津巴布韦不同种植体系解磷微生物多样性及其与磷矿粉联用作为生物肥料的研究
时间：2025年10月15日
来源：MicrobiologyOpen
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本文系统研究了津巴布韦不同种植体系土壤中解磷微生物（PSM）的多样性及其功能特性，成功分离出37株具有解磷能力的菌株，其中以芽孢杆菌属（Bacillus）为主（61%），并证实其能有效活化磷矿粉（RP）中的磷，为开发适应本地条件的低成本P生物肥料提供了重要种质资源和理论依据，对缓解土壤磷匮乏、促进资源受限地区的农业可持续发展具有重要意义。
作物生产力受到撒哈拉以南非洲农业土壤（包括津巴布韦）固有低氮（N）和低磷（P）水平的限制。连续谷物单一种植和养分耗竭导致需要大量外部养分投入以实现可持续产量和维持土壤质量。尽管有多种选择，但其使用存在一些局限性，导致作物产量低，远低于豆类的1.0 Mg ha−1，并且土壤健康持续下降。氮和磷供应技术对于增加作物生长和生产力至关重要，以到2030年转变粮食系统，抗击营养不良并有助于消除极端贫困。平衡且负担得起的作物施肥策略有助于打破贫困循环，特别是对于资源受限的家庭。
在津巴布韦和其他国家，通过应用生物固氮（BNF）和根瘤菌接种剂技术，在提高营养密集型豆科植物的生产方面已经付出了相当大的努力。对于有效的BNF，无论是否接种，磷通常是一个限制因素。在豆科作物种植系统中，磷的供应至关重要，因为磷是核酸、酶、辅酶、核苷酸和磷脂的成分。磷占植物干重的0.2%至0.8%，因种植系统中的养分供应模式而异。磷的短缺会降低其他投入（包括氮）的养分吸收效率，并导致豆科植物结瘤不良和固氮能力差。磷的固定，特别是在低pH条件下（如津巴布韦Marondera地区的情况），降低了磷的有效性，并使每年施用磷投入成为可持续作物生产力的先决条件。需要解决方案来提高磷的有效性，以最大化现有固氮微生物生物刺激素的好处，并提高在津巴布韦种植的豆科植物的固氮能力。虽然磷矿粉（RP）可能就地可得，但其在土壤中的溶解性差限制了其直接应用。
世界大约有710亿公吨（bmt）的RP储量。这些岩石中的磷酸盐以碳酸盐磷灰石[3Ca3(PO4)2·CaCO3]、羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]、氟磷灰石[Ca10(PO4)6F2]和硫磷灰石[3Ca3(PO4)2·CaSO4]的形式存在。尽管用于制造磷肥的火成岩Dorowa磷矿粉（DRP）在津巴布韦Buhera地区丰富，但其溶解度极低。生物溶解，涉及将解磷微生物（PSM）与不溶性RP耦合，无论是否施用有机肥，在其他国家已被证明是一种有前途的技术。磷溶解细菌（PSB）与RP联用或不联用的有效性已得到证实。据报道，PSM的群落结构、其产生植物生长素和铁载体的能力（这有助于其解磷能力）主要受该地区气候的影响。目前没有关于从津巴布韦土壤中分离PSM的文献记录。分离适应津巴布韦当地条件的本土PSM可能显著有助于开发磷生物肥料，特别是与DRP联用时。使用基于微生物的解磷技术可以显著补充该国目前唯一的固氮豆科根瘤菌接种剂生产商（即位于津巴布韦Marondera的豆科接种剂工厂）的努力。现有基础设施可用于生产解磷微生物（PSM）接种剂，这可能有助于降低该国的肥料进口成本。因此，PSM生物肥料可能是一种有前途的技术，相对更便宜，特别是与当地RP一起施用。在全球范围内，绿色技术被推荐，PSM生物肥料是可能减少环境危害的技术之一。PSM还在农业生态系统中可溶性和不溶性磷的生物地球化学循环中发挥重要作用，通过将不溶性磷转化为可溶性磷，然后使其可被植物利用，从而促进土壤生物多样性。这种方法的成功将取决于有效微生物的成功分离。
