3D打印噬菌体负载水凝胶：开发局部长效递送系统以对抗多重耐药细菌感染

本综述系统阐述了利用3D挤出打印技术构建噬菌体负载藻酸盐-甲基纤维素（AlgMC）水凝胶的局部长效递送系统。研究表明，该体系能在人血浆类似培养基（HPLM）中持续释放具有抗菌活性的噬菌体长达35天，为植入物相关感染提供了创新治疗方案。纳米粘土Laponite的加入虽在生理条件下未进一步延长释放时间，但在非生理条件下可能发挥保护作用。该技术为精准控制噬菌体递送提供了新策略。

3D Printing of Bacteriophage-Loaded Hydrogels: Development of a Local and Long-Lasting Delivery System

摘要

多重耐药细菌已成为日益严重的威胁生命的全球性问题，每年导致超过127万人死亡，预计到2050年后将增至每年1000万人死亡。在骨科和创伤外科领域，植入物相关感染（如假体周围关节感染和骨折相关感染）是毁灭性的并发症，具有高死亡率。肢体重建通常需要极长的治疗周期，而截肢往往是最后的外科治疗选择。随着抗菌素耐药性的出现，世界卫生组织支持非传统治疗方法，如噬菌体疗法。噬菌体是感染并杀死细菌的病毒，具有高度特异性，不伤害真核细胞，且不影响患者的天然微生物组。

本研究的目的是开发一种用于局部、长效噬菌体给药的明确递送系统。研究以金黄色葡萄球菌特异性噬菌体株为模型，探讨了通过3D挤出打印将噬菌体嵌入生物材料墨水中的可行性。研究表明，由藻酸盐和甲基纤维素（AlgMC）组成的噬菌体负载水凝胶混合物可以高形状保真度进行打印。交联后，当在人血浆类似培养基（HPLM）中孵育时，这些水凝胶结构能在35天内持续释放对金黄色葡萄球菌保持活性的噬菌体。将纳米粘土Laponite整合到AlgMC混合物中（已知其对生物分子具有高结合能力），在HPLM的（接近）生理条件下并未进一步延长释放时间，但在非生理条件下可能保护噬菌体。总之，噬菌体负载的AlgMC墨水满足局部噬菌体治疗的要求，因为它们能以持续的方式释放活性噬菌体。

1 引言

植入物相关感染的数量预计在未来几十年内将会上升，这凸显了其对受影响患者和医疗保健系统造成的社会经济及医疗负担。噬菌体疗法在治疗植入物相关感染的临床研究中显示出有希望的结果。一个未解决的关键问题是最佳的噬菌体给药途径。对于植入物相关感染的治疗，共识是手术期间或手术后在感染部位局部应用噬菌体是有益的，并且有效的递送策略对于临床成功至关重要。

因此，目前非常关注基于生物材料的递送方法的开发和评估。水凝胶由生物聚合物和/或合成聚合物组成，与生物制剂高度相容，并且应用灵活，可以注射或以预成型形式植入。3D打印技术能够在计算机辅助的增材制造过程中根据预定义设计精确塑造水凝胶。使用挤出打印（最常用的方法，打印材料（“墨水”）以层层堆积的方式沉积），可以生产具有临床相关尺寸的水凝胶结构。

本研究旨在探索噬菌体负载水凝胶的3D挤出打印可行性，目标是开发一种明确的递送系统，能够局部、长效地释放噬菌体。研究使用了两种墨水配方：藻酸盐和甲基纤维素（AlgMC）的混合物，以及AlgMC与纳米粘土Laponite（AlgMC–Lap）的混合物。藻酸盐组分在离子交联后形成水凝胶网络，而甲基纤维素由于其高粘度在打印过程中稳定墨水；打印和交联后，甲基纤维素被释放。整合Laponite已被证明可以增强水凝胶对药物和生长因子的结合能力。

本研究测试了以下假设：可以通过挤出3D打印以高形状保真度制造噬菌体负载的水凝胶结构，并且活性噬菌体可以从这些凝胶中长时间释放。研究调查了整合到墨水中的噬菌体在多大程度上影响其可打印性，以及Laponite的添加是否对活性噬菌体的释放产生影响。

2 实验部分

2.1 噬菌体

使用金黄色葡萄球菌特异性噬菌体（191219；D&D Pharma GmbH）作为模型。噬菌体通过在液体培养物中或通过双层琼脂方法进行扩增，使用金黄色葡萄球菌菌株EDCC 5055。通过斑点噬菌斑测定法测定噬菌体滴度。

