梯度PCR、降落PCR和巢式PCR有啥区别？

时间：2024年8月8日

来源：基因有限公司

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梯度PCR Gradient PCR

在标准的PCR过程中，退火阶段是关键的一步，其中DNA聚合酶需要在较低的温度下识别并结合到目标DNA序列的互补链上。然而，不同DNA片段的熔解温度（Tm）可能不同，因此一个固定的退火温度可能不适合所有目标序列。

梯度PCR主要目的是优化PCR过程中的退火阶段，在PCR反应中将样品放置到同一PCR仪中的不同温度模块，设置不同的退火温度来高效确定最佳退火条件。通过比较这些反应的结果，可以优化出最适合特定DNA片段扩增的退火温度，使用此温度进行标准PCR扩增，提高扩增的效率和特异性。

降落PCR Touchdown PCR

降落PCR同样是在PCR的退火阶段进行优化，与梯度PCR不同的是，降落PCR是在每个循环设定由高到低的退火温度，来保证PCR的特异性和高效率。初始循环退火温度较高，可减少非特异性产物的形成，保证PCR实验的特异性。后期的循环温度较低，扩增效率大大提升。由于前期已经积累了大量的特异性产物，其位点结合竞争力高于非特异性产物，因此后续循环可大量扩增特异性产物。降落PCR既特异又高效，现多用在高通量扩增反应（如KASP）中，可兼容不同退火温度的反应体系。

巢式PCR Nested PCR

巢式PCR利用两组或多组不同的引物对同一模板DNA进行多次的PCR扩增。主要用于提高某些特定DNA片段的检测灵敏度和特异性。首先使用一对外引物（非特异性引物）扩增出包含目的片段的长片段，生成足够量的DNA模板。再使用更接近目的片段的内引物进行第二轮扩增。通过这种方式，第二轮PCR可以更精确地扩增目标DNA片段。另外由于两轮扩增，可以显著增加目标DNA的量，这对于检测低丰度或难以扩增的DNA片段非常有效，提高实验的灵敏度。

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