使用了来自Marondera地区（靠近豆科接种剂工厂）11个田块和Buhera（靠近DRP矿）10个田块的原始土壤和耕作土壤。豆科接种剂工厂成立于1962年，位于Marondera的Grasslands研究站的土壤生产力研究实验室（SPRL）。DRP矿位于Mutare以西约90公里处。所选田块没有生物接种剂应用历史。考虑到气候对PSM群落结构和解磷效率的重要性，需要对比鲜明的农业生态区的站点。Marondera地区属于自然区域（NR）IIB，年降雨量平均在700至1000毫米之间。相比之下，Buhera地区属于NR III，年降雨量平均在550至700毫米之间。该地区的特点是季节中期干旱和高温。Marondera和Buhera玉米的生长周期长度分别为105-120天和120-135天。然而，这两个地区都有相似土壤的斑块分布在整个地区，包括变性土、硅铝土、铁硅铝土、准铁铝土和正铁铝土组。从NR I到NR V，植被丰度、总降雨量和作物生产潜力在整个津巴布韦都在下降。Marondera和Buhera的农业实践以作物和牲畜混合生产为特点。在Marondera，主要作物是烟草和玉米。其他作物包括大豆、花生、小麦和普通豆。Buhera的主要作物包括耐旱和传统谷物，如豇豆、高粱和手指粟。在两个地区，牲畜生产以养牛为主，主要区别在于前者实行牧场放牧和围栏育肥，而后者以公共牧场放牧和广泛的牛肉牧场为主。两个地区的大多数田块都是沙土至沙壤土，散布着黑色或红色粘土的斑块。因此，它们代表了津巴布韦小农农业下种植的大多数土壤。我们没有探索津巴布韦发现的所有类型的土壤，因为这是关于从津巴布韦土壤中分离和评估PSM的首批研究之一。因此，将发生率的证明和详细表征优先于广泛的分离。
从每个地区的10个农民田块中采集土壤样品，另外在SPRL有一个站内研究地块。使用之字形采样方法，在每个≤1.0公顷的地块中，分别用螺旋钻和铁锹采集1公斤复合土壤样品和9公斤大重量（0-20厘米深度）样品。样品风干并过筛（<2毫米）。
分析了土壤的pH（氯化钙）、土壤质地（比重计法）、有效磷（Olsen法）；有机碳（改良Walkley Black法）；总交换性盐基（酸化乙酸铵法）；全氮和全磷（过氧化氢酸消化和比色法）；和矿质氮（硫酸钾提取后比色法）。
使用土壤直接法和诱饵植物法分离PSM，然后进行进一步表征。
从每个复合样品中取10克土壤样品放入1000毫升聚乙烯瓶中，然后加入990毫升无菌盐水溶液（0.85% w/v NaCl），该溶液已在121°C和1 atm下高压灭菌。湿润土壤以引入均匀的水分环境，并在28°C下预培养7天，以确保在干燥条件下采集的样品中休眠微生物有机体的激活。使用多轨道功能摇床-PSU-20i以120 rpm摇动悬浮液30分钟，然后过滤和离心以产生澄清溶液。使用平板计数法，三个重复，在选择性P培养基{Pikovskaya (PVK)}培养皿上，通过系列稀释从10−3到10−9测定每个样品中的PSM。PVK培养基每升无菌水含有10克葡萄糖、5克Ca3(PO4)2、0.5克(NH4)2SO4、0.2克NaCl、0.1克MgSO4·7H2O、0.2克KCl、23克酵母提取物琼脂、0.0001克MnSO4·H2O和0.0001克FeSO4·7H2O。
培养皿（Petri dishes）在28°C ± 2°C下培养5天以触发微生物细胞的增殖。随后进行视觉和显微镜观察以记录微生物的形态特征。鉴定出的真菌进行了形态学表征，但立即用95%乙醇销毁。进一步的工作与细菌一起进行，因为SPRL目前仅用于细菌工作，并且其操作标准不允许培养、增殖或储存真菌物质，以尽量减少真菌污染。使用Stuart菌落计数器，型号SC 6，帮助在第5天对平板中的菌落进行计数。细菌菌落形成单位（CFU g soil−1）基于每个样品最稀释和具有代表性的水平进行计数，因为它们的培养特性尚不清楚。因此，使用公式(1)计算PSM种群。
