋白结构域的相互作用后，美国休斯顿大学的研究人员开始研究在体内检测磷酸化蛋白质相互作用的可行性。
在论证了利用重组蛋白可鉴定SH2磷酸化蛋白结构域的相互作用后，美国休斯顿大学的研究人员开始研究在体内检测磷酸化蛋白质相互作用的可行性。
研究人员开发了一种基于细胞总蛋白测定法在肿瘤细胞中检测由酪氨酸磷酸化介导的内源性磷酸化的蛋白质相互作用。他们假设，在多肽芯片上的酪氨酸磷酸浓度（在pM或fM范围内）比在体内的浓度高得多（1–4 µM），这将使磷酸肽能够捕获参与磷酸模体的蛋白复合物。
为了测试这一假设，研究人员设计了一款酪氨酸磷酸肽芯片(联川生物提供多肽芯片技术服务)，其具有160个高亲和力的SH2结构域，可以结合之前实验鉴定的磷酸模体包括重组体SH2结构域。芯片上每条多肽探针设置了10次重复，每次重复设置了一条质控多肽。
为了检测并比较GRB2的磷蛋白相互作用网络，研究人员采用了磷酸肽绑定试验分析了4种不同类型的细胞：
非致瘤性上皮细胞（MCF10A）
ER阳性肿瘤细胞（MCF7）
ER阳性肿瘤细胞（T47D）
乳腺转移性细胞系（MDA-MB231）
细胞裂解物结合实验方案（a）和预测的细胞总蛋白混合物中相互作用的类型，其中蛋白可能通过各种磷酸酪氨酸结合域和磷酸酪氨酸模体进行相互作用（b）。图示如下。
扫描芯片后获得的图像文件（a），如下图所示，由酪氨酸磷酸化多肽结合GRB2介导的蛋白复合物的绝对信号测定，可通过GRB2蛋白特异性一抗与随后结合染料的二抗进行检测。
采用内部软件程序对数据进行严谨的数据处理，选取与细胞裂解物中内源性GRB2相互作用居前的磷酸肽探针（b）。
共有57个磷酸化肽探针在不同细胞类型中显示出显著的相互作用差异（2–3倍），这足以将一个细胞类型从另一个细胞类型中区分开。
几乎70%的相互作用（40/57）被以前的研究所证实，而其余的是新的未知的相互作用。这支持了研究者对浓度介导磷酸肽蛋白复合物结合的假设。
基于Pepcyber数据库的预测，24个相互作用是由GRB2直接介导的，17个相互作用或是以直接或是以复合体形式与其他蛋白相互作用，15个相互作用是间接与一个或多个sandwich蛋白作用，这可能会在细胞裂解物中有数千个蛋白质通过不同的磷酸酪氨酸模体进行相互作用的情况下出现。
Krishnamoorthy S, Liu Z, Hong A, Zhu R, Chen H, et al. (2013) A Novel Phosphopeptide Microarray Based Interactome Map in Breast Cancer Cells Reveals Phosphoprotein-GRB2 Cell Signaling Networks. PLoS ONE 8(6), e67634. [article]
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