2.2 打印材料

2.2.1 墨水制备

将海藻酸钠（Alg）、甲基纤维素（MC）和Laponite（Lap）粉末通过高压灭菌法灭菌。AlgMC墨水通过将3 wt% Alg和9 wt% MC溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或直接溶解在噬菌体悬浮液（滴度分别为1 × 10⁶, 1 × 10⁹, 2 × 10⁹, 或 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹，溶于TSB培养基中）中来制备。对于AlgMC–Lap墨水，首先将3 wt% Lap溶解在PBS或噬菌体悬浮液中，然后加入3 wt% Alg和6 wt% MC。通过向1 mL墨水中加入100 µL噬菌体悬浮液（2 × 10⁹ PFU mL⁻¹）来制备用PBS作为溶剂的墨水。使用TSB作为溶剂制备不含噬菌体的墨水，作为阴性对照。

2.2.2 流变学表征

使用旋转流变仪对不同噬菌体浓度（1 × 10⁹ 和 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹；不含噬菌体的墨水溶于TSB或PBS作为阴性对照）的墨水进行粘度测定。在20分钟内将剪切速率连续增加至100 s⁻¹。所有墨水在混合后不久和室温储存24小时后进行检测。

2.3 3D打印

使用BioScaffolder 3.1挤出打印系统在无菌条件下室温进行3D打印。将墨水装入注射器筒中，并通过不同出口直径（200–840 µm）的锥形针头挤出。

2.3.1 长期释放实验的样品制备

使用840 µm针头、40–45 kPa的压力和8 mm s⁻¹的打印速度打印长度为5 mm的单根丝状样品。打印后，将样品在100 mM CaCl₂溶液中孵育10分钟，使藻酸盐链交联。

2.3.2 细丝融合和细丝塌陷测试

为了表征噬菌体负载墨水在打印过程中的形状保真度，对所有经过流变学表征的AlgMC组合物进行了细丝融合和细丝塌陷测试。使用410 µm针头和10 mm s⁻¹的打印速度进行测试，施加气压范围为70–80 kPa。打印三层由蛇形线连接的丝状结构，丝间距逐渐增加。使用立体光学显微镜对所得结构进行成像，并使用ImageJ测量丝宽、丝间距和融合段长度。将融合段长度（f_s）除以丝宽（f_d）得到形状保真度比率，其最佳值设为1。形状保真度比率与相应丝间距的相关性提供了在特定丝间距下的打印精度信息。对于细丝塌陷测试，将一股墨水沉积在模拟底层不同丝间距（1.0, 2.0, 4.0, 8.0, 和 16.0 mm）的聚乳酸基装置上。通过测量墨水桥接间隙的角度（水平线等于90°）来评估桥接质量，角度越接近90°，墨水桥接能力越好。

2.3.3 原理验证实验

使用410 µm针头、75–85 kPa的压力和10 mm s⁻¹的打印速度打印实体和多孔支架。实体支架设计半径为4 mm，高度为4.2 mm，打印23层，每层相对于前一层旋转90°，丝状沉积无间距。多孔支架使用与实体支架相同体积的墨水打印，半径为8 mm，高度为4.2 mm（23层），通过将丝状沉积间隔3.5 mm来创建大孔，每层相对于前一层旋转90°，形成网格状孔结构。打印后，将样品在100 mM CaCl₂溶液中孵育30分钟，包括在15分钟后在孔板内翻转支架以确保从所有侧面均匀交联。

2.4 抗菌活性

2.4.1 释放

将打印的样品在超纯水（Milli-Q）或人血浆类似培养基（HPLM）中于37°C孵育。在不更换释放溶液的实验中，将单丝样品孵育在5 mL溶液中，每天收集300 µL进行分析。在更换释放溶液的实验中，将单丝样品孵育在1 mL中，支架孵育在5 mL中；在不同孵育时间点，完全更换为新鲜培养基，并分析收集的洗脱液。

2.4.2 对浮游培养物的活性

通过生长曲线分析进行评估：将新鲜的金黄色葡萄球菌过夜培养物在LB培养基中调整至OD₆₀₀为0.4。将50 µL洗脱液加入100 µL该细菌悬浮液中，在37°C下监测这些培养物16小时内的OD₆₀₀（每10分钟测量一次）。16小时后，通过将5 µL培养物点样到填充有2%固体LB琼脂的12孔板中进行无菌性测试。在37°C过夜孵育后，检查是否有生长菌落，以确定与阳性对照（无菌或非无菌）相比的细菌存活情况。对于斑点噬菌斑测定，将100 µL OD₆₀₀为0.4的金黄色葡萄球菌LB培养物与3 mL温热的0.5% LB软琼脂混合，然后将混合物以每孔200 µL的量分装到已填充有2%固体LB琼脂（每孔1 mL）的12孔板中。琼脂聚合后，将5 µL释放溶液点样到LB软琼脂上，随后在37°C过夜孵育。对噬菌斑进行显微记录，并通过应用从0（无噬菌斑）到4（完全裂解）的评分进行半定量分析。