选择在PVK琼脂上产生清晰晕圈或大量生长的分离株，并指定名称从PSM1开始。测量每个鉴定出的PSM的晕圈直径。将每个纯细菌菌落的一环（从新鲜PVK琼脂平板上的单菌落培养）转移到三个重复的琼脂斜面瓶中，在层流罩中的无菌条件下于4°C进一步储存。每3个月对解磷细菌（PSB）进行传代培养，以在SPRL-微生物培养库中维持纯的存活库存。
将表面灭菌的豇豆种子（品种-CBC 2）在28°C ± 2°C下预发芽3天，然后在3公斤土壤的3升塑料盆中种植三株幼苗。每个土壤样品重复三次。选择豇豆作为诱饵植物，因为该研究侧重于鉴定提高豇豆生产力的PSM。豇豆根在根际中存在吸引并促进那些与豇豆形成关系的细菌的生长。在整个温室生长期间，用蒸馏水浇灌盆并维持在场容量水分含量。种植后45天，小心地将植物从处于场容量水分的土壤中连根拔起，并采样所有附着在根上的土壤。从根际土壤中分离PSM，详细方法同“土壤直接”法。鉴定出的PSM被指定编号，延续从“土壤直接”法产生的列表。与“土壤直接”法中鉴定出的相似的分离株相应地分类为已建立。这些是通过它们的形态特征识别的。所有进一步表征的工作仅与细菌一起进行，尽管它们被指定为PSM，因为初始分离包括一些真菌分离株。
计算从每个地区和不同土地利用实践下分离的细菌PSM的相对频率（占总数的百分比）。
2.5.1 在DRP修正的PVK琼脂上产生晕圈和PSB的生长
进行了一项初步实验，比较PSM在原始含有磷酸钙（CAP–PVK）的PVK和在DRP修正的PVK培养基（DRP–PVK）上的生长。DRP–PVK培养基通过组合PVK琼脂的所有试剂制备，如“土壤直接”法所述，但CAP被原始DRP取代。本研究中使用的原始RP从Dorowa矿收集。将其研磨并通过1.0毫米筛，并使用硫酸和过氧化氢消化，然后进行比色测量分析总磷。发现DRP含有2.7%的总磷。选择了三种不同的分离株（PSM1、PSM7和PSM27），代表分离出的不同类别的细菌，基于菌落形态（颜色、形状和直径）和晕圈直径。结果表明，PSM的生长在分离株之间变化，但不依赖于磷源。
仅使用DRP–PVK培养基进行了一项实验，以确定所有在储存于4°C 4周后仍能保持鉴定出的形态特征并能被培养和纯化的细菌PSM的生长。发现28个分离株是一致的，因此这些被考虑用于本次调查和随后的调查。RHIZO 276（Rhizobium leguminosarum），一种已知的固氮根瘤菌菌株，从SPRL-微生物培养库中取出，并提供与未知PSM分离株相似的培养基条件。将各自的分离株点接种到DRP–PVK培养基上，两个重复，并在28°C ± 2°C下培养7天。研究单菌落的形态特征，包括颜色和隆起。在培养5天后和第6天使用菌落计数器/观察器记录菌落周围是否存在晕圈。使用公式(2)计算磷酸盐溶解指数（PSI）。
设立了第二个实验以定量确定在DRP–PVK琼脂平板上溶解磷所需的天数。在培养基制备中包含溴百里酚蓝（5 mL of 0.5% BTB/L）（BTB–DRP–PVK琼脂），然后倒入各自的培养皿中，用于28个PSM分离株，三个重复。将PSM细菌的纯培养物在无菌和无菌程序下划线到BTB–DRP–PVK琼脂平板上，并在28°C ± 2°C下培养10天。从SPRL-微生物培养库中取出的RHIZO 276（R. leguminosarum）（快速生长者）和RHIZO 267（Bradyrhizobium diazoefficiens）（慢速生长者）以及空白平板作为对照。每天检查平板以跟踪颜色从蓝色到黄色的变化。溴百里酚蓝是一种pH敏感指示剂，因此预计会因有机酸生产作为RP溶解的机制而发生变化。一旦观察到黄色，平板就被丢弃。计算颜色变化的平均天数。
