多中心评估无标记定量技术在人血浆高动态范围基准集中的性能表现

为解决临床血浆蛋白质组分析中高动态范围蛋白质定量准确性差的难题，研究人员开展多中心评估研究，通过建立PYE基准样本集（人/酵母/大肠杆菌混合酶解产物），在12个中心采用DDA和DIA模式进行LC-MS分析。结果表明DIA在鉴定数量、数据完整性、准确性（CVs 3.3-9.8%）和精密度方面均优于DDA，证明跨平台精准定量在复杂血浆基质中的可行性，为临床生物标志物发现提供了重要技术基准。

人类血浆作为临床常规采集的生物样本，蕴含着丰富的生物标志物资源，对疾病诊断和患者分层具有重要意义。然而，基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的血浆蛋白质组学研究长期面临一个巨大挑战：血浆蛋白质的动态范围高达11个数量级，其中最丰富的蛋白质（如白蛋白，浓度约70 mg/mL）占总蛋白质量的55%，前22种高丰度蛋白更是占据了99%的质量比例。这种极端不平衡的分布使得质谱分析中低丰度蛋白质的检测和定量变得异常困难，通常只能稳定检测到几百种蛋白质，而许多具有重要生物学功能的低丰度蛋白（如组织渗漏蛋白或细胞因子）往往无法被有效捕获。

为了解决这一技术瓶颈，德国MSCoreSys临床蛋白质组学研究联盟开展了大规模多中心评估研究。研究人员设计了一种创新的基准样本集PYE——以人血浆酶解产物为基质，掺入不同比例的酵母和大肠杆菌酶解蛋白质组，模拟真实临床样本中高动态范围蛋白质的定量挑战。样本设置包括PYE1（90%人源+10%异源）、PYE3（1:3稀释）和PYE9（1:9稀释）三个稀释水平，其中PYE9中非人源蛋白比例仅为1.1%，很好地模拟了真实生物标志物的低丰度特征。

该研究在12个中心使用13种不同的LC-MS平台（包括Thermo Fisher Orbitrap系列、Bruker timsTOF系列和Sciex zenoTOF等仪器）分别采用数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）模式进行分析，共完成了1116次LC-MS运行。所有原始数据均通过统一流程进行中心化分析：DDA数据使用MaxQuant处理，DIA数据使用DIA-NN处理。

关键技术方法包括：使用过滤辅助样品制备（FASP）方法处理血浆样本；建立多物种混合基准样本集（人血浆/酵母/大肠杆菌酶解产物）；在12个中心采用标准化LC-MS分析流程（包含DDA和DIA两种采集模式）；使用MaxQuant（DDA）和DIA-NN（DIA）进行统一数据处理；采用六重复注射设计评估技术重复性。

研究结果方面，首先在蛋白质鉴定性能上，DIA方法显著优于DDA。在PYE1样本中，DIA平均鉴定到3193个蛋白质组和29259条肽段，而DDA平均仅鉴定到1743个蛋白质组和15835条肽段。更重要的是，DIA显示出更好的重现性，平均84.2%的蛋白质在所有重复中均被鉴定到，而DDA仅为51.5%。这种优势在低丰度蛋白质检测中尤为明显——DIA在PYE9样本中仍能检测到大量低丰度异源蛋白，而DDA的检测能力则显著下降。

定量性能评估显示DIA具有显著优势。在重复注射重现性方面，DIA的中位变异系数（CVs）为3.3-9.8%，远优于DDA的6.4-54.7%（平均15.4%）。在定量准确性方面，DIA对人类血浆蛋白、大肠杆菌和酵母蛋白的log2比值与预期值的偏差均小于DDA。特别是在最低丰度三分之一的蛋白质中，DIA仍能保持良好的线性定量能力，而DDA则表现出较大的偏差。

跨平台比较发现，不同LC-MS设置间存在一定差异，但所有DIA方法均表现出稳定的定量性能。有趣的是，色谱峰容量与定量准确性并无显著相关性，而较长的梯度时间（分析时间）通常能获得更高的鉴定数量。微流与纳流LC系统在性能上未见明显差异，表明方法具有良好的跨平台适用性。

方法可转移性评估显示，在不同实验室使用相同的LC-MS参数能够获得高度一致的结果。研究人员在L中心使用G和H中心的LC-MS配置重新分析PYE1样本，获得了与原始研究高度相似的鉴定结果和定量分布，证明了DIA方法的良好实验室间可转移性。

研究结论表明，DIA在血浆蛋白质组定量分析中全面优于DDA，特别是在低丰度蛋白质检测、定量准确性和重现性方面。这种优势在复杂基质如血浆中尤为突出，因为DIA的全扫描特性使其能够捕获更多低丰度离子信号。该研究建立的PYE基准集为血浆蛋白质组分析提供了宝贵的资源，可用于优化LC-MS和生物信息学工作流的准确性和重现性。

这项发表于《Nature Communications》的研究具有重要意义：首先，它首次建立了专门用于评估血浆蛋白质组定量性能的基准样本集，为领域提供了标准化评估工具；其次，通过大规模多中心验证，证明了DIA在临床血浆蛋白质组分析中的优越性和可靠性；最后，研究展示了现代质谱技术能够在复杂基质中实现精准定量，为蛋白质组学在临床诊断和精准医疗中的应用奠定了坚实的技术基础。

随着蛋白质组学技术的不断进步，血浆蛋白质组覆盖深度已从早期的100-200种蛋白质提高到如今的500-1000种常规检测能力。这项研究证明，通过优化LC-MS工作流程和采用DIA策略，我们能够在保持高定量准确性的同时显著提高血浆蛋白质组的检测深度，为发现和验证新的疾病生物标志物提供了强有力的技术支撑。