2.4.3 生物膜形成抑制试验

通过将100 µL上清液或对照与100 µL新鲜的金黄色葡萄球菌过夜LB培养物（OD₆₀₀为1）在37°C静态孵育48小时来测试释放的噬菌体抑制生物膜形成的潜力。然后，用ddH₂O清洗样品3次，通过每孔加入200 µL冰甲醇进行固定，并在室温下孵育10分钟。去除甲醇后，空气干燥样品，用0.1%结晶紫每孔200 µL在室温下染色5分钟，小心地用ddH₂O清洗3次，再次空气干燥。为了定量分析生物膜形成，通过每孔加入200 µL 33%乙酸进行结晶紫溶解，随后在室温下于450 rpm的轨道摇床上孵育15分钟，并测量570 nm处的吸光度。

2.5 pH测量

将冷冻的、在超纯水中孵育的样品的洗脱液在4°C下解冻过夜，在室温下平衡10分钟，并在测量前涡旋。使用Sentix Mic-D电极在含有上清液的1.5 mL管中测量pH值。

2.6 离子定量

使用电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）定量水孵育的AlgMC和AlgMC–Lap样品上清液中的钙、镁、钠、锂和硅离子含量。将0.5 mL上清液稀释10倍并用2%硝酸酸化。使用以下波长进行发射强度测量：315.887 nm（钙），279.078 nm（镁），330.237 nm（钠），670.791 nm（锂）和251.611 nm（硅）。

2.7 统计分析

除PFU评分外的所有数值均通过双向方差分析进行评估，然后进行Tukey多重比较检验。对于PFU评分（分类值）的统计分析，将数据转换为频率表，然后进行非参数Fisher精确检验。所有数据的统计分析均使用GraphPad Prism 10.2.3软件进行，显著性差异设定为p < 0.05。

3 结果

3.1 对浮游金黄色葡萄球菌培养物的活性

3.1.1 3D打印的藻酸盐基水凝胶释放活性噬菌体

比较了两种加载程序：i) 类似于制备细胞负载生物墨水，首先将AlgMC混合物粉末组分溶解在PBS中，然后在打印前立即以1:10的比例混合入噬菌体悬浮液（“AlgMC in PBS + phages”）；ii) 将粉末组分直接溶解在噬菌体悬浮液中，导致墨水中噬菌体量增加约10倍（“AlgMC in phage suspension”）。两种组合物均表现出优异的可打印性，与噬菌体浓度无关。

首次释放实验旨在回答基本问题：活性噬菌体是否从打印和交联的水凝胶中释放。将两种变体产生的单丝样品在水中孵育4天，不更换洗脱液。生长曲线分析显示，从“AlgMC in phage suspension”（墨水中约2 × 10⁹ PFU mL⁻¹）收集的释放溶液每天均显示出显著的抗菌活性。孵育时间越长，观察到细菌密度降低的开始时间越早，这可以归因于噬菌体随时间的积累（图S1A，支持信息）。对于从“AlgMC in PBS + phages”（墨水中约2 × 10⁸ PFU mL⁻¹）收集的释放溶液，检测到低得多的抗菌活性，表现为生长曲线下降显著延迟，这可能是由于负载的噬菌体量较低所致（图S1A，支持信息）。重复实验观察到类似差异（图S2，支持信息）。噬菌斑形成测定结果证实了这些观察结果：与“AlgMC in PBS + phages”组相比，“AlgMC in phage suspension”组可见更高密度的噬菌斑（表明细菌清除），并且随孵育时间增加（图S1B，支持信息）。

3.1.2 Laponite增强了在水中释放的噬菌体活性并延长了其递送时间

以相同方式加载含Laponite的墨水：i) 将噬菌体悬浮液混合到预先在PBS中制备的AlgMC–Lap混合物中（“AlgMC–Lap in PBS + phages”，含2 × 10⁸ PFU mL⁻¹）；或 ii) 将粉末组分直接溶解在噬菌体悬浮液中（“AlgMC–Lap in phage suspension”，含2 × 10⁹ PFU mL⁻¹）。所得的噬菌体负载墨水也可打印。