对28个PSM分离株和两个已知的根瘤菌分离株（RHIZO276和RHIZO267）进行了生化表征。使用革兰氏染色法对分离株进行表征。使用酚红碳水化合物（葡萄糖/麦芽糖/蔗糖或果糖）肉汤和用于气体检测的Durham管评估分离株水解糖的能力。使用30% H2O2进行过氧化氢酶试验。使用Simmons Citrate琼脂进行柠檬酸盐试验。使用Kovac's试剂筛选PSM细菌降解氨基酸色氨酸的能力。
2.6 使用16S重组DNA（rDNA）进行PSM分离株的系统发育身份和分析
通过使用通用引物（序列5′–3′）：27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) 和1492R (CGGTTACCTTGTTACGACTT) 对28个PSM分离株和来自SPRL-微生物培养库的两个已知根瘤菌标准菌株的16S rDNA进行测序，在南非的Inqaba生物技术工业公司进行基因分型表征。使用Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit, Zymo Research Catalogues No. D6005从各自的培养物中提取基因组DNA。使用OnTaq Quick-Load 2x Master Mix (NEB Catalogue No. M0486) 与上述引物扩增16S目标区域。PCR产物在凝胶上运行，然后使用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit, Zymo Research Catalogue No. 4001提取。提取的片段在ABI 3500xl Genetic Analyzer上进行分析。使用CLC Bio Main Workbench v7.6分析由ABI 3500XL Genetic Analyzer生成的ab1文件。使用ChromasPro软件（版本2.6.6）编辑获得的16S rRNA基因序列。使用MEGA 11.0.13软件计算新序列的成对核苷酸百分比同一性。通过在National Center for Biotechnology Information (NCBI)数据库中进行BLAST搜索获得结果，相似性为99%–100%。将鉴定出的序列上传到GenBank核苷酸序列数据库并分配登录号。
土壤或PSM表征的数据在计算每个参数重复的平均值后呈现，然后计算平均值的标准误（SE）。使用Genstat第20版对从结构化实验生成的所有定量数据（包括PSI）进行单向方差分析。使用Fischer's Protected Least Significant Difference分离平均值。
将PSM分离株发生率数据转换{√(x + 0.5)}，然后使用古生物学统计（PAST）软件包版本4.02进行alpha多样性、Shannon Wiener (H′)指数分析，以了解不同土地利用/种植历史下的物种多样性。PAST是一个免费的统计软件包，用于数据分析，具有各种数据操作、绘图、单变量和多变量统计、生态分析和空间分析的功能。物种丰富度（存在的物种数量）和丰度（每个物种的个体数量）由Menhinick指数（DMn）描述，而多样性由Shannon指数评级，其最大值为5，随着物种多样性的增加而增加。物种丰富度通过将观察到的物种数量除以定义生态系统的总面积来计算。Simpson's指数（D），代表两个随机选择的个体属于不同物种的概率，和Menhinick指数，它将物种丰富度估计为样本中物种数量除以样本中个体数量的平方根，用于理解来自不同田间样品的PSM多样性。使用的指数计算公式如下面的公式(3)、(4)、(5)所示。
在上述方程中，p是每个物种发现的个体比例（n/N），ln是自然对数，Σ是计算的总和，s是物种数量。尽管有几种多样性指数，但选择Menhinick指数是因为与Margalef指数相比，它受样本量的影响较小，而Shannon指数代表“未知个体身份”的不确定性，与样本量无关，可以更好地区分系统之间的多样性。考虑Simpson's指数（D）以进一步理解研究结果，因为它易于理解，尽管它严重加权于优势度。使用公式(6)计算指数的标准误（SE），置信区间为95%。
然后通过百分比增加或减少比较不同作物/土地利用处理之间的指数。数据集不平衡，因为它来自调查。PSM的发生不是预先确定的。多样性指数缺乏明确定义的概率分布，因此没有对获得的指数进行进一步的统计分析。基于选定的形态特性、所有生化特征、晕圈直径和磷溶解指数，使用SPSS第29版进行多变量聚类层次分析。
4.1 用于PSM分离的采样土壤的化学性质和土地利用历史
在两个地区，一些田块先前种植了玉米或豆科作物（豇豆、豆类或花生）。Dorowa土壤的土壤磷较高，SOC低于Marondera，土壤pH和矿质氮在地区之间没有差异。百分之八十的采样土壤是中粒沙土，通常呈酸性，pH值在4.0至5.7之间。与先前田间历史相关的pH存在差异：休耕地、沼泽地、豇豆（Vigna unguiculata L.）、向日葵（Helianthus annus L.）和研究田土壤的pH低于糖豆（Phaseolus vulgaris L.）下的土壤。研究田的pH最低，其次是先前种植向日葵和先前休耕的土壤。土壤有效磷（P）水平变化很大，范围在26至264 ppm之间，未受干扰（原始）田地的有效磷为26–59 ppm。糖豆下的土壤有效磷水平最高，其次是花生（Arachis hypogaea L.）、棉花（Gossypium herbaceum L.）和高粱（Sorghum bicolor L.），沼泽土壤最低。研究土壤中的矿质氮平均为Dorowa 17.4 mg kg−1土壤和Marondera 19.0 mg kg−1土壤。土壤有机碳范围在0.31%至5.4%（原始土地）之间，而交换性盐基（meq/100 g）在Ca 2.22–5.58、Mg 0.22–0.69和K 0.84–2.84之间。
先前种植棉花的土壤矿质氮最高，其次是豇豆和糖豆下的土壤，休耕和沼泽地最低。SOC最高的是先前种植豇豆和向日葵的土壤，其次是糖豆、原始土地和玉米（Zea mays L.）下的土壤，棉花下的土壤最低。
4.2 PSM在土壤中的发生和丰度（CFU g Soil−1）
PSM8在所有土壤中都出现，其次是PSM1，出现率为86%，PSM3在81%的研究土壤中出现。通过诱饵植物法，每个只有11个分离株从一个土壤样品中回收。所有直接从土壤中回收的分离株至少在10个土壤样品中出现，除了PSM6、PSM7、PSM14和PSM15，它们在3到5个土壤样品中被回收。通过诱饵植物法获得的分离株在不同土壤类型中重复出现的频率较低。只有五个分离株（PSM16、PSM20、PSM22、PSM26和PSM27）从四个土壤样品中回收。
PSM6、PSM7、PSM14和PSM15的菌落数量最高，超过1.50 × 109 CFU g−1土壤。这四个PSM产生大量微小菌落。在具有较大菌落的分离株中，种群范围从7.26 × 107 (PSM10) 到1.32 × 109 CFU g−1 (PSM4)。
共获得37个PSM分离株，包括3个真菌分离株和34个（92.5%）细菌分离株。在总共37个微生物分离株中，PSM1–PSM15直接从土壤中分离，分离株PSM16–PSM37是从作为诱饵植物的豇豆的根际土壤中获得的，没有在任何不同的土壤上添加任何额外的养分。总体而言，从RP矿带（Buhera地区）采样的土壤中分离出的PSM数量高于从Marondera地区选定的农民田块中分离出的PSM数量，如图1所示，并由Taxa-S值（Dorowa-27和Marondera-22）证实。