在打印和交联的单丝样品在水中孵育4天（不更换洗脱液）期间，从两种变体每天收集的释放溶液均显示出显著的抗菌活性，表现为生长曲线分析中细菌密度的降低以及噬菌斑的形成（图S1，支持信息）。再次观察到“AlgMC–Lap in phage suspension”的释放溶液活性高于“AlgMC–Lap in PBS + phages”组，尽管差异不那么明显。与其不含Laponite的对应物相比，“AlgMC–Lap in PBS + phages”显示出更高的活性（图S1，支持信息），表明Laponite支持的水凝胶在增强水中释放的噬菌体的抗菌效力方面具有优势，尤其是在负载噬菌体量较低时。重复实验证实了这些观察结果（图S2，支持信息）。

通过定期更换洗脱液，研究了“AlgMC versus AlgMC–Lap in phage suspension”在14天内的释放情况，以回答活性噬菌体从打印和交联的水凝胶中释放多长时间，以及Laponite的存在是否延长了递送时间。通过将粉末组分溶解在滴度分别为1 × 10⁹ 或 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的噬菌体悬浮液中来制备墨水。图1A显示了选定时间点的生长曲线，图1B显示了所有时间点16小时后的光密度（生长曲线终点测量）。虽然AlgMC的释放溶液仅在第一天显示出抗菌活性，并且仅在负载较高量噬菌体（1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹）时如此，但从AlgMC–Lap收集的释放溶液直到第7天（1 × 10⁹ PFU mL⁻¹组）和第10天（1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹组）仍能有效对抗金黄色葡萄球菌（关于材料效应的统计分析参见图S3，支持信息）。通过测试不含噬菌体负载的AlgMC和AlgMC–Lap样品，排除了生物材料本身的抗菌效应（图S4，支持信息）。生长曲线分析后，对培养物进行无菌斑点测定以检测任何存活的细菌。在所有引起生长曲线下降的释放溶液存在下，所有细菌均被裂解，表现为无生长菌落（图1C）。

噬菌斑形成通过PFU斑点测定法进行半定量测试；为了数据评估，定义了一个评分（图2A）。数据证实了生长曲线分析的结果：对于负载1 × 10⁹ 或 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的AlgMC，在第1天仅检测到无或孤立的噬菌斑（图2B）。对于AlgMC–Lap，在1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹组中检测到高分（3–4，表明融合噬菌斑或完全裂解区域），在1 × 10⁹ PFU mL⁻¹组中检测到中等分数（2，表明部分融合的噬菌斑）。在第7天，两组（1 × 10⁹ 和 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹）均检测到低分（1–2，表明单个/孤立噬菌斑），而在第10天和第14天，两组中几乎看不到噬菌斑。

3.1.3 活性噬菌体的释放强烈依赖于周围环境条件

同时，使用HPLM作为洗脱液进行释放实验，以模拟人体内的自然环境。与水相比，在HPLM中观察到活性噬菌体的释放时间更长，且活性普遍更高，但未观察到Laponite的积极作用。生长曲线分析显示，从AlgMC获得的释放溶液对金黄色葡萄球菌的活性持续到收集时间点第31天（1 × 10⁹ PFU mL⁻¹组）和第35天（1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹组）（图3A,B）。无菌斑点测定证实，释放的噬菌体活性足以裂解所有细菌，直到上述时间点，因为未观察到生长菌落（图3C）。来自两个AlgMC–Lap组（1 × 10⁹ 和 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹）的释放溶液显示出可靠的抗菌效果直到第24天。在第28天，一些样品释放的噬菌体活性不足，表现为生长曲线终点测量的高标准差以及无菌斑点测定中部分非无菌样品（图3B,C）。

PFU斑点测定揭示了释放溶液抗菌活性的浓度依赖性，表现为负载1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的组（AlgMC和AlgMC–Lap）比负载1 × 10⁹ PFU mL⁻¹的组评分更高（图2C）。此外，所有组的评分随时间降低：对于负载1 × 10⁹ PFU mL⁻¹的组，10天后评分在1和2之间（AlgMC–Lap）或降至2以下（AlgMC）。对于负载1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的组，在第14天（AlgMC–Lap）和第21天（AlgMC）检测到评分等于或低于2（图2C）。

3.1.4 Laponite稳定pH值并增加离子浓度

为了探索Laponite对水中孵育期间活性噬菌体释放产生积极影响的原因，测定了释放溶液中的pH值以及理论上可以从生物材料中释放的离子浓度。pH值受到水凝胶中Laponite存在的显著影响（图4）：在最初几天（第1–3天），AlgMC样品的上清液中测得的pH值约为6，而AlgMC–Lap上清液中的pH值约为8。随后，所有上清液中的pH值持续下降；在第14天，AlgMC和AlgMC–Lap的测量值分别约为5.5和7。负载噬菌体对AlgMC的pH没有影响，但在负载1 × 10⁹ PFU mL⁻¹的AlgMC–Lap组中观察到略微、不显著更高的值（图S5，支持信息）。

打印后，通过在水溶液中孵育使水凝胶中的藻酸盐链交联。一小部分交联钙离子在样品水孵育期间被释放（图5A）：在第1天，测量到浓度介于2.4和3.1 mmol L⁻¹之间（AlgMC组）以及2.7和4 mmol L⁻¹之间（AlgMC–Lap组）。第1天后，所有组中仅检测到微量钙离子，低于0.4 mmol L⁻¹。

从AlgMC–Lap样品中释放钠、镁、硅和锂离子表明Laponite发生了降解。钠离子仅在第一天从含Laponite和未负载的AlgMC样品中释放（图5B）。从含有Laponite的水凝胶中观察到镁离子的持续释放，其中负载1 × 10⁹ PFU mL⁻¹噬菌体的AlgMC–Lap组上清液中镁离子浓度最高，而负载1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的AlgMC–Lap组浓度最低（图5B）。从AlgMC–Lap样品中释放的硅离子在第1天范围为0.7–1.2 mmol L⁻¹，并随时间下降至第7天的0.1–0.6 mmol L⁻¹。锂离子仅在AlgMC–Lap样品的释放溶液中以非常低的浓度（低于0.05 mmol L⁻¹）被检测到。再次，负载1 × 10⁹ PFU mL⁻¹噬菌体的组比负载1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的组释放更多的硅和锂离子。正如预期，在从AlgMC样品获得的释放溶液中未检测到镁、硅和锂离子。

3.2 用噬菌体负载的AlgMC墨水打印3D结构

由于AlgMC衍生的水凝胶在活性噬菌体的长期释放方面显示出更有利的结果，因此更详细地分析了负载的噬菌体对打印性能的影响。

3.2.1 噬菌体悬浮液作为AlgMC墨水的溶剂影响其粘度

将含有1 × 10⁹ PFU mL⁻¹和1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹的AlgMC与不含噬菌体的AlgMC in TSB以及AlgMC in PBS进行流变学表征比较。所有打印材料均显示出有益的剪切稀化行为，而当溶剂PBS被TSB替代时，AlgMC墨水的粘度降低（图6A）。TSB中不同噬菌体浓度的存在倾向于进一步降低粘度，但两种噬菌体浓度之间没有显著差异。挤出过程中的质量流量受针头直径（如图S6所示，针对“AlgMC in TSB”墨水）以及粘度的影响。较低的粘度在挤出材料时可能导致更高的质量流量，进而影响其打印性能。然而，当所有材料组合物在100 kPa下通过相同内径（200, 410, 610 µm）的针头挤出30秒时，观察到相似的质量流量；质量流量随针头直径增加而增加（图6B）。

3.2.2 噬菌体悬浮液作为AlgMC墨水的组分轻微影响形状保真度

细丝塌陷和细丝融合测试是量化3D打印结构形状保真度的成熟方法，用于描述负载噬菌体（1 × 10⁹ 和 1 × 10¹¹ PFU mL⁻¹）的AlgMC的打印性能，并与不含噬菌体的AlgMC in TSB和AlgMC in PBS进行比较（图7）。降低的粘度增加了丝径，导致在小丝间距时丝发生融合（图7A）。因此，当使用TSB培养基或噬菌体悬浮液作为墨水组分打印丝间距低于1 mm的孔时，无法保持形状保真度。但是一旦丝间距增加（≥1 mm），f_s/f_d的比值显示出总体上较高的形状保真度，与材料组成无关（图7B）。另一方面，由TSB培养基或噬菌体悬浮液制备的AlgMC墨水的粘度降低，降低了其桥接能力，尤其是对于较高浓度的噬菌体（图7C）。溶解在PBS或TSB中的AlgMC在大多数情况下能够桥接16 mm的最大间隙。然而，添加噬菌体后没有发生桥接，而10¹¹ PFU mL⁻¹的浓度导致即使对于较小的间隙，桥接也更不可靠（图7D）。尽管形状保真度有所降低，噬菌体负载的AlgMC墨水仍可用于可靠地3D打印预先设计的结构（图7E）。

3.2.3 原理验证：根据预定设计打印噬菌体负载结构

将负载1 × 10⁶ 和