Buhera的PSM多样性高于Marondera，如Shannon、Simpson和Menhinick指数所示。然而，Marondera地区的物种均匀度高于Buhera。大多数（73%）的PSM在两个地区都出现，除了PSM28仅出现在Marondera，PSM7、24、29、30、32和33仅出现在Buhera。PSM8是两个地区的优势分离株，其次是PSM1 = PSM2 = PSM3 = PSM13 和 > PSM12 (Buhera) 以及 PSM1 = PSM12 > PSM3 > PSM2 = PSM13 (Marondera)。
从先前种植花生和玉米的田地中回收的分离株数量最多，记录了最高的H′指数。物种丰富度和均匀度的趋势也得到了Menhinick指数的证实，花生下的指数最低，豇豆下的指数最高，尽管两个指数呈反比关系。
当在选择性固体PVK培养基上平板培养时，分离株具有多样的培养特性（菌落颜色、隆起和生长速率）。37个细菌分离株中的28个在DRP–PVK琼脂上生长，其中六个（PSM1、PSM10、PSM26、PSM29、PSM31和PSM32）产生明显的同心环。28个分离株中的17个是透明/奶油色/白色，有一些变化，被识别为闪亮、乳白色、霜状或水晶透明。菌落隆起主要是凸起的，而五个分离株是圆顶形的，一个分离株是平坦的，中心凸起。大多数（37个中的21个）分离株在PVK琼脂上生长需要5天。当分离株接种到BTB–DRP–PVK琼脂上时，13个分离株表现出快速（2天）生长，而只有3个（PSM20、PSM21和PSM35）是慢速（7天）生长者，通过颜色从蓝色变为黄色来指示。该调查与标准分离株RHIZO276（R. leguminosarum）和RHIZO267（B. diazoefficiens）的快速生长和慢速生长的报告特征一致。支持信息S1显示了37个PSM分离株的详细形态特征。
4.5 选定PSM的功能多样性：在DRP–PVK培养基中的P溶解活性
除PSM8和PSM29外，所有分离株都产生晕圈，直径范围在1.75 (PSM20) 至34.3 mm (PSM14) 之间。PSM25和PSM14记录了大晕圈，其次是PSM13 > PSM22 > PSM27和PSM31。菌落直径存在显著差异，顶级分离株为PSM15 (10.5 mm) > PSM8 > PSM29 > PSM14 > PSM20 > PSM21 > PSM25 > PSM26 > PSM33 (4.5 mm)。PSI范围在1（PSM8和PSM29）至15.9（PSM27）之间，PSM22、PSM13和PSM27的PSI值高于7。
64%的分离株是革兰氏阳性杆菌，而29%是革兰氏阴性杆菌。只有7%的分离株是革兰氏阳性球菌。大多数分离株对糖利用呈阳性，25个分离株（96%）葡萄糖阳性并产气（96%）。19个分离株对蔗糖利用呈阳性，其中超过90%的分离株产气。60%的分离株对麦芽糖利用测试呈阳性，其中90%产气阳性。在11个对麦芽糖测试呈阴性的分离株中，70%不产气。对于果糖测试，28个分离株中的16个测试呈阴性且不产气，而其余83%测试呈阳性且产气。大部分分离株对柠檬酸盐（82%）和吲哚酸（89%）测试呈阴性。过氧化氢酶测试也观察到类似趋势，只有13个分离株呈阳性。
标准菌株RHIZO276和RHIZO267对过氧化氢酶和柠檬酸盐呈阴性，对氧化酶呈阳性。RHIZO276的吲哚酸测试呈阳性，而RHIZO267的呈阴性。支持信息S2提供了关于所有生化测试的详细分离株反应的额外信息。
PSM的多样性不仅仅是形态特征（如颜色、隆起和菌落大小）的结果，还受到形成晕圈的能力的影响，这转化为磷溶解指数。形成了两个主要簇，PSM14、PSM25
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